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T cells directed against brain antigens are generally held to play a crucial role in the initiation of multiple sclerosis (MS). This was deduced from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). In this model for MS, T cells reactive for myelin antigens induced a severe paralytic disease upon transfer to healthy syngeneic recipients. Intriguingly, the disease does not start immediately upon transfer of the pathogenic effector T cells. Instead, as earlier studies have shown, the effector T cells attack their target organ only after having migrated in the periphery through secondary lymphoid organs. The aim of the project was to characterize the functional properties of these migrating encephalitogenic T cells during the course of EAE and to identify biological pathways which determine their migratory behaviour and pathogenic potential. To this end, average linkage hierarchical clustering, pathway and gene ontology (GO) analyses of transcriptomes from cultured and ex vivo-isolated myelin basic protein-reactive T cells (TMBP cells) were performed. At the time of transfer, encephalitogenic T cells in vitro are maximally activated, i.e. they exhibit a prominent upregulation of cell cycle genes such as cyclin A2 (CCNA2) and cyclin B2 (CCNB2) among others. In contrast, T cells isolated from spleen 3 days post transfer, downregulated activation markers such as interleukin 2 receptor (IL2R) and interferon γ (IFNγ), and at the same time upregulated migration specific genes such as CC-chemokine receptor 1 (CCR1), CC-chemokine receptor 2 (CCR2) and CC-chemokine receptor 5 (CCR5). Hierarchical cluster analysis revealed that several transcription regulators known for inhibiting cell cycle progression such as krüppel-like factor 4 (KLF4), B-cell translocation gene 2 (BTG2) and transducer of ERBB2, 1 (TOB1) were clustered together with cell cycle and migration genes. Overexpression of KLF4 in T cells not only inhibited G1/S phase progression of the cell cycle but additionally induced upregulation of CCR2 and CCR5. A novel tetraspan membrane protein called epithelial membrane protein (EMP1), was found to be up regulated in ex vivo-isolated effector T cells. Overexpression of EMP1 in encephalitogenic T cells influenced the migratory behaviour of effector T cells both in vitro and in vivo. EMP1 enhanced T cell motility within the extracellular matrix milieu in vitro and promoted T cell migration from the connective tissue to lymph nodes in vivo resulting in an accelerated onset of EAE. In conclusion, gene expression profiling of encephalitogenic T cells revealed interesting genome wide transcriptomic changes and established a correlation between cell cycle progression and cell migration. As a result, in silico analysis put forth several interesting candidate genes that hold promise as potential targets for therapeutic intervention.

Die direkte Rekrutierung von Effektor-Leukozyten aus dem peripheren Blut in interstitielle Gewebe wird in Teilen von chemotaktischen Zytokinen (Chemokinen) und ihren Rezeptoren kontrolliert. Diesen Schritt zu blockieren stellt ein wichtiges Instrument der Kontrolle einer Entzündungsreaktion dar. Das proinflammatorische Chemokin CCL5/RANTES ist ein chemotaktisches Agens das über die CCR1-, CCR3- und CCR5-Rezeptoren von „Gedächtnis“-CD4+ T-Zellen, Monozyten und Eosinophile wirkt. Es wird von vielen Gewebetypen im Laufe einer Entzündungsreaktion produziert. Die CCR1- und CCR5-Aktivierung konnte als wichtiger Faktor für die Entstehung von akuten Abstoßungsreaktionen mittels in-vitro und in-vivo Experimenten identifiziert werden. Durch metRANTES, dem um ein Methionin verlängerten CCL5-Protein welches einen potenten CCR1 und CCR5 Rezeptor-Antagonisten darstellt, konnte eine Abstoßungsreaktion effektiv reduziert und in Kombination mit anderen Substanzen fast völlig unterdrückt werden. Weitere Modifizierungen am metRANTES-Protein verändern die für CCL5 charakteristische Multimerisierung und seine GAG-Bindungskapazität. Das „protein engineering“ genannte Verbinden eines Proteins mit einem GPI-Anker bietet die Möglichkeit, durch Reintegration in die Oberflächenmembranen unterschiedlicher Gewebe, Proteine an definierte Lokalisationen zu bringen. Dort können sie, dank der Fähigkeit, sich in die Membranen anderer Zellen wieder einzufügen und die ursprüngliche Funktion wieder anzunehmen (Premkumar, Fukuoka et al. 2001; Djafarzadeh, Mojaat et al. 2004), längere Zeit als soluble Chemokine verbleiben. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche CCL5-Analoga, sowie ein virales Chemokin-Analogon, um eine GPI-kodierende Sequenz erweitert und in einen Expressionsvektor subkloniert. Mittels Transformation wurden sie in Chinese Hamster Ovarial-Zellen (CHO-Zellen) exprimiert. Ihre Expression an der Zelloberfläche konnte dank der FACS-Analyse ermittelt werden und in einem gleichen Schritt wurde die Fähigkeit verschiedener anti-RANTES Antikörper, an die N-terminal veränderten Proteine zu binden, analysiert. Diese membranverankerten Proteine wurden in höchstmöglicher Konzentration aus der Einheitsmembran extrahiert und in einem weiteren Schritt durch unterschiedliche Chromatographieverfahren isoliert. Dabei wurde die Heparin-Chromatographie gefolgt von einer Size-exclusion Chromatographie als Methode mit der besten Reinheit und Ausbeute identifiziert. Zuletzt wurden die gereinigten, GPI-verbundenen CCL5-Analoga mit „einfachen“ CHO-Zellen, sowie humanen mikrovaskulären Endothelzellen inkubiert und ihre Reintegration an der Zelloberfläche bewiesen. Die in dieser Arbeit hergestellten GPI-gebundenen RANTES-Antagonisten eröffnen die Möglichkeit, in weiteren in-vitro, sowie in-vivo Versuchen, die biologische Aktivität dieses Chemokins gezielt zu blockieren oder (in einem analogen Verfahren) zu verstärken. Dadurch kann die Bedeutung des RANTES-Proteins in der Transplantatabstoßung, sowie in weiteren Entzündungsreaktionen herausgearbeitet werden. Durch Perfusion des Organs vor der Transplantation mit dem GPI-verbudenen Chemokin-basierenden Antagonisten, erhofft man sich die Integration des GPI-Ankers in die mikrovaskuläre Endothelialzellmembran und somit die Präsentation des Antagonisten für die zirkulierenden Leukozyten. Ein solches Vorgehen könnte dem Gefäßsystem während der kritischen ersten Tage nach der Transplantation Schutz bieten und somit signifikant die akute vaskuläre Verletzung, die mit einer Verschlechterung der Überlebensprognose verbunden ist, vermindern (Notohamiprodjo, Djafarzadeh et al. 2005).

Die Eigenschaft von Leukozyten, das Gefäßsystem zu verlassen und in das umliegende Gewebe auszuwandern, ist von essentieller Bedeutung für die Bekämpfung von Infektionen und darüber hinaus entscheidend für die Pathogenese des I/R-Schadens. Die Extravasation von Leukozyten stellt dabei einen kaskadenartig verlaufenden Prozess dar, welcher sich in die Schritte Rolling, Adhärenz, transendotheliale und interstitielle Migration gliedern lässt. Ein geeignetes Versuchsmodell, welches am M. cremaster der Maus in vivo alle Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses während I/R zu analysieren erlaubt, liegt bisher nicht vor. Während die frühen Schritte des leukozytären Extravasationsprozesses weitgehend aufgeklärt sind, sind die Schritte der transendothelialen und interstitiellen Migration von Leukozyten unzureichend verstanden. In vitro Untersuchungen zeigen, dass das Molekül JAM-A in die Transmigration von Leukozyten involviert ist, jüngste in vivo Studien zeigen jedoch kontroverse Ergebnisse. Ferner gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass die Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 an der Extravasation von Leukozyten beteiligt sind. Welche Bedeutung diese Chemokinrezeptoren für die einzelnen Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei Entzündung und I/R besitzen, ist bislang unklar. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher i) ein geeignetes Modell zur Untersuchung aller Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei I/R am M. cremaster der Maus zu entwickeln, ii) die Bedeutung des Adhäsionsmoleküls JAM-A für die Transmigration von Leukozyten zu untersuchen und iii) die Rolle der Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 für die einzelnen Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei Entzündung und I/R zu analysieren. In unterschiedlichen Versuchsansätzen wurde mit Hilfe der RLOT-Intravitalmikroskopie am M. cremaster anästhesierter Mäuse die leukozytären Migrationsparameter untersucht. Zur Bestimmung des Phänotyps transmigrierter Leukozyten wurden immunhistochemische Färbungen von Paraffinschnitten durchgeführt. In einer ersten Versuchsreihe wurden die einzelnen Schritte des leukozytären Extravasations-prozesses systematisch in Abhängigkeit von Ischämiedauer und Reperfusionszeit untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es bereits nach 30 min Ischämie und 120 min Reperfusion gegenüber schein-operierten Kontrolltieren zu einem starken Anstieg von Leukozyten-adhärenz und -transmigration kommt. Eine Verlängerung der Ischämiezeit auf 60 bzw. 90 min konnte keine Steigerung der Effekte erzielen. Diese Befunde waren der Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen, welche die Mechanismen des leukozytären Rekrutierungs-prozesses näher charakterisieren sollen. In diesem Zusammenhang wurde in einer zweiten Versuchsreihe unter Verwendung von JAM-A-defizienten Mäusen die Bedeutung des Adhäsionsmoleküls JAM-A für die Leukozytenrekrutierung systematisch unter verschiedenen inflammatorischen Bedingungen analysiert. Unsere Daten belegen, dass die transendotheliale Migration von neutrophilen Granulozyten und Monozyten einer Stimulus-spezifischen Regulation durch JAM-A unterliegt. Ferner lassen die Ergebnisse unserer Untersuchungen in eJAM-A-defizienten Tieren darauf schließen, dass endotheliales JAM-A die Transmigration von neutrophilen Granulozyten und Monozyten zwar in der Initialphase entzündlicher Prozesse vermittelt, zu späteren Zeitpunkten jedoch keine Bedeutung mehr zu besitzen scheint. Schließlich deuten unsere Befunde darauf hin, dass leukozytäres JAM-A an den der interstitiellen Leukozytenmigration zugrunde liegenden Mechanismen beteiligt ist. In einer letzten Versuchsreihe wurde die Rolle der Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 für die Rekrutierung von Leukozyten bei Chemokin-induzierter Entzündung und I/R untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Chemokinrezeptoren die Extravasation von neutrophilen Granulozyten und Monozyten bei Chemokin-induzierter Entzündung durch Effekte auf Adhärenz und (konsekutive) transendotheliale Migration mediieren und keinen Einfluss auf das interstitielle Migrationsverhalten transmigrierter Leukozyten besitzen. Des Weiteren ist es mittels durchflusszytometrischer Analyse gelungen, die Expression von Ccr2 und Ccr5 auf nativen neutrophilen Granulozyten nachzuweisen. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass die Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 zur Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten in das postischämische Gewebe durch dynamische bzw. differentielle Regulation von Adhärenz und (konsekutiver) Transmigration beitragen.

The global burden of chronic kidney diseases remains an ongoing medical challenge. Therapies that can halt or reverse advanced renal injury are not yet available. Increasing numbers of patients progress to the end-stage renal failure and require renal replacement therapy, the latter being associated with significant mortality, a lower quality of life, and high costs for national health systems. Thus, new treatment strategies that slow down, halt or even revert progressive renal damage are requested. Chemokines and their receptors are involved in the pathogenesis of renal diseases. They mediate leukocytes and macrophages recruitment and activation during initiation as well as progression of renal inflammation. Infiltrating leukocytes are the major source for proinflammatory and profibrotic cytokines and are therefore critical for mediating fibroblast proliferation, differentiation into myofibroblasts, matrix production, and tubular atrophy. Recent advances in the understanding of the molecular mechanisms that regulate renal leukocyte recruitment suggest chemokines and chemokine receptors as novel targets for specific pharmacological intervention. The aim of the present thesis was to investigate the role of chemokine receptor CCR1 for the progression of chronic kidney diseases, e.g. Alport disease and diabetic nephropathy. Two different animal models were used: Col4A3-deficient mice and type 2 diabetic db/db mice with advanced diabetic nephropathy. We blocked CCR1 in Col4A3-deficient mice with BX417, a small molecule CCR1 antagonist, and BL5923, a novel orally available antagonist with a high specificity for human and murine CCR1 in uninephrectomized type 2 diabetic db/db mice, respectively. Treatment with BX471 (25mg/kg) from weeks 6 to 10 of life improved survival of COL4A3- deficient mice, characterized by glomerulosclerosis and subsequent progressive tubulointerstitial injury, leading to fatal end-stage renal disease (ESRD). Improvement was associated with less interstitial macrophages, apoptotic tubular epithelial cells, tubular atrophy, interstitial fibrosis, and less globally sclerotic glomeruli. BX471 reduced total renal Ccl5 mRNA expression by reducing the number of interstitial CCL5-positive cells in inflammatory cell infiltrates. Intravital microscopy of the cremaster muscle in male mice identified that BX471 or lack of CCR1 impaired leukocyte adhesion to activated vascular endothelium and transendothelial leukocyte migration, whereas leukocyte rolling and interstitial migration were not affected. Furthermore, in activated murine macrophages, BX471 completely blocked CCL3-induced CCL5 production. When CCR1 was blocked with BL5923 (60mg/kg, b.i.d), the interstitial recruitment of ex vivo labeled macrophages was markedly decreased in uninephrectomized male db/db mice with type 2 diabetes. Similarly, BL5923 orally administered from month 5 to 6 of life reduced the numbers of interstitial macrophages in uninephrectomized db/db mice. This was associated with reduced numbers of Ki-67 proliferating tubular epithelial and interstitial cells, tubular atrophy, and interstitial fibrosis in uninephrectomized db/db mice. Glomerular pathology and proteinuria were not affected by the CCR1 antagonist. BL5923 reduced renal mRNA expression of Ccl2, Ccr1, Ccr2, Ccr5, Tgf-β1, and collagen I-α1 when compared to untreated uninephrectomized male db/db mice of the same age. Thus, we identified a previously unrecognized role for CCR1-dependent recruitment of interstitial macrophages for the progression of chronic kidney disease in Alport disease and diabetic nephropathy. These data identify CCR1 as a potential therapeutic target for Alport disease and late stage diabetic nephropathy or other progressive nephropathies associated with interstitial macrophage infiltrates.

Background: Osteosarcoma is the most frequent bone tumor in childhood and adolescence. Patients with primary metastatic disease have a poor prognosis. It is therefore important to better characterize the biology of this tumor to define new prognostic markers or therapeutic targets for tailored therapy. Chemokines and their receptors have been shown to be involved in the development and progression of malignant tumors. They are thought to be active participants in the biology of osteosarcoma. The function of specific chemokines and their receptors is strongly associated with the biological context and microenvironment of their expression. In this report we characterized the expression of a series of chemokine receptors in the complex environment that defines osteosarcoma. Methods: The overall level of chemokine receptor mRNA expression was determined using TaqMan RT-PCR of microdissected archival patient biopsy samples. Expression was then verified at the protein level by immunohistochemistry using a series of receptor specific antibody reagents to elucidate the cellular association of expression. Results: Expression at the RNA level was found for most of the tested receptors. CCR1 expression was found on infiltrating mononuclear and polynuclear giant cells in the tumor. Cells associated with the lining of intratumoral vessels were shown to express CCR4. Infiltrating mononuclear cells and tumor cells both showed expression of the receptor CCR5, while CCR7 was predominantly expressed by the mononuclear infiltrate. CCR10 was only very rarely detected in few scattered infiltrating cells. Conclusion: Our data elucidate for the first time the cellular context of chemokine receptor expression in osteosarcoma. This is an important issue for better understanding potential chemokine/chemokine receptor function in the complex biologic processes that underlie the development and progression of osteosarcoma. Our data support the suggested involvement of chemokines and their receptors in diverse aspects of the biology of osteosarcoma, but also contradict aspects of previous reports describing the expression of these receptors in this tumor.

This study aimed to evaluate whether a late blockade of the chemokine receptor 1 (CCR1) (i.e. blockade began after establishment of a progressive renal disease) with its low molecular weight antagonist BX471, could alleviate renal damage in MRL lpr mice, through reducing leukocyte recruitment to the kidney. Immunhistological evaluation and cell transfer studies showed that BX471 could reduce the number of infiltrating leukocytes into the renal interstitium. This was followed by a reduction of interstitial fibrosis and improvement of renal function. Glomerular disease was histologically (leukocyte infiltration and immune complex deposition) and clinicaly (proteinuria) unchanged after BX471 treatment. There was also no Th1 or Th2 shift. Consequently, CCR1 blockade, began in the progressive phase of the lupusnephritis of MRL lpr mice, improves renal function through selectively alleviating interstitial inflammation. CCR1 antagonists could therefore offer new therapeutic alternatives for advanced immunecomplex glomerulonephritis but also for other progressive renal diseases.

Background. Immigration of leukocytes into inflamed tissue is mediated by CC chemokines. Blockade of the CC chemokine receptor CCR1 was shown to reduce interstitial inflammation and fibrosis in murine obstructive nephropathy. However, it is not known whether CCR1 blockade is protective in progressive renal injury associated with severe proteinuria. This study therefore examines the effect of the small-molecule CCR1 antagonist BX471 in a mur-ine model of adriamycin-induced focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) with nephrotic syndrome and progressive interstitial inflammation and fibrosis. Methods. Adriamycin (ADR) nephropathy with persistent proteinuria was induced in male BALB/c mice by two intravenous injections of ADR (13 mg/kg) at day 0 and 14. BX471 treatment was started at day 14 when proteinuria had developed. At 6 weeks, renal histology was studied by morphometry and immunohistochemistry. The expression of chemokines was localised by immunohistochemistry and quantified by RNAse protection assays. The expres-sion of CCR1 in different leukocyte subsets was quantified by PCR. Results. At week 6, ADR-treated mice showed focal segmental glomerular sclerosis, associ-ated with tubulointerstitial injury consisting of tubular dilation and atrophy, interstitial leuko-cyte infiltration and fibrosis. The mRNA expression of CCR1 and CC chemokines, including the CCR1 ligands CCL3/MIP-1 and CCL5/RANTES, was upregulated in diseased kidneys, with a prominent intersitial expression of CCL5/RANTES. The mayor CCR1-expressing cell subset were F4/80-positive macrophages. Compared to vehicle-treated controls BX471 sig-nificantly reduced the amount of macrophages and T lymphocytes in interstitial lesions by 51 % and 22 %, respectively. Markers of renal fibrosis such as interstitial fibroblasts (48 %) and interstitial volume (23 %) were significantly reduced by BX471 treatment. In contrast, the extent of proteinuria and glomerular sclerosis was not affected by BX471 treatment. Conclusion. Blockade of CCR1 substantially reduced interstitial leukocyte accumulation and the subsequent renal fibrosis in a murine model of nephrotic syndrome and FSGS. These find-ings support a role for CCR1 in interstitial leukocyte recruitment and suggest that CCR1 blockade might be a new therapeutic strategy in progressive nephropathies such as FSGS.

Infiltrating leukocytes are thought to contribute to the progression of kidney disease. Locally produced chemokines guide circulating leukocytes into the kidney, which renders therapeutic blockade of respective chemokine receptors on the leukocyte surface as potential targets for the inhibition of renal leukocyte recruitment. By using mutant mice and specific antagonists, we found that chemokine receptor CCR1 has non-redundant functions for leukocyte adhesion to activated vascular endothelium and for transendothelial diapedesis. Most importantly, CCR1 blockade with a specific small molecule antagonist can improve injury in several types of progressive kidney disease models, even if treatment is initiated in advanced disease states. Identification of new targets may add to the therapeutic options in chronic kidney disease. Copyright (C) 2005 S. Karger AG, Basel.