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Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Eine akkurate DNA-Replikation ist notwendig, um die Stabilität der genetischen Information zu gewährleisten. Dieser Prozess wird durch DNA-Läsionen erschwert, die durch eine Vielzahl von Ursachen entstehen und häufig nicht vor dem Erreichen der S-Phase repariert werden können. Nicht nur kann durch Läsionen geschädigte DNA häufig nicht dupliziert werden, angehaltene Replikationsgabeln können auch zusammenbrechen und so zu DNA-Strangbrüchen führen. Die Funktion des RAD6-pathways liegt darin, die Umgehung (Bypass) von DNA-Läsionen während der Replikation zu ermöglichen, wodurch eine Toleranz gegenüber Schädigungen der DNA erreicht wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation des RAD6-vermittelten Bypass von DNA-Läsionen durch posttranslationale Ubiquitin- und SUMO-Modifikationen des Replikationsfaktors PCNA untersucht. PCNA bildet einen trimeren Ring um die DNA und verstärkt durch Bindung der replikativen Polymerase deren Assoziation zur DNA und somit die Prozessivität der Replikation. Als DNA gebundener Faktor des Replikations-komplexes ohne katalytische Aktivität ist PCNA ideal geeignet, um durch seine Modifikation Replikations-assoziierte Prozesse zu regulieren. Die Ubiquitinierung von PCNA durch Enzyme des RAD6-pathways erfolgt als spezifische Antwort auf DNA-Läsionen während der Replikation und ermöglicht deren Bypass. Dabei bewirken unterschiedliche Ubiquitin-Modifikationen verschiedene Arten des Bypass. Die Mono-Ubiquitin-Modifikation führt zum Einsatz von speziellen Transläsions-Polymerasen, die eine größere Toleranz für geschädigte DNA haben, aber auch für die Entstehung von Mutationen verantwortlich sind. Einen mechanistisch anderen Bypass von DNA-Schäden bewirkt die Modifikation von PCNA mit einer Lysin K63-verknüpften Multi-Ubiquitinkette. Für diesen wird wahrscheinlich der neureplizierte, unbeschädigte Schwester-Strang als Vorlage benutzt. Unabhängig von Schädigungen der DNA wird PCNA während der S-Phase zusätzlich mit dem ubiquitin-ähnlichen Protein SUMO modifiziert. Dies führt zu einer Interaktion mit der Helikase Srs2, die als Antagonist zu dem zentralen Rekombinationsprotein Rad51 wirkt. Dadurch wird spezfisch die homologe Rekombination zwischen Schwesterchromatiden an der Rekombinationsgabel inhibiert, nicht jedoch andere Rekombinationsereignisse, wie. z.B. Rekom-bination zwischen homologen Chromosomen. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass spezifisch die Replikationsgabel durch PCNA-SUMO-Srs2 geschützt wird, um schädliche Rekombination oder Rekombinationsstrukturen zu vermeiden, die mit Replikations-assoziierten Prozessen interferieren. Ubiquitin- und SUMO-Modifikation regulieren demnach unabhängige Prozesse. Interessanterweise haben diese aber eine verwandte Funktion im Bypass von DNA-Läsionen während der Replikation. Die Inhibition der Schwesterchromatid-Rekombination durch PCNA-SUMO-Srs2 lenkt den Bypass von DNA-Läsionen in einen durch PCNA-Ubiquitinierung gesteuerten Mechanismus.

Ziel dieser Arbeit war es, durch die Untersuchung verschiedener Cisplatinanaloga zum einen Substanzen zu finden, die aufgrund ihrer cytotoxischen Wirkung antitumoraktiv sein könnten. Zum anderen sollte durch den Vergleich cytotoxischer und weniger cytotoxischer Verbindungen untersucht werden, ob die Aufnahme in die Zellen, die Bindung an DNA und den damit verbundenen Sekundärstrukturveränderungen, die Reparatur der DNA-Addukte und die koordinative Bindung von Proteinen an DNA über die Platinkomplexe die Cytotoxizität beeinflussen. Die Cytotoxizitätsuntersuchungen haben gezeigt, dass zwar viele der untersuchten Verbindungen [(1a), (8), (11), (12) und (13)] als inaktiv einzustufen sind, einige aber zeigten eine leichte [(9), (10), (14) und (15)] bis starke cytotoxische Wirkung (16). Da alle untersuchten Cisplatinanaloga Chelatliganden aufweisen, führt eine Verbrückung der Aminliganden allein nicht zu einer Erhöhung der Cytotoxizität. Die Verknüpfung zweier cis-Platineinheiten führte überwiegend zu geringen Cytotoxizitäten. Für die untersuchten Alkyl-bis-ethylendiaminplatin( II)-Verbindungen (11) – (14) nahm die cytotoxische Wirkung mit dem Abstand der Platinsphären zu. Die schwache Wirkung der Bisplatinkomplexe ist wahrscheinlich überwiegend auf die DMSO-Solvolyse zurückzuführen, die auch die Cytotoxizität von Cisplatin stark vermindert. Dementsprechend zeigten der wasserlösliche Platin(IV)-Komplexe (9) eine stärkere Cytotoxizität als der analoge Platin(II)-Komplex (8). Andererseits war der Chelatkomplex (16) des sterisch anspruchsvollen Anilin-4Hisochinolin-liganden trotz der Solvolyse in DMSO am wirkungsvollsten. Durch den Vergleich der unterschiedlichen Platinkomplexe konnte gezeigt werden, dass eine eingeschränkte Korrelation zwischen Zellaufnahme, der Bindung an zelluläre DNA und der Cytotoxizität existiert, dass aber beide Prozesse nicht allein ausschlaggebend für die großen Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen Komplexe sein können. Eigenschaften, die die Zellaufnahme verbessern, wie z.B. die erhöhte Lipophilie mit zunehmender Länge der Alkylkette in den Alkyl-bis-ethylendiaminplatin(II)-Verbindungen (11) – (14), könnten die Cytotoxizität positiv beeinflussen. Die Vergleiche der Platinkomplexe haben zudem gezeigt, dass sich weder anhand der Platinmenge in den Zellen, noch anhand der Adduktmenge an zellulärer DNA auf die zu erwartende oder resultierende Cytotoxizität der jeweiligen Verbindung schließen läßt. So gibt es z.B. Verbindungen, die zwar vermehrt in die Zellen aufgenommen werden oder mehr DNA-Addukte bilden und dennoch weniger cytotoxisch sind, als Komplexe, die in geringerem Maße in den Zellen bzw. an DNA gebunden sind. Ebensowenig läßt sich anhand der Cytotoxizität auf die Komplexmenge in den Zellen bzw. an zellulärer DNA schließen. Die unterschiedlichen Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur und die Kinetiken der Interstrangverknüpfungen ermöglichen Rückschlüsse auf die Art der Addukte der jeweiligen Komplexe. So verlangsamt die Solvolyse in DMSO die Ausbildung bifunktionaler Addukte innerhalb einer Platinsphäre. Die Bisplatinverbindungen [(8), (9), (11), (12), (13) und (14)] drillen aufgrund von ligandenvermittelten bifunktionalen Addukten die DNA dennoch teilweise schneller als Cisplatin (1) auf und bilden mehr Interstrangverknüpfungen aus als Cisplatin (1). Da die meisten dieser Bisplatinverbindungen [(8), (11), (12) und (13)] aber in L1210 Zellen nur wenig cytotoxisch waren, kann daraus die Schlußfolgerung gezogen werden, dass weder das Ausbilden von mehr Interstrangverknüpfungen noch stärkeres Aufdrillen der DNA für die Cytotoxizität der Platinkomplexe verantwortlich ist. Nachdem auch die Verkürzung durch nicht-periodische Biegungen der DNA sowohl bei inaktiven oder wenig cytotoxischen Verbindungen [(10), (11) und (15)] als auch bei dem wirkungsvollen Cisplatin (1) beobachtet wurde, sind DNA-Biegungen an sich auch nicht ausreichend als Erklärung für die Cytotoxiziät. Eine Möglichkeit wäre, dass lokales Aufschmelzen der DNAStränge bzw. eine erhöhte Flexibiltät der DNA,133 die mit den angewendeten Methoden nicht detektiert werden können, die Wirkung der Addukte zusätzlich moduliert. Eine Sonderstellung nehmen die Platin(IV)-Verbindungen (9) und (10) ein, da sie DNA-Strangbrüche erzeugen. DNA-Strangbrüche stellen einen zusätzlichen Schaden neben dem eigentlichen Platinaddukt dar und könnten evtl. über einen anderen Mechanismus zum Zelltod führen. Als weitere Ursache für die unterschiedlichen cytotoxischen Wirkungen der Platinkomplexe wurde auch die Reparatur der DNA-Addukte in vitro untersucht. Dabei waren die Unterschiede in der Reparatur der Platinaddukte an DNA geringer als das Auflösungsvermögen des DNA-Reparatursynthesetests. Eventuelle Unterschiede in der Reparatur der Platinkomplexe sind auf jeden Fall so gering, dass sie nicht für die deutlichen Cytotoxizitätsunterschiede verantwortlich gemacht werden können. Es muß allerdings eingeschränkt werden, dass zwar prinzipiell die Reparaturenzyme alle untersuchten Addukte gleich effizient reparieren können, aber die tatsächliche Reparatur in Zellen durch Transkriptions- gekoppelte Reparatur oder induzierte Reparaturaktivität dominiert werden könnnte. Während der Behandlung von platinierter DNA mit Zellextrakten wurden ein Teil der an die DNA Addukte gebundenen Proteine über ein Platinatom koordinativ mit der DNA verknüpft. Dabei wurden die meisten DNA-Proteinquervernetzungen für inaktive Komplexe gefunden. Dabei handelt es sich um die tetrafunktionalen Bisplatinkomplexe und Platin(II)-Komplexe nach der Solvolyse in DMSO mit Ausnahme von Anilin-4H-isochinolinplatin(II) (16). Offenbar führt die größere Zahl freier Bindungsstellen zu mehr koordinativen Verknüpfungen von Proteinen an DNA. Aus den gewonnenen Erkenntnissen wurde zur Erklärung der unterschiedlichen Cytotoxizität der verschiedenen Komplexe folgendes Modell vorgeschlagen: Cisplatinanaloga bilden zuerst monofunktionale Addukte aus. Eine koordinative Bindung von Proteinen kann die Weiterreaktion zu bifunktionalen DNA-Addukten verhindern. Die monofunktionalen Addukte werden entweder toleriert oder repariert und sind dementsprechend nicht cytotoxisch. Wenigstens ein Teil der bifunktionalen Addukte wirkt dagegen, wahrscheinlich auch über induzierte Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur, cytotoxisch. Die langsame Ausbildung von bifunktionalen DNA-Addukten bzw. eine größere Zahl von DNAProteinquervernetzungen vermindert dementsprechend die Cytotoxizität. Je schneller sich also bifunktionale DNA-Addukte ausbilden bzw. je höher der Anteil an bifunktionalen Addukten ist, umso cytotoxischer ist der entsprechende Platinkomplex. Das in dieser Arbeit beschriebene Anilin-4H-isochinolinplatin(II) (16) ist ein vielversprechender Kandidat für die Tumortherpie, da es keine DNA-Proteinquervernetzungen ausbildet, deutliche Unterschiede in den induzierten DNA-Sekundärstrukturveränderungen zu Cisplatin (1) zeigt und stark cytotoxisch wirkt.