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Adulte Weichgewebesarkome (engl. soft tissue sarcoma; STS) werden zu einer Gruppe seltener maligner und teilweise aggressiver Tumoren klassifiziert, die eine Tendenz zur Bildung von hämatogenen Fernmetastasen aufweisen. Die Kombination der Regionalen Hyperthermie mit einer Chemotherapie erwies sich in vorangegangenen Studien als eine vielversprechende Behandlungsoption beim lokalisierten Hochrisiko STS. Es wurde gezeigt, dass eine neoadjuvante Chemotherapie mit Regionaler Hyperthermie bei diesen Sarkomen das Tumoransprechen, das lokale progressionsfreie und das krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu einer alleinigen Chemotherapie signifikant verbessert. Auf zellulärer Ebene induziert ein Hitzeschock (HS) bei klinisch relevanten Temperaturen (41,8°C/43°C) unter anderem eine temporäre Defizienz der Homologen Rekombinationsreparatur (HR), einem essentiellen Mechanismus für die fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB). Dies steht im Zusammenhang mit einer hitzeinduzierten proteosomalen Degradierung von BRCA2, einer unerlässlichen Komponente der HR. Trabectedin (Tr) ist eine antiproliferativ wirksame Substanz, die ursprünglich aus dem marinen Tunikat Ecteinascidia turbinata isoliert wurde. Die vielfältigen zytotoxischen Aktivitäten von Tr umfassen neben dem Interferieren mit der aktivierten Transkription und der Modulation der Tumor-Mikroumgebung hauptsächlich die Induktion von DSBs. Seit 2007 wird Tr in der Zweitlinientherapie zur Behandlung refraktärer STS, sowie bei Patienten eingesetzt, bei denen die Erstlinientherapie (Ifosfamid und/oder Doxorubicin) nicht angewendet werden kann. In Anbetracht der hitzeinduzierten Inaktivierung von BRCA2 und den DNA schädigenden Eigenschaften von Tr wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie die Hyperthermie zu einer Wirkungsverstärkung der zytotoxischen Effekte von Tr beitragen kann. Tr bewirkt in vitro bei Zelllinien unterschiedlicher Sarkomentitäten (U2Os, SW872, SW982) eine dosisabhängige Reduktion des klonogenen Überlebens, das durch einen HS zusätzlich verstärkt wird. Die erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem HS wird als thermale Chemosenitivierung definiert. Zudem konnte durch die Analyse der DNA-Verteilung bei U2Os und SW872 Zellen eine Intensivierung und Verlängerung der Tr-induzierten G2/M-Blockade nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden Zelllinien-spezifische Unterschiede bezüglich einer behandlungsinduzierten Apoptoseinduktion oder Senseszenzantwort identifiziert. SW872 Zellen weisen einen dosis- und temperaturabhängigen Anstieg des Anteiles apoptotischer Zellen auf, der mit einer starken Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7 einhergeht. Dem entgegen gehen U2Os Zellen in eine ausgeprägte behandlungsinduzierte zelluläre Seneszenz über. Anhand der quantitativen Analyse Tr-induzierter H2AX Foci hat sich ein relevanter Anstieg an DSBs durch eine zusätzliche Hitzeexposition herausgestellt, der eine Beeinträchtigung der BRCA2-vermittelten vollständigen Assemblierung der DNA-Reparaturfoci vermuten lässt. Die Hypothese einer thermalen Chemosensitivierung gegenüber Tr durch eine hitzeinduzierte HR-Defizienz – insbesondere im Rahmen der hitzeinduzierten BRCA2 Degradierung – wurde zudem durch das Ausbleiben der hitzebedingten Verstärkung der Tr-induzierten Zytotoxizität bei BRCA2-defizienten Zellen bekräftigt. Darüber hinaus wurde durch Hochdurchsatzanalysen bestätigt, dass eine hitzevermittelte, erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem Knockdown zahlreicher HR-spezifischer Komponenten ausbleibt. Durch Hochdurchsatzanalysen sowie durch anschließende Validierungsexperimente wurden Proteine identifiziert, die sich als relevant für weitere präklinische und klinische Untersuchungen herausgestellt haben. Die Proteine BRCA1, PARP1 und CHEK1 stellen dabei potentielle molekulare Marker für ein Tumoransprechen auf die Kombinationstherapie von Tr und Hyperthermie dar. Deren Inhibition erwies sich zudem als eine weitere Strategie, um die Effektivität der ursprünglichen Behandlung zusätzlich zu erhöhen. Darüber hinaus wurde die Funktion von FANCD2 als prädiktiver Marker und von ERCC1 als Resistenzmarker für das Therapieansprechen einer alleinigen Tr-Behandlung in vitro bestätigt. Die herausgearbeitete thermale Chemosensitivierung gegenüber Tr mit Hyperthermie durch die induzierte HR-Defizienz mittels passagerer BRCA2 Degradierung (induzierte synthetische Letalität) sowie die Identifizierung weiterer Proteine, deren medikamentöse Inhibition die Effektivität der Kombinationsbehandlung zusätzlich erhöhen könnte, eröffnen neue Möglichkeiten in der Therapie solider Tumoren.

Der Erhalt der genomischen Integrität ist für das Überleben von Organismen notwendig, jedoch können verschiedene DNA-Läsionen das genetische Material gefährden. DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) stellen dabei eine besonders toxische DNA-Läsion dar, und schon ein einzelner DSB kann bei ausbleibender oder fehlerhafter Reparatur zum Absterben der Zelle führen. In höheren Eukaryonten gibt es zwei Mechanismen für die Reparatur eines DSB: nicht-homologe Endverknüpfung und homologe Rekombination. Bei der homologen Rekombination spielt der Rekombinationsfaktor Rad52 eine zentrale Rolle und wurde zu Beginn dieser Arbeit als ein Substrat für eine posttranslationale Modifikation mit SUMO identifiziert. Daraufhin wurde die Regulation von Rad52 durch die Modifikation mit SUMO untersucht. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die SUMOylierung von Rad52 in Saccharomyces cerevisiae hauptsächlich an zwei nicht konservierten Lysinresten außerhalb der hoch konservierten Rad52-Domäne erfolgt und eng an Rekombinations- und DNA-Reparaturereignisse gekoppelt ist. So wird die Rad52-SUMOylierung durch enzymatische DSB während der Meiose und durch chemisch induzierte DSB in mitotischen Zellen ausgelöst. Hierfür ist der MRX-Komplex (bestehend aus Mre11, Rad50 und Xrs2) notwendig, der vor Rad52 im Rekombinationsprozess aktiv ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass Zellen mit einer Rad52-Mutante, die nicht mehr mit SUMO modifiziert werden kann, keine auffälligen Wachstumsdefekte aufweisen, beispielsweise weder in Gegenwart DNA-schädigender Agenzien noch in der Meiose. Allerdings hat die SUMOylierung einen pro-rekombinatorischen Einfluss auf Rad52. Denn zum einen können Zellen, in denen zwei der Helikasen Rrm3, Sgs1 oder Srs2 deletiert sind, in Gegenwart von SUMOylierungsdefizientem Rad52 wachsen, da vermutlich keine toxischen Rekombinationsintermediate mehr entstehen wie in Gegenwart von Wildtyp Rad52. Zum anderen weisen Zellen mit SUMOylierungsdefizientem Rad52 Defekte bei speziellen Rekombinationsreaktionen auf. Die SUMOylierung schützt Rad52 zudem vor dem Abbau durch das Proteasom und ist besonders für die Rad52-Moleküle relevant, die am Rekombinationsgeschehen beteiligt sind. Diese Arbeit zeigt somit, dass die SUMOylierung von Rad52 die Aktivität des Rekombinationsfaktors dadurch reguliert, dass die im Rekombinationsprozess involvierten Rad52-Moleküle vor einem vorzeitigen Abbau geschützt werden.

Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) gehört zur Gruppe der humanen, vererbbaren Chromosomeninstabilitätssyndromen mit einem pleiotrophen Phänotyp. Betroffene Personen sind homozygot für eine Mutation im NBS1 Gen, die zu einem Ausfall der Bildung eines funktionellen Genproduktes führt. NBS Patienten reagieren u. a. empfindlicher auf ionisierende Bestrahlung, sind immundefizient und entwickeln mit erhöhter Wahrscheinlichkeit maligne Erkrankungen. Durch die vergleichende Analyse von zwei Zellpaaren mit NBS1-/- lymphoblastoiden Zelllinien und ihren entsprechenden NBS1+/- Linien, die aus Zellen von blutsverwandten Personen generiert wurden, wurden mögliche Ursachen für den auf zellulärer Ebene gut charakterisierten Phänotyp der erhöhten Strahlensensitivität der NBS1-/- Linien untersucht. Die Analyse einer möglichen differentiellen Genexpression in diesen Zelllinien mittels DNA Microarraytechnologie ergab nur ein signifikant minderexprimiertes Gen in den NBS1-/- Linien beider Zellpaare: LCK. Dieses Gen ist an der positiven Regulation der strahleninduzierten Apoptose in B- und T-Zellen beteiligt, weshalb die Rolle von NBS1 für die Regulation der strahleninduzierte Apoptose untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass NBS1-/- Zellen verglichen mit den entsprechenden NBS1+/- Zellen eine erhöhte Induktion von Apoptose nach gamma-Bestrahlung aufweisen. Die Analyse des Apoptoseweges demonstrierte die negative Regulation des CD95 vermittelten Weges durch NBS1. Die erhöhte strahleninduzierte Apoptose ist eine gute Erklärungsmöglichkeit für die beschriebene erhöhte Strahlensensitivität von NBS Zellen, da die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSB) von der NBS1 Mutation nicht beeinträchtigt wird und somit keine Erklärung für diesen Phänotyp bietet. Möglicherweise beeinflusst NBS1 aber die Regulation der beiden DSB Reparaturwege homologe Rekombination oder nicht-homologe Endverknüpfung. Um zukünftig das Ausmaß der Verwendung dieser beiden Reparaturwege in NBS1 defizienten Zellen studieren zu können, wurde ein Vektorsystem entwickelt, das die Quantifizierung der Verwendung dieser DSB Reparaturwege durch Analyse von Fluoreszenzmarken nach sequenzspezifischer Induktion von DSB in vivo ermöglicht. Neben der Rolle von LCK in der Regulation der Apoptose ist LCK als T-zellspezifisches Protein insbesondere an der T-Zellaktivierung beteiligt. Deshalb wurde die Rolle von NBS1 für die Regulation der LCK Expression in einer T-Zelllinie untersucht (Jurkat), um so möglicherweise eine weitere Ursache für die Immundefizienz der NBS Patienten beschreiben zu können. Allerdings ist die LCK Expression in diesen Zellen unabhängig von NBS1.

Während der T-Zell-abhängigen Immunantwort bilden die aktivierten B-Lymphozyten das Keimzentrum, in dem Klassenwechselrekombination und somatische Hypermutation stattfinden. Der Mechanismus dieser Prozesse ist besonders im Falle der somatischen Hypermutation noch weitgehend unbekannt. Als essentieller Faktor konnte bisher die Aktivierungsinduzierte Cytidindeaminase AID identifiziert werden, die über Läsionen Mutationen und eventuell auch DNA-Doppelstrangbrüche in die DNA einführen kann. Da DNA-Brüche für die Zelle potentiell gefährlich sind, ist eine sehr stringente Regulation der DNA-Reparatur besonders in B-Zellen notwendig, denn eine fehlgeleitete Reparatur in B-Zellen kann zur Tumorentstehung beitragen. Prinzipiell haben die Zellen zwei Möglichkeiten DNA-Doppelstrangbrüche zu reparieren: die nicht homologen Endverknüpfung und die homologe Rekombination. Letztere unterteilt sich in die fehlerfreie konservative und die potentiell aberrante nicht konservative Rekombination. In dieser Arbeit wurde die Regulation und Aktivität der Doppelstrangbruchreparatur, im Besonderen der homologen Rekombination, in B-Zellen untersucht. Diese Analysen sollten Aufschluss über eine mögliche Beteiligung dieses Prozesses an der somatischen Hypermutation geben und ergründen, wie B-Zellen auf die AID-abhängigen DNA-Läsionen reagieren. Eine Analyse der Expression von Doppelstrangbruchreparaturfaktoren in primären B-Zellen und B-Lymphomzelllinien ergab eine erhöhte Expression dieser Faktoren in Keimzentrums-B-Zellen, die unter Anderem auf eine proliferationsgekoppelten Regulation der Reparaturgene zurückzuführen ist. Auffällig war besonders die differentielle Expression des Rekombinationsfaktors Rad51 in den Zelllinien. Die Bestimmung der Aktivität der homologen Rekombination in diesen Zellen mit Hilfe eines extrachromosomalen Reporters, der auf zwei hintereinander liegenden nicht funktionellen GFP-Genen basiert, zeigte eine Hyperrekombinationsaktivität für einige Zelllinien. In einem Tetracyclin regulierbaren System konnte transkriptionsgekoppelte Hyperrekombination gezeigt werden, die mit AID-Expressionsmengen korreliert. Es handelt sich dabei um fast ausschließlich nicht konservative Rekombination. Eine Nutzung der konservativen Rekombination konnte mit Rad51-Expressionsmengen korreliert werden. Eine Überexpression von AID bewirkte eine Erhöhung der Rekombinations- und der Hypermutationsaktivität. Folglich führt AID wahrscheinlich eine erhöhte Anzahl von Brüchen in die DNA ein, während Rad51 Einfluss auf die Wahl des Rekombinationsweges nehmen kann. In den reparierten GFP-Genen konnten keine Mutationen gefunden werden. Somit ist die Rekombinationsaktivität wohl eher eine Folge der AID-induzierten Brüche, als ein an der somatischen Hypermutation direkt beteiligter Weg. Die präferentielle Nutzung nicht konservativer Rekombination in den B-Lymphomzelllinien weist auf mögliche Folgen oder auch Ursachen der Lymphomentstehung hin oder ist eine von den Keimzentrumsprozessen geforderte physiologische Bedingung in Keimzentrums-B-Zellen, um einen Beitrag zur Antikörper-Diversifizieung zu leisten. Diese Fragen könnten durch weitere Untersuchungen geklärt werden, die die Rolle von AID in der Induktion der Rekombination betreffen und den Einfluss von Rad51 auf die Rekombinationswege.