Podcasts about apoptoseinduktion

Adulte Weichgewebesarkome (engl. soft tissue sarcoma; STS) werden zu einer Gruppe seltener maligner und teilweise aggressiver Tumoren klassifiziert, die eine Tendenz zur Bildung von hämatogenen Fernmetastasen aufweisen. Die Kombination der Regionalen Hyperthermie mit einer Chemotherapie erwies sich in vorangegangenen Studien als eine vielversprechende Behandlungsoption beim lokalisierten Hochrisiko STS. Es wurde gezeigt, dass eine neoadjuvante Chemotherapie mit Regionaler Hyperthermie bei diesen Sarkomen das Tumoransprechen, das lokale progressionsfreie und das krankheitsfreie Überleben im Vergleich zu einer alleinigen Chemotherapie signifikant verbessert. Auf zellulärer Ebene induziert ein Hitzeschock (HS) bei klinisch relevanten Temperaturen (41,8°C/43°C) unter anderem eine temporäre Defizienz der Homologen Rekombinationsreparatur (HR), einem essentiellen Mechanismus für die fehlerfreie Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB). Dies steht im Zusammenhang mit einer hitzeinduzierten proteosomalen Degradierung von BRCA2, einer unerlässlichen Komponente der HR. Trabectedin (Tr) ist eine antiproliferativ wirksame Substanz, die ursprünglich aus dem marinen Tunikat Ecteinascidia turbinata isoliert wurde. Die vielfältigen zytotoxischen Aktivitäten von Tr umfassen neben dem Interferieren mit der aktivierten Transkription und der Modulation der Tumor-Mikroumgebung hauptsächlich die Induktion von DSBs. Seit 2007 wird Tr in der Zweitlinientherapie zur Behandlung refraktärer STS, sowie bei Patienten eingesetzt, bei denen die Erstlinientherapie (Ifosfamid und/oder Doxorubicin) nicht angewendet werden kann. In Anbetracht der hitzeinduzierten Inaktivierung von BRCA2 und den DNA schädigenden Eigenschaften von Tr wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie die Hyperthermie zu einer Wirkungsverstärkung der zytotoxischen Effekte von Tr beitragen kann. Tr bewirkt in vitro bei Zelllinien unterschiedlicher Sarkomentitäten (U2Os, SW872, SW982) eine dosisabhängige Reduktion des klonogenen Überlebens, das durch einen HS zusätzlich verstärkt wird. Die erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem HS wird als thermale Chemosenitivierung definiert. Zudem konnte durch die Analyse der DNA-Verteilung bei U2Os und SW872 Zellen eine Intensivierung und Verlängerung der Tr-induzierten G2/M-Blockade nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurden Zelllinien-spezifische Unterschiede bezüglich einer behandlungsinduzierten Apoptoseinduktion oder Senseszenzantwort identifiziert. SW872 Zellen weisen einen dosis- und temperaturabhängigen Anstieg des Anteiles apoptotischer Zellen auf, der mit einer starken Aktivierung der Effektorcaspasen 3 und 7 einhergeht. Dem entgegen gehen U2Os Zellen in eine ausgeprägte behandlungsinduzierte zelluläre Seneszenz über. Anhand der quantitativen Analyse Tr-induzierter H2AX Foci hat sich ein relevanter Anstieg an DSBs durch eine zusätzliche Hitzeexposition herausgestellt, der eine Beeinträchtigung der BRCA2-vermittelten vollständigen Assemblierung der DNA-Reparaturfoci vermuten lässt. Die Hypothese einer thermalen Chemosensitivierung gegenüber Tr durch eine hitzeinduzierte HR-Defizienz – insbesondere im Rahmen der hitzeinduzierten BRCA2 Degradierung – wurde zudem durch das Ausbleiben der hitzebedingten Verstärkung der Tr-induzierten Zytotoxizität bei BRCA2-defizienten Zellen bekräftigt. Darüber hinaus wurde durch Hochdurchsatzanalysen bestätigt, dass eine hitzevermittelte, erhöhte antiproliferative Aktivität von Tr nach einem Knockdown zahlreicher HR-spezifischer Komponenten ausbleibt. Durch Hochdurchsatzanalysen sowie durch anschließende Validierungsexperimente wurden Proteine identifiziert, die sich als relevant für weitere präklinische und klinische Untersuchungen herausgestellt haben. Die Proteine BRCA1, PARP1 und CHEK1 stellen dabei potentielle molekulare Marker für ein Tumoransprechen auf die Kombinationstherapie von Tr und Hyperthermie dar. Deren Inhibition erwies sich zudem als eine weitere Strategie, um die Effektivität der ursprünglichen Behandlung zusätzlich zu erhöhen. Darüber hinaus wurde die Funktion von FANCD2 als prädiktiver Marker und von ERCC1 als Resistenzmarker für das Therapieansprechen einer alleinigen Tr-Behandlung in vitro bestätigt. Die herausgearbeitete thermale Chemosensitivierung gegenüber Tr mit Hyperthermie durch die induzierte HR-Defizienz mittels passagerer BRCA2 Degradierung (induzierte synthetische Letalität) sowie die Identifizierung weiterer Proteine, deren medikamentöse Inhibition die Effektivität der Kombinationsbehandlung zusätzlich erhöhen könnte, eröffnen neue Möglichkeiten in der Therapie solider Tumoren.

In the past view decades the therapy of malignant diseases has improved significantly. However especially metastatic diseases and relapses still require the development of new therapeutic modalities. Most chemotherapeutic agents induce apoptosis. A better understanding of apoptosis signaling is needed in order to combine cytostatic drugs in a more efficient way and to develop new targeted therapies. Conventional cytotoxic drugs and new therapies target p53, a key regulator of apoptosis. p53 is one of the most intensively studied target proteins but the heterogeneity and diversity of the function of p53 remains unclear. We investigated the importance of p53 in the intrinsic and extrinsic apoptosis signaling, via a variety of molecular biological approaches (Wachter et al., 2013). Apoptosis is induced intrinsically by the release of pro-apoptotic proteins from the inter-membrane space of the mitochondrion (eg. doxorubicin) or via activation of death receptors on the surface of the cell (eg. TRAIL, Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand). As described in the literature, wildtype p53 leaded to an increase in intrinsic cell death, whereas different p53 mutations reduced apoptosis. In our work we discovered that the influence of p53 status on extrinsic cell death induction was much more multifaceted. The presence of p53 in tumor cell lines and xenograft tumor cells resulted in augmented, unaffected or decreased cell death. With great interest we discovered that the replacement of wildtype p53 by mutant p53 did not disturb the extrinsic apoptosis inducing capacity. As a next step we studied the influence of cell cycle arrest induced by p53 activation on TRAIL apoptosis sensitivity (Ehrhardt/Wachter et al., 2013). Cell cycle arrest was induced in tumor cell lines and patient samples in G0, G1 or G2 with cytostatic drugs, phase-specific inhibitors or RNA interference against cyclinB and E. Molecular or biochemical arrest at any point of the cell cycle augmented the rate of apoptosis by TRAIL. Consequently, when cell cycle arrest was deactivated by adding caffeine, the antitumor activity of TRAIL was decreased. The extrinsic apoptosis by TRAIL was increased in senescent tumor cells. This is especially important for the therapy of minimal residual disease and for the prevention of relapse caused by resting tumor cells. Additionally, we studied the impact of p53 activation on the rate of apoptosis induced by combinations of cytostatic drugs (Ehrhardt, Schrembs, Moritz, Wachter et al., 2011). A single drug is not very effective in cancer therapy therefore malignant diseases are usually treated with a combination of cytostatic agents. Co-administration of anthracyclines and vinca alkaloids on the same day is a standard of care for hematopoietic malignancies. If both drugs are applied simultaneously, doxorubicin inhibits apoptosis induction of vincristine. While it is well understood that doxorubicin activates p53 and induces cell-cycle arrest, we observed that cell-cycle arrest disabled inactivation of anti-apoptotic Bcl-2-family members by vincristine. Therefore, it follows that vincristine was unable to activate downstream apoptosis signaling. Cycling cells are required for vincristine to kill cancer cells efficiently. In summary we have shown the heterogeneity of p53 in extrinsic and intrinsic apoptosis signaling. The impact of the p53 status of tumor cells on extrinsic apoptosis signaling should be considered, especially in the context of therapeutic approaches that aim to restore p53 function to enable cell death. p53 can act pro- and anti-apoptotic, depending on the individual patient tumor cell and on drug and signal interactions. Finally, this suggests that patients benefit from an individualized therapeutic regimen. Further investigation is required in order to better understand the therapeutic potential of these complex interactions.

Der Naturstoff Betulinsäure (BA) induziert effektiv Apoptose in Tumorzellen. Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass BA auf primären Leukämiezellen besser Apoptose in vitro induziert als viele der heute verwendeten Zytostatika. Zelltod wird dabei direkt über Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalwegs am Mitochondrium ausgelöst. Aufbauend auf diesen Daten war es Ziel dieser Dissertation, BA in die Kombinationsabfolge der Polychemotherapie der Leukämie einzuordnen. Zunächst wurde untersucht, mit welchen Zytostatika der heutigen Leukämietherapie Betulinsäure kooperiert, so dass der gemeinsame Einsatz beider Substanzen synergistische Apoptose auslöst. Dabei stellte sich heraus, dass Betulinsäure mit den drei Medikamenten Asparaginase, Doxorubicin und Vincristin kooperiert, sowohl auf sensitiven Tumorzelllinien, auf Zytostatika-resistenten Zelllinien als auch auf primären Zellen von Kindern mit akuter Leukämie. Im Hauptteil der Arbeit wurde untersucht, welche intrazellulären Signalmechanismen für die effektive Apoptoseinduktion von BA mit Asparaginase, Doxorubicin oder Vincristin verantwortlich sind. Dabei erwiesen sich für alle drei untersuchten Zytostatika die Signalmechanismen als identisch. Mittels des Einsatzes von transgenen Tumorzellinien, der Überexpression rekombinanter Proteine sowie des Knockdowns endogener Proteine über RNA-Interferenz konnte gezeigt werden, dass folgende Signalmoleküle die synergistische Apoptoseinduktion vermitteln: der Transkriptionsfaktor p53; das pro-apoptotische BCL-2 Familienmitglied NOXA, dessen Expression über p53 reguliert wurde; die mitochondriale Aktivierung mit Freisetzung von z.B. Cytochrom-C, die durch Mitglieder der BCL-2 Familie reguliert wurde; hierbei ermöglichte die p53-abhängige Regulation von NOXA eine Verschiebung des Gleichgewichts in Richtung zur Apoptose; Caspasen (Casp-3 und -9). Um die intrazelluläre Signaltransduktion auch an Patienten-abgeleiteten Zellen untersuchen zu können, wurde eine neue Technik etabliert: Kindliche ALL-Zellen wurden in immuninkompetenten Mäusen vermehrt und mittels eines optimierten Protokolls der Elektroporation mit small interfering RNA transfiziert. Auch hier zeigte sich eine Abhängigkeit der synergistischen Apoptoseinduktion von p53 und NOXA. Die dargelegten Untersuchungen legen nahe, BA in zukünftigen prä-klinischen und klinischen Studien der Leukämie in der Nähe von Doxorubicin, Asparaginase oder Vincristin einzusetzen, um von der günstigen p53-abhängigen Aktivierung von NOXA durch Zytostatika-Kombination zu profitieren.

Erufosin (Erucylphosphohomocholin, ErPC3) ist ein neuer Wirkstoff aus der Substanzklasse der Alkylphosphocholine, deren Angriffspunkt nicht die DNA, sondern die Zellmembran ist. Die Alkylphosphocholine lagern sich dort ein, beeinflussen die Lipidzusammensetzung, den Lipidmetabolismus und agieren durch Beeinflussung von intrazellulären Signalwegen unter anderem als Apoptoseinduktoren. Seit Januar 2004 wird mit Erufosin eine Phase I Studie durchgeführt (Dr. med. Lars Lindner, Medizinische Klinik und Poliklinik III, Klinikum Großhadern, LMU München, unpubliziert). Nach Abschluss der Studie wird sich für die folgenden Phase II Studien die Frage nach möglichen Kombinationsmöglichkeiten mit klassischer Chemotherapie oder auch Strahlentherapie stellen. Aufgrund der fehlenden myelosuppressiven Aktivität und der bislang guten Verträglichkeit (fehlende gastrointestinale Toxizität) eignet sich Erufosin insbesondere als Kombinationspartner für weitere toxische Therapieprinzipien wie z.B. Strahlentherapie. Für verschiedene andere, zum Teil bereits klinisch eingesetzte Alkylphosphocholine (Miltefosin®, Perifosin®) konnte in vitro gezeigt werden, dass sie die strahleninduzierte Apoptose verstärken und das klonogene Gesamtüberleben reduzieren, beides zum Teil sogar synergistisch. Eine Phase I Studie zum Einsatz von Strahlentherapie und Perifosin® wurde in den Niederlanden durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine gute Verträglichkeit der Kombinationsbehandlung (Vink, Schellens et al. 2006). In dieser Arbeit wurde anhand von Zellkulturexperimenten an 14 humanen Zelllinien von für Strahlentherapie in Frage kommenden Tumorentitäten die Kombinationswirkung von Erufosin und Strahlentherapie untersucht. Um die Bestimmung des klonogenen Überlebens zu simulieren wurde das WST1-Zellproliferationsassay verwendet. Die Tumorzellen wurden in einer 96-well-Platte ausgesät, mit Erufosin und Bestrahlung behandelt und die Zellzahl nach 5-8 Tagen Inkubation mit WST1-Reagenz gemessen. Dabei handelt es sich um eine Substanz, die von lebenden Zellen verstoffwechselt wird und der Metabolit photometrisch mit dem ELISA-Reader bestimmt werden kann. Zusätzlich wurde bei 6 Zelllinien die Auswirkung der Kombinationsbehandlung auf die frühe Apoptoseinduktion untersucht. Hierzu wurden die Zellen ausgesät, behandelt und nach 48h mit Propidiumiodid und Hoechst 33342 angefärbt. Die Auswertung erfolgte durch Auszählung der apoptotischen Zellen am Fluoreszenzmikroskop. Zur Quantifizierung der Kombinationseffekte wurde die isobolographische Analyse eingesetzt. Alle untersuchten Zelllinien zeigten in unterschiedlicher Empfindlichkeit ein Ansprechen auf Bestrahlung und Erufosin. Die Strahlenwirkung konnte durch Zugabe von Erufosin verstärkt werden, so dass das mehr Tumorzellen abstarben bzw. die frühe Apoptoseinduktion zunahm. In der isobolographischen Analyse ergaben sich subadditive bis additive Effekt. Besonders empfindlich für die Kombinationsbehandlung zeigten sich mit additiven Effekten A-549 (Bronchial-Ca), MCF-7 (Mamma-Ca), SK-LMS1 (Leiomyosarkom), NCI-H460 (Bronchial-Ca), DU-145 (Prostata-Ca), RD-ES (Ewing-Sarkom), KB (Zervix-Ca), FADU (Pharynx-Ca). Angesichts der Verstärkung des Strahleneffekts im Bezug auf Gesamtüberleben, der frühen Apoptoseinduktion bei Tumorzellen und dem bisher viel versprechenden Einsatz in der Klinik sollte die Kombination aus Erufosin und Strahlentherapie experimentell und klinisch weiter evaluiert werden.

Vaskuläre Erkrankungen sind als Ursache für Mortalität und Morbidität führend in westlichen Industrieländern. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass oxLDL eine herausragende Rolle bei der Atheroskleroseinduktion bzw. -progression zukommt. Die initiale Wirkung von im Blut zirkulierendem oxLDL findet auf der Ebene der Interaktion mit dem vaskulären Endothel statt und resultiert in der endothelialen Dysfunktion. Da die Zellfunktion durch die Integrität der Endothelzellschicht bzw. deren interzelluläre Kommunikation mitbestimmt ist, wäre es denkbar, dass für die oxLDL-induzierten Veränderungen im Endothel u. a. die Beeinflussung der Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions eine Rolle spielt. Bislang war jedoch wenig darüber bekannt, welchen Einfluss oxLDL auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt. Außerdem war es nicht geklärt, inwiefern diese Veränderungen in der Zell-Zell-Kommunikation die Induktion und den Schweregrad der oxLDL-induzierten Apoptose beeinflussen. Ziele der Studie waren daher i) zu analysieren, ob und über welche Mechanismen oxLDL einen Einfluss auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt, ii) zu untersuchen, welche Bedeutung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions bzw. einzelnen Connexinen bei der Induktion der Apoptose zukommt. Mittels der Dye-Transfer-Methode nach Farbstoffinjektion in eine einzelne Zelle konnten wir zeigen, dass oxLDL eine signifikante Steigerung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in HUVEC induziert. Dieser Effekt ist dosisabhängig: er zeigte sich nur bei geringen oxLDL-Konzentrationen (15 bzw. 26 μg/ml) und wurde bei weiterer Erhöhung der Konzentration bis auf 100 μg/ml wiederum aufgehoben. Die durch oxLDL verstärkte Zell-Zell-Kommunikation wurde in Endothelzellen durch einen cAMP/PKA abhängigen Mechanismus vermittelt, wobei die cAMP-Freisetzung durch ein Cyclooxygenaseprodukt, wahrscheinlich Prostacyclin, getriggert wurde. Mittels immunhistochemischer Färbungen für Cx37 und Cx43 konnten wir nicht bestätigen, dass die oxLDL-induzierte Verstärkung der Zell-Zell-Kommunikation infolge einer Hochregulation der Connexin-Expression auftritt. Im zweiten Teil der Studie wurde der Einfluss von oxLDL auf die Apoptoseinduktion analysiert. Die Apoptose wurde mittels der Annexin V - Propidium Iodid Färbung bzw. durch Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials durchflusszytometrisch erfasst. OxLDL verursachte einen signifikanten Anstieg der Apoptoserate in HUVEC. Zur Aufklärung der Rolle bestimmter Connexine wurden weitere Experimenten in Cx-transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt. In diesen Zellen erhöhen einzelne Connexine die Apoptoserate in unterschiedlichem Ausmaß: Cx43 > Cx40 > Cx37. Um zu prüfen, ob die bloße Anwesenheit der Connexine dafür von Bedeutung war oder ob von Connexinen gebildete Gap Junctions dafür von Bedeutung waren, wurden weitere Experimente durchgeführt. Dafür wurden in einem neuen Versuchsansatz Zellen in Suspension (keine Zell-Zell-Kontakte) sowie adhärente Zellen im Monolayer (bestehende Zell-Zell- Kontakte) einer proapoptotischen Stimulation durch Streptonigrin unterzogen. Die Zellen in Suspension wiesen erst zu einem deutlich späteren Zeitpunkt apoptotische Veränderungen auf. Das deutet auf eine Beteiligung der Gap Junctions bei der Apoptoseinduktion hin. Diese Interpretation wurde durch Befunde einer weiteren Versuchsreihe bestätigt. Bei Inkubation von apoptotischen Cx43-positiven Zellen mit intakten Zellen wurde die Apoptoserate der Letzteren nur dann signifikant erhöht, wenn diese ebenfalls Connexin 43 exprimierten und funktionelle Gap Junctions mit den bereits apoptotischen Zellen de novo bilden konnten. Somit demonstriert diese Arbeit, dass Gap Junctions eine wichtige Rolle bei der Apoptoseinduktion spielen. In nachfolgenden Studien soll in Atherosklerose-Modellen überprüft werden, ob und inwiefern die hier beschriebenen Mechanismen auch unter den In-Vivo-Bedingungen bei den oxLDL-assoziierten Gefäß/Endothelschäden eine Rolle spielen.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Organtemperatur während der Ischämie auf den mikrovaskulären Ischämie-Reperfusionsschaden systematisch zu analysieren. Um dies zu ermöglichen wurde im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit ein geeignetes Tiermodell etabliert. Das entwickelte Modell ermöglichte eine reversible in situ Ischämie mit anschliessender Reperfusion des linken Leberlappens der Maus. Während der Ischämie konnte der ischämische Leberlappen genau auf die gewünschte Temperatur eingestellt und konstant gehalten werden. Abgesehen von der unterschiedlich eingestellten Organtemperatur, herrschten bei allen Versuchsgruppen gleiche Bedingungen. Weder bei der Körperkerntemperatur noch bei dem mittleren arteriellen Blutdruck gab es signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Nach darauffolgender Reperfusion ermöglichte das Modell eine intravitalmikroskopische Analyse der Mikrozirkulation und anschliessende ex vivo Messungen vieler Schadensparameter. Damit ist es gelungen, ein geeignetes Tiermodell zur systematischen in vivo Analyse des singulären Einflusses verschiedener Organtemperaturen auf den hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden der Maus, zu etablieren. Die Ergebnisse wiesen, in Übereinstimmung mit der Literatur, einen ausgeprägten Ischämie-Reperfusionsschaden nach normothermer Ischämie auf. Dabei war die sinusoidale Perfusionsrate signifikant reduziert, es trat eine deutliche Zunahme der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion auf und es folgte eine massive Freisetzung der Leberenzyme AST/GOT und ALT/GPT. Erstaunlicherweise konnten bereits durch eine milde Hypothermie von 26°C sämtliche Schadensparameter auf das Niveau der Shamgruppe reduziert werden. Entgegen der Erwartung scheint es keinen linearen Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß des mikrovaskulären Schadens zu geben. Vergleichbar mit den Ergebnissen der Mikrozirkulation war nach normothermer Ischämie auch eine Vielzahl apoptotischer Zellen zu verzeichnen. Nahezu 17% der Hepatozyten waren TUNEL-positiv und die Aktivität der apoptose-spezifischen Caspase-3 nahm um etwa das vierfache zu. Auch hier bewirkte bereits ein mildes Abkühlen des ischämischen Leberlappens auf 31,5°C eine vollständige Protektion der Leberzellen vor Apoptose. Es zeigte sich damit auch hier kein linearer Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß einer Apoptoseinduktion. Der Verdacht auf eine durch Kälte induzierte Apoptose konnte sich in diesem Versuchsaufbau nicht erhärten. Nach 90-minütiger Ischämie bei 4°C waren, wie auch in der Shamgruppe, weniger als 1% TUNEL-positive Zellen zu verzeichnen und ein Anstieg der Caspase-3-Aktivität blieb vollständig aus. Bei der Betrachtung, ob es sich bei der Zellschädigung um nekrotischen oder um apoptotischen Zelltod handelt, ergaben die verwendeten Messmethoden deutliche Hinweise für beide Arten des Zelltodes.

Thu, 14 Dec 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6507/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/6507/1/Patz_Monika.pdf Patz, Monika

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt weltweit zu den häufigsten Karzinomen, in Europa macht es zwar nur 3% der Karzinome aus – jedoch mit steigender Inzidenzrate. Diese ist möglicherweise auf eine Infektionswelle mit Hepatitis B und C von 1950 bis 1980 zurückzuführen (29, 125). Daneben zählen chronischer Alkoholabusus, Aflatoxin B1-Exposition und Leberzirrhose per se zu den Hauptrisikofaktoren für die Entstehung des hepatozellulären Karzinoms. Die Kenntnisse der molekularen Mechanismen der Karzinogenese in der Leber, insbesondere der Dysregulation von Proliferation und Apoptose sind indessen noch sehr lückenhaft. Die vorgelegte Arbeit wurde mit dem Ziel durchgeführt, einen Beitrag zur Klärung der formalen und molekularen Pathogenese der Hepatokarzinogenese zu leisten. Es wurde das Proliferations- und Apoptoseverhalten im hepatozellulären Karzinom (HCC, n=52) über immunhistochemische Verfahren und TUNEL-Hybridisierung untersucht. Dabei wurde die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67, der Zellzyklus- und Apoptosekontrollproteine Fas-Rezeptor (Fas), Fas-Ligand (FasL), bax, bcl-2, p53 und der Apoptosemarker M30 und TUNEL mit normalem Referenzgewebe (RG, n=61), dysplastischen Knoten (DN, n=9), einem hepatozellulären Adenom (HCA, n=1), makroregenerativen Knoten (MRN, n=5), fokaler nodulärer Hyperplasie (FNH, n=3), undifferenzierten Karzinomen (n=2), einem cholangiozellulären Areal eines Kollisionstumors (n=1) und Metastasen primärer Lebermalignome (n=3) verglichen. Fragen waren dabei, - ob bestimmte Expressionsmuster der untersuchten Zellzyklus- und Apoptose-regulatoren kennzeichnend für die Hepatokarzinogenese sein könnten, - ob sich Hinweise auf eine Adenom-Karzinom- oder Dysplasie-Karzinom-Sequenz ergeben, - ob interindividuelle Unterschiede zwischen HCC abhängig von Ätiologie, histologischem Differenzierungsgrad, Tumorgröße, pT-Stadium und Morphologie bestehen und sich daraus Rückschlüsse auf ein jeweils charakteristisches tumorbiologisches Verhalten ziehen lassen, - ob sich aus den Ergebnissen relevante Schlussfolgerungen für Diagnostik und Therapie des Hepatozellulären Karzinoms ableiten lassen. Damit wird mit dieser Arbeit erstmalig eine komplexe Beleuchtung des Proliferations- und Apoptoseverhaltens im hepatozellulären Karzinom und in anderen Veränderungen der menschlichen Leber vorgelegt, die so bisher nicht vorgenommen wurde. Folgende Ergebnisse waren in der Auswertung der immunhistochemischen Untersuchungen festzustellen: HCC zeigten eine signifikant gesteigerte Ki-67-Expression, TUNEL-Positivität, bax-Expression, sowie eine signifikant verminderte Fas- und FasL-Expression gegenüber normalem Referenzgewebe (RG) (p

Das multiple Myelom ist eine Erkrankung, bei der terminal differenzierte Plasmazellen das Knochenmark infiltrieren, wodurch das typische klinische Bild eines Myelompatienten zustande kommt. In den letzten Jahren haben sich die Hinweise gehäuft, dass die Bindung der Myelomzellen im Knochenmark an Stromazellen die Chemosensitivität der Myelomzellen vermindert und somit zur „de-novo drug resistance" beiträgt. Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, ein Zellmodell zu entwerfen, mit welchem die Untersuchung der Interaktionen von Stromazelle und Myelomzelle und damit der zelladhäsionsabhängigen Zytostatikaresistenz (CAM-DR) möglich ist. Darüber hinaus sollte diese Zytostatikaresistenz charakterisiert und mögliche molekulare Therapietargets identifiziert werden, welche eine Verhinderung von CAM-DR ermöglichen. Da das etablierte Kokulturmodell auf einer Kultur mit der Stromazelllinie HS-5 beruhte, wurde diese zuerst bezüglich der Oberflächenmarker und des Apoptoseverhaltens charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass sich primäre Stromazellen aus Knochenmarksspiraten und die Stromazelllinie HS-5 zwar in ihrer Chemosensibilität unterscheiden, sie prinzipiell jedoch gleich reagieren. Beide lösen bei einer direkten Kokultur mit Myelomzellen im selben Maße CAMDR in den Myelomzellen aus. Die anschließende Charakterisierung von CAM-DR bewies, dass CAM-DR nicht zelllinienspezifisch und nicht zytostatikaspezifisch ist. HS-5-Zellen verhinderten nicht nur die Entstehung von später sondern auch von früher Apoptose. Es zeigte sich, dass das Ausmaß von CAM-DR maßgeblich von der Dauer der Kokultivierung abhängt. Des Weiteren stellte sich heraus, dass in diesem Zellmodell die von den HS-5-Zellen sezernierten Zytokine keinen Einfluss auf die Apoptoseinduktion hatten. Konsequenterweise wurden die Oberflächenantigene auf den Myelomzellen und den Stromazellen quantifiziert und teilweise deren Alteration nach einer Inkubation mit Zytostatika festgestellt. Sowohl eine Blockade der wichtigsten Integrine VLA-4 und LFA-1 als die Modulation der wichtigsten Signalwege konnte CAM-DR zwar teilweise, aber nicht vollkommen verhindern. Allein Vertreter der Statine, Simvastatin und Lovastatin, konnten CAM-DR drastisch reduzieren. Wie weiterhin gezeigt werden konnte, lag dies nicht an einer verminderten Expression von Oberflächenintegrinen, einer verminderten Zytokinsekretion der Stromazellen oder einer verstärkten Deadhäsion der Myelomzellen von den Stromazellen, sondern an der Hemmung der Geranylgeraniolpyrophosphatsynthese. Wir wiesen nach, daß Statine in der Kokultur über die Hemmung des HMG-CoA-Reduktase/GG-PP/Rho/Rho-kinase-Signalwegs wirken. Dies wurde in weiteren Experimenten, in denen selektiv die Geranylgeranioltransferase mittels GGTI-298 und die Rho-Kinase mit Y-27632 gehemmt wurden, bestätigt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können als Grundlage für einen potentiellen Einsatz von Statinen in der Therapie des multiplen Myeloms dienen, denn bezüglich des dargestellten Signalwegs wirken die Statine bereits im subtoxischen Bereich. Die weitere Erforschung von CAM-DR und deren assoziierte Signalwege bei anderen Tumorentitäten sowie die Evaluation der klinischen Relevanz der Gabe von Statinen zur Blockade von CAM-DR ergeben sich als wichtige nächste Schritte als Konsequenz der vorliegenden Arbeit.

Die Exposition von Makrophagen gegenüber Bakterien oder LPS führt über die Aktivierung zellulärer Signalkaskaden zu einer vermehrten Expression von Genen, deren Proteinprodukte zelluläres Überleben unter Infektionsbedingungen ermöglichen. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF - kB spielt dabei eine wichtige Rolle. Pathogene Yersinia enterocolitica - Stämme hemmen die Aktivierung von NF - kB und induzieren Apoptose bei Makrophagen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Yersinia - Effektorprotein YopP maßgeblich an der Apoptoseinduktion beteiligt ist. Bei Infektionsversuchen konnten lediglich die Yersinienstämme bei Makrophagen Apoptose induzieren, die über einen funktionstüchtigen Typ III - Sekretionsapparat und ein dadurch transloziertes YopP verfügen. Eine transiente Überexpression der transkriptionell aktiven NF - kB - Untereinheit p65 schützt Makrophagen spezifisch vor durch Yersinien, nicht jedoch vor durch Salmonellen induzierter Apoptose. Das weist darauf hin, dass YopP durch die Blockierung des NF - kB aktivierenden Signalwegs Apoptose bei Makrophagen vermittelt. Die Transfektion von J774A.1 Makrophagen mit YopP induzierte bei 40 - 50% der transfizierten Zellen Apoptose. Durch die zusätzliche Stimulation mit LPS konnte die Apoptoserate auf 80 - 90% gesteigert werde. Dieser synergistische, proapoptotische Effekt ist direkt auf durch LPS induzierte Signaltransduktions -prozesse zurückzuführen. Aus Transfektionsversuchen mit dominant - negativen Signalmolekülen der TLR - Signalkaskade ergaben sich Hinweise auf eine Beteiligung der Transmitter MyD88 und IRAK2 an der Apoptoseeinleitung. IRAK1 und TRAF6 scheinen dagegen eher ein antagonistisches, NF - kB aktivierendes LPS - Signal zu bedienen, welches unter dem Einfluss von YopP unterdrückt wird. Dadurch überwiegt das durch LPS induzierte, proapoptotische Signal, welches den apoptotischen Zelltod einleitet. Die Aktivierung des Apoptoseprogramms selbst erfolgt über FADD und Caspase - 8.

Hydrophobe Gallensäuren werden für die Leberzellschädigung bei cholestatischen Lebererkrankungen verantwortlich gemacht. Sie induzieren nach Aufnahme in Hepatozyten Apoptose. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Effekte der quantitativ wichtigsten hydrophoben Gallensäure des Menschen, Glycochenodeoxycholsäure (GCDCA), auf molekulare Signaltransduktionswege, die Apoptose induzieren oder hemmen, und die Modulation der Transkription von Genen, die für pro- und antiapoptotische Proteine kodieren, weiter aufzuklären. Die Untersuchungen wurden am Modell der humanen Hepatomzelllinie HepG2, die stabil mit dem Gallensäurentransporter Ntcp transfiziert wurde, durchgeführt.

Durch den Transfer tumorspezifischer T-Zellen können solide Tumore nicht nur in Tieren, sondern auch im Menschen erfolgreich behandelt werden. Dudley et al. konnten kürzlich nach dem autologen Transfer stimulierter tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) nach vorheriger non-myeloablativer Konditionierung in zwei von zwölf Patienten mit Melanomen eine Tumorregression erreichen (Dudley et al. 2002). Änliche Erfolge konnten Chang et al. bei der Behandlung von fortgeschrittenen Nierenkarzinomzellen erzielen (Chang et al. 2003). Sie vakzinierten Patienten mit Calmette-Guérin Bacillus versetzten Tumorzellen und ernteten anschließend die T-Zellen aus den angrenzenden Lymphknoten der Vakzinierungsregion. Nach autologem Transfer der vorwiegend CD8+ T-Zellen, welche in vitro mit anti-CD3 stimuliert wurden, sprach die Therapie bei neun von 34 Patienten an. Die Mechanismen der T-zellvermittelten Tumorregression sind aber bis heute noch unklar. Gegenstand dieser Arbeit war es daher Faktoren zu untersuchen, welche eine Rolle bei der Regression von D5-Melanomlungenmetastasen durch den adoptiven Transfer CD4+/CD8+ T-Zellen aus Tumorvakzin drainierenden Lymphknoten (TVDLN) nach Vakzinierung mit D5G6 (einem GM-CSF transduzieren D5-Subklon) spielen. Hierzu wurden D5-Zellen in vitro mit Zytokinen, welche von Effektor T-Zellen (TE) produziert werden, stimuliert. Wir konnten zeigen, dass D5-Tumorzellen die als proapoptotisch geltenden Rezeptoren TNF-R I sowie Fas nach IFN-g-Stimulation exprimieren. Die Inkubation mit den Liganden dieser Rezeptoren TNF-a, LT-a und FasAb bewirkt keine Apoptoseinduktion. Gleichzeitige Inkubation dieser Liganden führt nur zu einer Apoptoserate von 25% in D5. Mögliche Gründe der relativen Apoptoseresistenz von D5 könnten die intrazellulären Apoptoseinhibitionsproteine c-IAP I, c-IAP II und Survivin sein, welche wir in D5 nachweisen konnten. Da nach adoptivem Transfer tumorspezifischer TE Makrophagen die pulmonalen Tumormetastasen infiltrieren, untersuchten wir, ob TE Chemokine exprimieren. Unsere Untersuchungen ergaben, dass TE die Chemokine MIP-1a, MIP-1b und RANTES tumorspezifisch exprimieren. Nach Stimulation von D5-Tumorzellen mit den Zytokinen TNF-a und IFN-g, welche von TE tumorspezifisch exprimiert werden, wird die Chemokin-mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig in D5 exprimiert. Auch die Koinkubation von D5 mit TE induziert die Expression der mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig. Deutlich erhöhte KC und MCP-1 Proteinkonzentrationen wurden im Überstand von D5-Tumorzellen mittels ELISA nach TNF-a Stimulation gegenüber unstimulierten und IFN-g stimulierten D5-Zellen festgestellt. Um zu prüfen, ob die von D5 gebildeten Substanzen auch tatsächlich chemotaktisch auf Makrophagen wirken, führten wir einen chemotaktischen Assay durch. Wir konnten zeigen, dass es zu einer signifikanten Steigerung der Anzahl migrierter Makrophagen in Richtung D5- Tumorzellen nach deren Stimulation mit IFN-g und TNF-a kommt. Da wir in TE die Expression von TNF-a-mRNA und die Sekretion von IFN-g tumorspezifisch nachweisen konnten, besteht Grund zur Annahme, dass in vivo TE in der Lage sind Tumorzellen zur Chemokinbildung anzuregen, was zu einer Invasion von Makrophagen in die Tumorregionen führt. Dass Makrophagen möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Tumorregression spielen, deckt sich auch mit der Beobachtung von Feinmesser et. al., welche mit einer peritumorösen Injektion von Multikinen (Zytokin-/Chemokinmischung) Kopf und Halstumore behandelten (Feinmesser et al. 2003). Nach dieser Therapie zeigte sich in den Tumorregionen der erfolgreich behandelten Patienten im Gegensatz zu Non-Respondern eine hohe Anzahl migrierter und aktivierter Makrophagen. Wir fanden mit den Ergebnissen unserer Studie erstmals Hinweise darauf, dass im murinen Melanommodell B16BL6-D5 nicht ausschließlich die direkte T-zellabhängige Zytotoxizität zur Tumorregression führt, sondern dabei weitere Zellarten wie Makrophagen/Monozyten involviert sind, welche mittels tumorspezifischer Chemokine rekrutiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung der Mechanismen T-zellvermittelter Tumorregression. Die Kenntnisse dieser Mechanismen haben entscheidende Bedeutung bei der Entwicklung neuer, effektiver Behandlungskonzepte gegen solide Tumore.

Thu, 14 Oct 2004 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2863/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/2863/1/Welsch_Julia.pdf Welsch, Julia

Yersinien sind auf Grund ihres spezifischen Typ III-Proteinsekretionssystems (TTSS) in der Lage, nach Anlagerung an Zellen bakterielle Virulenzproteine in das Innere der Wirtszelle zu translozieren. Dies führt zu einer Zellparalyse und bei Makrophagen zum Zelltod. Eines der translozierten Virulenzproteine ist YopP/J, das die Signalwege der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) sowie des Transkriptionsfaktors NF-kB in der Wirtszelle inhibiert. Es wird angenommen, dass YopP/J zur Familie der Cystein-Proteasen zählt. Es zeigt Homologien zu AvrRXV/AvrBst von Xanthomonas campestris, welches eine dem apoptotischen Zelltod vergleichbare sogenannte „Hypersensitive Reaktion (HR)“ bei Pflanzen auslösen kann. Die Bakterien der enteropathogenen Spezies Yersinia enterocolitica, welche nach oraler Aufnahme im terminalen Ileum durch M-Zellen in die Lymphfollikel der Peyerschen Plagues wandern, werden anhand ihrer Oberflächen-(O)- und Geißel-(H)-Antigene in verschiedene Serotypen unterteilt. Unsere Studien haben gezeigt, dass sich einzelne Y. enterocolitica-Serotypen in der Apoptoseinduktion bei Makrophagen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde den Mechanismen der Apoptoseinduktion durch die verschiedenen Y. enterocolitica-Serotypen nachgegangen. Zunächst konnte YopP für die unterschiedlichen Apoptose-Effekte verantwortlich gemacht werden. Durch DNA-Austausch und der anschließenden Modifikation einzelner Aminosäuren zwischen YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O8 und Y. enterocolitica-Serotyp O9 konnte Arginin (R) an Position 143 als essentielle AS der Effektordomäne von YopPO8 definiert werden. YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O9 und Y. enterocolitica-Serotyp O3 besitzt an dieser AS-Position Serin (S). YopPO8 vermittelt deutlich stärker Apoptose als YopPO9 und YopPO3. Der erhöhten Apoptoseinduktion durch YopPO8 geht eine effiziente Unterdrückung der NF-kB-Aktivierung vorraus. Die Inhibition des antiapoptotischen NF-kB-Signalwegs durch YopP scheint Voraussetzung für die Apoptoseinduktion durch Yersinia zu sein. Des weiteren wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems nach neuen unbekannten intrazellulären YopP-Interaktionspartner gesucht. Aus einer Maus-Milz-cDNA-Genbank konnten 22 potentielle YopP-Interaktionspartner isoliert werden. In in vitro-Bindungsstudien konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt eine Interaktion von YopP mit vier Proteinen (PP2Ac, FWD2, eEf1bb, Smad1) bestätigt werden. Weiterführende Bindungs- und Funktionsanalysen werden noch durchgeführt. Die möglichen Auswirkungen dieser Interaktionen werden diskutiert. Die durchgeführten Studien erbrachten zudem Hinweise auf eine Modifikation von YopP in der Wirtszelle. Darüberhinaus konnte mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems der Interaktionsbereich von YopP mit seinem Zielprotein IKKb eingeschränkt werden. Die durchgeführten Bindungsanalysen mit IKKb-Deletionsmutationen weisen auf eine Bindung von YopP an den IKKb-N-Terminus hin. Das Ergebniss wurde durch in vitro-Bindungsstudien bestätigt. Unter anderem scheint Alanin an IKKb-Position 120 die Interaktion mit YopP zu bestimmen. So konnten im Rahmen dieser Doktorarbeit unterschiedliche Aspekte der Wechselwirkung von Y. enterocolitica YopP mit der Wirtszelle und Wirtszellproteinen analysiert werden. Diese Studien tragen zum besseren Verständnis der Immunmodulation durch pathogene Bakterien bei.

Der programmierte Zelltod (Apoptose), ist ein evolutiv konserviertes Selbstmordprogramm der Zelle, um auf äußere oder endogene Signale zu reagieren. Es dient dazu, überflüssige und/oder geschädigte Zellen zu entfernen. Dieser Prozess ist bei Krankheiten wie z.B. Krebs teilweise außer Kraft gesetzt, und bei Parkinson- oder Alzheimer-Erkrankung zu stark ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Gene biochemisch und molekularbiologisch näher charakterisiert. Bei diesen zwei Genen, die mit Hilfe eines speziell zur Identifikation dominanter, Apoptose–induzierender Gene entwickelten Screnningsverfahrens identifiziert wurden, handelt es sich um CybL, eine Komponente von Komplex II der Atmungskette, und um Saip (Small apoptosis inducing protein) einem Protein, das am endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist. Bisher war bekannt, daß die Atmungskettenkomplexe I und III bei der Fas-Ligand und der Ceramid-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Über einen Zusammenhang von Komplex II und Apoptose-Induktion war zu Beginn dieser Arbeit nichts beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit wurde entdeckt, daß neben CybL kann auch noch die kleine Untereinheit von Komplex II (CybS) Apoptose auslösen kann, wohingegen die übrigen Komponenten von Komplex II, das Flavinprotein (FAD) und das Eisen–Schwefelprotein (FeS), nicht in der Lage sind, Apoptose zu induzieren. Die laut Datenbank vorhergesagten vier Transmembrandomänen von CybL sind für die apoptoseinduzierende Eigenschaft notwendig. Darüber hinaus führt nur eine 3,8–fache Induktion von CybL über dem endogenen CybL zu Apoptose in Säugetierzellen. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, daß CybL einerseits bei Überexpression Apoptose induzieren kann, und andererseits Apoptose durch seine Inaktivierung reduziert wird. Daß CybL damit ein spezifischer Sensor für Apoptose ist, konnte dadurch ermittelt werden, daß eine Reihe verschiedener Apoptosestimuli (Doxorubicin, Etoposid, Menadion, Cisplatin, Taxol) und der Fas-Rezeptor einen intakten Komplex II zur Signalvermittlung benötigen. Dazu wurde mit sogenannten B9/B30 Zellen gearbeitet. B9/B30-Zellen sind Lungenfibroblasten aus Hamsterzellen, in denen CybL inaktiv ist (B9), wohingegen die B30-Zellen ein Fusionsprotein zwischen CybL und GFP enthalten, welches die physiologische Aktivität von Komplex II wiederherstellt. In den B9-Zellen ist die Apoptoseinduktion durch Cytostatika (Ausnahme Arsentrioxid) bzw. durch den Fas-Rezeptor reduziert, verglichen mit den B30-Zellen. Auch Untersuchungen an HeLa WT- bzw. HeLa 0-Zellen (die keine intakte Atmungskette besitzen) zeigten, daß für die Apoptoseinduktion mit den oben genannten Reagenzien eine intakte Atmungskette benötigt wird. Im Jahre 2000 wurde CybL als Tumosupressor beschrieben. Es ist daher zu vermuten, daß die Tumorsuppressor-Eigenschaften von CybL auf der Fähigkeit von Komplex II beruhen, proapoptotische Signale aufzunehmen und weiterleiten zu können. Bisher war bekannt, daß eine transiente Inhibition einiger Atmungskettenkomplexe (Komplex I, II, III) zur Bildung von reaktiven Sauerstoffintermediaten (ROI) führt. Es konnte gezeigt werden, daß auch CybL bei Überexpression reaktive Sauerstoffintermediate produziert, und daß viele proapoptotische Signale zur spezifischen Inhibition von Komplex II führt. Da bereits eine geringe Expression von CybL ausreichend ist, um Komplex II zu inhibieren, und dadurch Apoptose ausgelöst wird, kann Komplex II als spezifischer Sensor für Apoptose angesehen werden. Das bisher unbekannte Gen mit dem Namen Saip löst dominant Apoptose in Säugetierzellen aus. Die proapoptotische Eigenschaft von Saip ist vermutlich auf einen evolutiv konservierten Mechanismus zurückzuführen, da auch ein Homolog aus C.elegans nach transienter Transfektion in Säugerzellen Apoptose auslöst. Dabei induziert Saip Caspase-abhängige Apoptosewege, die zur Apoptose-typischen DNA–Fragmentierung und Bildung von apoptotischen Körperchen (Membran blebbing) führt. Es konnte auch eine physikalische Protein-Proteininteraktion (mittels Co-Immunpräzipitation) mit Bap31 gefunden werden. Dieses Protein ist ebenfalls am ER lokalisiert und Bestandteil eines lokalen Apoptose-Sensors, der einen Proteinkomplex mit Procaspase-8L sowie antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie (Bcl-2 bzw. Bcl-XL) bildet. Des weiteren interagiert Saip auch mit einer Deletionsmutante von Spike (Small protein with inherent killing effect-SpikeN19), einem neuen proapoptotischen BH3-only Protein, das ebenfalls am ER lokalisiert ist, und an Bap31 bindet. Saip ist ein ubiquitäres Protein und wird in sehr vielen der getesteten Gewebe und Zelltypen exprimiert. Im Northern-Blot-Verfahren konnte vergleichsweise eine hohe Expression an humaner Saip-mRNA in Niere, Placenta, Herz, Leber, Dünndarm und Skelettmuskulatur detektiert werden. Mit Hilfe von weiteren Northern-Blots wurde herausgefunden, daß Saip durch diverse Reagenzien, die bekanntermaßen Apoptose induzieren können, transkriptionell hochreguliert wird. So ist zum Beispiel das Signal von Saip nach 5-Fluorouracil-Behandlung (5FU), um das 80-fache gegenüber der Kontrolle erhöht. 5FU ist ein sehr effektives und bekanntes Zytostatikum, das in der Klinik zur Behandlung von Colon- und Mammakarzinomen erfolgreich eingesetzt wird. Wird Saip mittels der RNAi–Methode deaktiviert, wird die 5FU-induzierte Apoptose um 1/3 reduziert. Saip könnte somit eine wichtige Rolle in der Behandlung von Tumoren spielen, die mit 5FU therapiert werden.

Sowohl für die Inhibierung der Apoptose zur Plaquestabilisierung, wie auch für eine selektive Induktion von Apoptose in Zellen der Neointima zur Restenose-prävention ist ein besseres Verständnis der Apoptoseregulation in glatten Gefäßmuskelzellen erforderlich. In dieser Arbeit wurden glatte Gefäßmuskelzellen aus Media und Neointima der Ratte im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit auf Statinbehandlung untersucht. Diese Zellen repräsentieren ein gut charakterisiertes und breit verwendetes Modell. Die Ergebnisse basieren auf Versuchen mit Zellkulturen und können als Grundlage für Versuche mit menschlichen Zellen und/oder weitere Tierexperimente betrachtet werden. Man kann Folgendes zusammenfassen: A). Statine induzieren in vitro Apoptose sowohl in Media als auch in Neointima glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Effekt beobachtet man nur bei den lipophilen Statinen Lovastatin, Simvastatin und Fluvastatin. Das hydrophile Pravastatin zeigt keinen Effekt. Die Apoptoseinduktion in glatten Gefäßmuskelzellen aus der Media war gering bei serumfreien Bedingungen. B). Die Neointima Zellen sind im Vergleich zu den Media Zellen sowohl bei serumhaltigen, als auch unter serumfreien Bedingungen deutlich empfindlicher auf Apoptoseinduktion durch Statine. C). Eine mögliche Erklärung für die beobachteten Unterschiede könnte in der niedrigeren Expression des antiapoptotischen Proteins cIAP-1 in Neointima Zellen liegen. Dank der Ergebnisse dieser Versuche könnten neue effektive Strategien zur Prävention der Restenose nach Ballonangioplastie entwickelt werden, z.B. durch die lokale Anwendung lipophiler Statine mittels entsprechender Stentbeschich-tung.

Die Apoptose ist ein genetisch codiertes Suizidprogramm, das es jeder eukaryontischen Zelle erlaubt, auf bestimmte endogene oder äußere Signale mit einem kontrollierten Degradations- und Absterbeprozess zu reagieren. Auf diese Weise werden dem Organismus überzählige oder geschädigte Zellen entzogen, ein Prozess, der z.B. bei Krankheiten wie Krebs zumindest partiell ausser Kraft gesetzt ist. Um neue Einblicke in das erst in Teilen aufgedeckte Netzwerk Apoptose-induzierender Gene zu erhalten, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Expressions-Screeningverfahren zur Identifikation neuer proapoptotischer Gene eingesetzt. Mit diesem Verfahren, das auf der Fähigkeit der Gene dominant Apoptose zu induzieren basiert, wurden mehr als 50 neue Apoptose-induzierende Gene isoliert, von denen einige Ursache bestimmter Krankheiten sein könnten. Aus diesen wurde das Metastasensuppressorgen C33/CD82 für weitere Untersuchungen ausgewählt, da seine Expression in zahlreichen stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist und es bislang nicht als proapoptotisch beschrieben wurde, obwohl es eines der bislang bestcharakterisiertesten Metastasensuppressorgene ist und die Apoptose ein kritischer Faktor bei der Metastasierung ist. C33/CD82-Apoptose erfolgt durch Aktivierung der Mitochondrien. Dadurch kommt es zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials und zur Freisetzung proapoptotischer Faktoren in das Cytoplasma, wo diese Caspasen aktivieren, sodass es zur Ausprägung charakteristischer Merkmale der Apoptose kommt: neben morphologischen Veränderungen, wie der Ausbildung apoptotischer Körperchen, wird Phosphatidylserin exponiert und die DNA und bestimmte Proteine werden degradiert. Ausgelöst wird die C33/CD82-Apoptose durch Superoxidanionen, die anders als bei Standard-Apoptosewegen nicht an der mitochondrialen Elektronentransportkette gebildet werden. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass auch einige andere Mitglieder der Tetraspanin-Superfamilie, der C33/CD82 angehört, Apoptose induzieren: hierzu zählen CD9, CD37, CD81 und CD151 und in geringerem Umfang auch CD53 und CD63. Mit Hilfe trunkierter Mutanten wurde der für die Apoptoseinduktion verantwortliche Bereich auf die ersten 119 Aminosäuren von C33/CD82 eingegrenzt. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit ist die C33/CD82-Apoptose eine wesentliche neue Eigenschaft des Proteins: Sie könnte neben der Beeinflussung der Zellmotilität, die durch E-Cadherin und Integrine vermittelt wird, mit denen C33/CD82 interagiert, und der Internalisierung des EGF-Rezeptors, die durch C33/CD82 beschleunigt wird, zur Wirkung des Proteins als Metastasensuppressor beitragen. Die Überexpression von C33/CD82 induziert nicht nur Apoptose in allen getesteten Tumorzelllinien, sondern auch unter hypoxischen Bedingungen. In vivo sind derartige Bedingungen im Inneren nicht vaskularisierter Tumore und Metastasen zu finden. Dort könnten sie, bedingt durch die Hypoxie-aktivierbaren Transkriptionsfaktoren p53 und NF﷓IL﷓6, zu einer Verstärkung der C33/CD82-Expression führen. Die Vermeidung von Hypoxie-induzierter C33/CD82-Apoptose könnte ein Grund dafür sein, dass die Expression von C33/CD82 in vielen untersuchten stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist. Eine Besonderheit von C33/CD82 ist, dass nicht nur seine Überexpression dominant Apoptose induziert, sondern dass bereits das normale Expressionsniveau Zellen für wenigstens einen spezifischen proapoptotischen Stimulus sensitiviert. Im Fall dieser Arbeit war dies Cycloheximid, welches stellvertretend für weitere applizierbare und möglicherweise therapeutisch verwendbare Stimuli stehen könnte. Vielleicht existiert auch ein Cycloheximid entsprechender endogener Stimulus, der wie Cycloheximid ausschließlich in C33/CD82-positiven Zellen Apoptose auslöst. Die in dieser Arbeit entdeckten Fähigkeiten von C33/CD82, dominant Apoptose zu induzieren und Zellen für Apoptoseinduktion zu sensitivieren, sind neue Eigenschaften des Metastasensuppressors C33/CD82, die zu der in vivo beobachteten, in der Literatur vielfach beschriebenen Metastasensuppression beitragen können.

96 Der hepatische Ischämie-Reperfusionsschaden stellt ein relevantes klinisches Problem nach Lebertransplantation und Leberteilresektion sowie nach hämorrhagischem Schock dar. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, daß Thrombozyten an der Ausbildung des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens beteiligt sind. Bislang liegt jedoch keine Studie vor, in welcher die Mechanismen der Interaktion von Thrombozyten mit dem postischämischen hepatischen Endothel in vivo analysiert wurden. Insbesondere ist nicht geklärt, inwiefern diese Interaktion die Induktion und den Schweregrad des hepatozellulären Schadens beeinflußt. Ziele der Studie waren daher (1) die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion nach hepatischer I/R mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie systematisch in Abhängigkeit von der Ischämie- und Reperfusionszeit quantitativ zu analysieren, (2) zu untersuchen, welche Mechanismen die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion in der Leber vermitteln und (3) zu analysieren, welchen Einfluß diese Interaktion auf den Ischämie-Reperfusionsschaden der Leber hat. An einem etablierten murinen Modell der warmen hepatischen Ischämie-Reperfusion wurde die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion mittels intravitaler Videofluoreszenzmikroskopie untersucht. Thrombozyten wurden von separaten syngenen Spendertieren isoliert, ex vivo mit Rhodamin-6G markiert, intravenös zu den jeweiligen Reperfusionszeitpunkten appliziert und bezüglich ihrer Interaktion mit dem Endothel der hepatischen Mikrogefäße quantitativ analysiert. Zur begleitenden Analyse des hepatischen Ischämie-Reperfusionsschadens wurden die sinusoidale Perfusionsrate, die Aktivität der Leberenzyme GOT/GPT im Serum und die Apoptosemarker Caspase-3- Aktivität und Anzahl TUNEL-positiver Zellen im Lebergewebe bestimmt. Durch Verwendung P-Selektin-defizienter Tiere (sowohl Thrombozytenspender als auch Thrombozytenempfänger) wurde die Rolle von endothelialem vs. thrombozytärem PSelektin für die Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion untersucht. Des weiteren wurde versucht, durch Applikation eines Fibrinogen-Antikörpers die differentielle Bedeutung von Thrombozyten im Vergleich zu Leukozyten an der Ausbildung des Organschadens der Leber nach I/R in vivo aufklären. Es konnte gezeigt werden, daß hepatische Ischämie-Reperfusion eine Interaktion von Thrombozyten mit dem Endothel in präsinusoidalen Arteriolen, Sinusoiden und postsinusoidalen Venolen induzierte. Das Ausmaß dieser Interaktion war von der Ischämiedauer abhängig, während hingegen die Reperfusionsdauer keinen wesentlichen Einfluß hatte. Die vermehrte Thrombozytenadhäsion ging mit einem signifikanten Anstieg des mikrovaskulären und zellulären Organschadens einher. Untersuchungen an P-Selektin-defizienten Tieren demonstrierten, daß das endotheliale und nicht das thrombozytäre P-Selektin das Rollen und die nachfolgende Adhärenz von Thrombozyten in Arteriolen und Venolen der Leber vermittelte. Darüberhinaus war der postischämische Organschaden in P-Selektin-defizienten Tieren signifikant reduziert. Mittels der Blockade von Fibrinogen während der Reperfusionsphase konnte gezeigt werden, daß Fibrin(ogen) die postischämische Thrombozytenadhäsion vermittelte, an der Leukozytenadhärenz jedoch nicht beteiligt war. Die selektive Hemmung der Thrombozyten-Endothelzell-Interaktion führte zu einer signifikanten Reduktion des mikrovaskulären Schadens sowie der Apoptoseinduktion in der Leber nach Ischämie- Reperfusion. Somit demonstriert diese Studie erstmals in vivo, daß den Thrombozyten bei der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens eine wichtige Bedeutung zukommt.

Die vorliegende Arbeit wurde durch den SFB 369 (Teilprojekt B7) unterstützt. Sie sollte auf Basis der bereits vorliegenden Erkenntnisse klären, welcher Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Ajoen in HL-60 Zellen zu Grunde liegt. Dirsch et al. 5 zeigten bereits 1998, dass Ajoen Apoptose in humanen akut-myeloischen Leukämiezellen (HL-60) induziert. Weiterhin zeigte sich eine dosis- und zeitabhängige Produktion der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N-Acetylcystein (NAC), ein Antioxidans, verhinderte partiell die Ajoeninduzierte ROS-Produktion und die Apoptose. Auf dieser Grundlage konnten folgende Ergebnisse erarbeitet werden: 1) Ajoen verursacht in HL-60 Zellen die Aktivierung der Caspase-3 sowie der Caspase-8. Eine generelle Aktivierung von Caspasen ist für die Ajoen-induzierte Apoptose nötig, da der Breitbandcaspaseinhibitor z-VAD-fmk die durch Ajoen provozierte DNA-Fragmentation völlig verhindert. 2) Die Ajoen-induzierte Apoptose wird nicht durch den Todesrezeptor CD95 vermittelt. Dafür sprechen folgende Ergebnisse: a) Unsere HL-60 Zellen exprimieren den CD95-Rezeptor, jedoch kann der natürliche CD95-Ligand (CD95L) keine Apoptose hervorrufen. Wahrscheinlich ist der CD95-Rezeptor inaktiv. b) Außerdem kann für die Caspase-8, die für die Signalweiterleitung vom CD95-Rezeptor u.a. mit verantwortlich ist, durch Einsatz eines spezifischen Caspase-8 Inhibitors keine Bedeutung für die Ajoeninduzierten Apoptose gezeigt werden. c) CD95-resistente Jurkat Zellen (JurkatR) sind auf Ajoen genauso empfindlich wie die Kontrollzellen. 3) Es konnte bewiesen werden, dass Ajoen Apoptose über den mitochondrialen Signalweg induziert: a) Ajoen verursacht sowohl den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials der inneren Membran als auch eine Cytochrom c- Freisetzung aus dem intermembranären Spalt. b) Die Ajoen-induzierte Apoptose hängt von der provozierten mitochondrialen Dysfunktion ab: HL-60 Zellen, die das anti-apoptotische Protein Bcl-xL überexprimieren, sind vor Apoptose geschützt. c) Die höhere Sensitivität der HL-60/neo bzw. die niedrigere Sensitivität der HL-60/bcl-xL Zellen auf Ajoen konnte auch morphologisch durch TEM-Untersuchungen untermauert werden. Zusammenfassend konnte also für die Ajoen-induzierte Apoptose eine von Mitochondrien abhängige Signalweiterleitung gezeigt werden. 4) Untersuchungen zur Frage, wie es zur Ajoen-induzierten mitochondrialen Dysfunktion kommt, brachten folgende Erkenntnisse: a) Eine Aktivierung von Caspasen ist für die Auslösung der mitochondrialen Ereignisse nicht notwendig. Die abgeschwächte und verzögerte Caspaseaktivierung in HL-60/bcl-xL Zellen beweist: Caspasen werden „downstream“ der mitochondrialen „Aktivierung“ gespalten. b) Die ROS-Entstehung ist ein Ereignis vor („upstream“) der mitochondrialen Dysfunktion. c) Die folgerichtige Untersuchung der MAPK JNK, p38 und ERK1/2 (die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 war bereits bekannt), ergab deren Aktivierung, jedoch ist diese für die Signalvermittlung nicht nötig. Nur für die ERK1/2 Kinase konnte eine direkte Beteiligung, und zwar als „survival“-Faktor, festgestellt werden, während die Akt als „survival“- Faktor keine Bedeutung hat. Ergebnisübersicht: CD95 Caspase-8 ROS p 38 MAPK ERK1/2 JNK Akt DNA- Fragmentierung Apoptose Caspase-3 Caspase-8 Aktivierung Caspase-3- ähnlicherCaspasen z-VAD-fmk Cytochrom c- Freisetzung z-VAD-fmk AP-1 Extrinsischer intrinsischer Signalweg Signalweg Bcl-xL Ajoen Abb. 61: Ergebnisübersicht Rot:-- Involvierung im Signalweg, blau:-- kein kausaler Zusammenhang gegeben; –I = Hemmung.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.