Podcasts about zellextrakten

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

Das von (Licitra and Liu, 1996) entwickelte Hefe-3-Hybrid-System ermöglicht die in vivo Identifikation von Ligand-Rezeptor-Interaktionen. Es ist eine Weiterentwicklung des klassischen Hefe-2-Hybrid-Systems und beinhaltet den Einsatz eines synthetischen Hybridmoleküls. Der feste Bestandteil dieses Hybridmoleküls ist das Hormon Dexamethason, das über die Hormon-bindende Domäne des Glukokorticoidrezeptors in der Hefezelle verankert wird und kovalent mit einem Molekül verbunden ist, für das der Interaktionspartner gesucht wird. Ziel dieser Arbeit war es, das Hefe-3-Hybrid-System im Labor zu etablieren und das System zur Identifikation neuer Interaktionspartner für das Immunsuppressivum FK506 einzusetzen. Um das Hefe-3-Hybrid-System sensitiver zu gestalten, wurde zunächst der ABC-Transporter PDR5 deletiert, der an dem Export von Steroidhormonen beteiligt ist. Dabei wurde gezeigt, daß der Pdr5-Transporter auch chemisch modifizierte Steroidhormone wie beispielsweise Dexamethason-Linker transportiert. Darüberhinaus wurden zwei Aminosäurepositionen innerhalb der Hormon-bindenden Domäne des Glukokorticoidrezeptors identifiziert, die entscheidend zur die Aktivierbarkeit des Rezeptors beitragen. Im Rahmen des durchgeführten 3-Hybrid-Screens wurde zusätzlich zu dem bekannten FK506- Bindeprotein, FKBP12, eine unbekannte, C-terminal verkürzte Spleißvariante von Antizym- Inhibitor als neuer Interaktor für FK506 identifiziert. Die Interaktion war FK506-spezifisch, da keine Interaktion mit anderen an Dexamethason gekoppelten Liganden nachzuweisen war. Die im 3-Hybrid-Screen isolierte Spleißvariante wurde zusätzlich über RT-PCR amplifiziert, wobei noch eine weitere Spleißform von Antizym-Inhibitor identifiziert werden konnte. Es wurde gezeigt, daß beide Formen ubiquitär exprimiert werden und Homologe in der Maus existieren. Antizym-Inhibitor ist an der Regulation der Polyaminbiosynthese beteiligt. Polyamine spielen für das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und die Proteinbiosynthese eine essentielle Rolle. Die Aktivität von Antizym-Inhibitor wird anhand seiner Fähigkeit bestimmt, Ornithin- Decarboxylase (ODC, EC 4.1.1.17) aus dem inhibitorischen Komplex mit Antizym freizusetzen. Die freigesetzte ODC-Aktivität gibt somit Auskunft über die Antizym-Inhibitor- Aktivität. Bei den Antizymen handelt es sich um eine Proteinfamilie, die aus vier Mitgliedern besteht, deren Interaktion mit Antizym-Inhibitor bislang nur für Antizym 1 beschrieben ist. Für die Charakterisierung der Antizym-Inhibitor-Spleißvarianten, wurde ein nichtradioaktiver Aktivitätsassay entwickelt, der auf der funktionellen Expression von humaner ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beruht. Dabei wurde gezeigt, daß humane ODC die Deletion der Hefe-ODC (∆spe1) komplementiert und so das Hefezellwachstum auf Polyamin-freiem Medium ermöglicht. Dieser Assay erwies sich auch als geeignet für ein Hochdurchsatzverfahren (HTS) zur Identifikation von ODCInhibitoren. Die Koexpression von Antizym führte zu einer Wachstumshemmung, die auf einem Polyaminmangel beruht und durch Zugabe von Putrescin, oder durch die zusätzliche Koexpression von Antizym-Inhibitor wieder aufgehoben werden konnte. Darüber hinaus wurde ein 3-Hybrid-Assay für den Proteinkomplex aus ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor entwickelt. Hiermit wurde untersucht, inwieweit Antizym-Inhibitor die Heterodimerisierung zwischen ODC und Antizym unterbindet. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte erstmals gezeigt werden, daß Antizym-Inhibitor in der Lage ist, an alle Proteine der Antizym-Familie zu binden und ODC aus dem Komplex mit Antizym 1, 2, 3 und 4 verdrängt. Bislang war dies nur für Antizym 1 beschrieben. Desweiteren wurde für das noch nicht charakterisierte Mitglied der Antizym-Familie, Antizym 4, gezeigt, daß auch dieses an ODC bindet und die Aktivität der ODC hemmt. Die C-terminal verkürzte Spleißvariante konnte zwar an die Antizyme 1, 2 und 3 binden, war jedoch nicht der Lage, ODC aus dem Komplex freizusetzen. Um die Antizym-Bindungsdomäne von Antizym-Inhibitor weiter zu charakterisieren, wurden Fragmente hergestellt mit deren Hilfe die Antizym-Bindungsdomäne auf einen Bereich von Leucin45 bis Serin300 eingegrenzt werden konnte. Die Antizym-Bindungsdomäne überlappt dabei mit der FK506-Bindungsdomäne, die vollständige Form von Antizym-Inhibitor bindet interessanterweise nicht an FK506. Zusammengefaßt zeigt dies, daß der C-Terminus von Antizym-Inhibitor von großer Bedeutung für die Konformation des Proteins ist und einen wichtigen Beitrag zur Stabilisierung der Antizym / Antizym-Inhibitor-Interaktion leistet. Die Relevanz der in der Hefe gewonnenen Daten wurde abschließend mit HEK 293-Zellextrakten überprüft. Die Komplexbildung der transient exprimierten Proteine ODC, Antizym und Antizym-Inhibitor konnte durch Immunpräzipitation nachgewiesen werden. Damit wurde gezeigt, daß die Hefe-Daten auf höhere Organismen übertragen werden können.

Ziel dieser Arbeit war es, durch die Untersuchung verschiedener Cisplatinanaloga zum einen Substanzen zu finden, die aufgrund ihrer cytotoxischen Wirkung antitumoraktiv sein könnten. Zum anderen sollte durch den Vergleich cytotoxischer und weniger cytotoxischer Verbindungen untersucht werden, ob die Aufnahme in die Zellen, die Bindung an DNA und den damit verbundenen Sekundärstrukturveränderungen, die Reparatur der DNA-Addukte und die koordinative Bindung von Proteinen an DNA über die Platinkomplexe die Cytotoxizität beeinflussen. Die Cytotoxizitätsuntersuchungen haben gezeigt, dass zwar viele der untersuchten Verbindungen [(1a), (8), (11), (12) und (13)] als inaktiv einzustufen sind, einige aber zeigten eine leichte [(9), (10), (14) und (15)] bis starke cytotoxische Wirkung (16). Da alle untersuchten Cisplatinanaloga Chelatliganden aufweisen, führt eine Verbrückung der Aminliganden allein nicht zu einer Erhöhung der Cytotoxizität. Die Verknüpfung zweier cis-Platineinheiten führte überwiegend zu geringen Cytotoxizitäten. Für die untersuchten Alkyl-bis-ethylendiaminplatin( II)-Verbindungen (11) – (14) nahm die cytotoxische Wirkung mit dem Abstand der Platinsphären zu. Die schwache Wirkung der Bisplatinkomplexe ist wahrscheinlich überwiegend auf die DMSO-Solvolyse zurückzuführen, die auch die Cytotoxizität von Cisplatin stark vermindert. Dementsprechend zeigten der wasserlösliche Platin(IV)-Komplexe (9) eine stärkere Cytotoxizität als der analoge Platin(II)-Komplex (8). Andererseits war der Chelatkomplex (16) des sterisch anspruchsvollen Anilin-4Hisochinolin-liganden trotz der Solvolyse in DMSO am wirkungsvollsten. Durch den Vergleich der unterschiedlichen Platinkomplexe konnte gezeigt werden, dass eine eingeschränkte Korrelation zwischen Zellaufnahme, der Bindung an zelluläre DNA und der Cytotoxizität existiert, dass aber beide Prozesse nicht allein ausschlaggebend für die großen Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen Komplexe sein können. Eigenschaften, die die Zellaufnahme verbessern, wie z.B. die erhöhte Lipophilie mit zunehmender Länge der Alkylkette in den Alkyl-bis-ethylendiaminplatin(II)-Verbindungen (11) – (14), könnten die Cytotoxizität positiv beeinflussen. Die Vergleiche der Platinkomplexe haben zudem gezeigt, dass sich weder anhand der Platinmenge in den Zellen, noch anhand der Adduktmenge an zellulärer DNA auf die zu erwartende oder resultierende Cytotoxizität der jeweiligen Verbindung schließen läßt. So gibt es z.B. Verbindungen, die zwar vermehrt in die Zellen aufgenommen werden oder mehr DNA-Addukte bilden und dennoch weniger cytotoxisch sind, als Komplexe, die in geringerem Maße in den Zellen bzw. an DNA gebunden sind. Ebensowenig läßt sich anhand der Cytotoxizität auf die Komplexmenge in den Zellen bzw. an zellulärer DNA schließen. Die unterschiedlichen Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur und die Kinetiken der Interstrangverknüpfungen ermöglichen Rückschlüsse auf die Art der Addukte der jeweiligen Komplexe. So verlangsamt die Solvolyse in DMSO die Ausbildung bifunktionaler Addukte innerhalb einer Platinsphäre. Die Bisplatinverbindungen [(8), (9), (11), (12), (13) und (14)] drillen aufgrund von ligandenvermittelten bifunktionalen Addukten die DNA dennoch teilweise schneller als Cisplatin (1) auf und bilden mehr Interstrangverknüpfungen aus als Cisplatin (1). Da die meisten dieser Bisplatinverbindungen [(8), (11), (12) und (13)] aber in L1210 Zellen nur wenig cytotoxisch waren, kann daraus die Schlußfolgerung gezogen werden, dass weder das Ausbilden von mehr Interstrangverknüpfungen noch stärkeres Aufdrillen der DNA für die Cytotoxizität der Platinkomplexe verantwortlich ist. Nachdem auch die Verkürzung durch nicht-periodische Biegungen der DNA sowohl bei inaktiven oder wenig cytotoxischen Verbindungen [(10), (11) und (15)] als auch bei dem wirkungsvollen Cisplatin (1) beobachtet wurde, sind DNA-Biegungen an sich auch nicht ausreichend als Erklärung für die Cytotoxiziät. Eine Möglichkeit wäre, dass lokales Aufschmelzen der DNAStränge bzw. eine erhöhte Flexibiltät der DNA,133 die mit den angewendeten Methoden nicht detektiert werden können, die Wirkung der Addukte zusätzlich moduliert. Eine Sonderstellung nehmen die Platin(IV)-Verbindungen (9) und (10) ein, da sie DNA-Strangbrüche erzeugen. DNA-Strangbrüche stellen einen zusätzlichen Schaden neben dem eigentlichen Platinaddukt dar und könnten evtl. über einen anderen Mechanismus zum Zelltod führen. Als weitere Ursache für die unterschiedlichen cytotoxischen Wirkungen der Platinkomplexe wurde auch die Reparatur der DNA-Addukte in vitro untersucht. Dabei waren die Unterschiede in der Reparatur der Platinaddukte an DNA geringer als das Auflösungsvermögen des DNA-Reparatursynthesetests. Eventuelle Unterschiede in der Reparatur der Platinkomplexe sind auf jeden Fall so gering, dass sie nicht für die deutlichen Cytotoxizitätsunterschiede verantwortlich gemacht werden können. Es muß allerdings eingeschränkt werden, dass zwar prinzipiell die Reparaturenzyme alle untersuchten Addukte gleich effizient reparieren können, aber die tatsächliche Reparatur in Zellen durch Transkriptions- gekoppelte Reparatur oder induzierte Reparaturaktivität dominiert werden könnnte. Während der Behandlung von platinierter DNA mit Zellextrakten wurden ein Teil der an die DNA Addukte gebundenen Proteine über ein Platinatom koordinativ mit der DNA verknüpft. Dabei wurden die meisten DNA-Proteinquervernetzungen für inaktive Komplexe gefunden. Dabei handelt es sich um die tetrafunktionalen Bisplatinkomplexe und Platin(II)-Komplexe nach der Solvolyse in DMSO mit Ausnahme von Anilin-4H-isochinolinplatin(II) (16). Offenbar führt die größere Zahl freier Bindungsstellen zu mehr koordinativen Verknüpfungen von Proteinen an DNA. Aus den gewonnenen Erkenntnissen wurde zur Erklärung der unterschiedlichen Cytotoxizität der verschiedenen Komplexe folgendes Modell vorgeschlagen: Cisplatinanaloga bilden zuerst monofunktionale Addukte aus. Eine koordinative Bindung von Proteinen kann die Weiterreaktion zu bifunktionalen DNA-Addukten verhindern. Die monofunktionalen Addukte werden entweder toleriert oder repariert und sind dementsprechend nicht cytotoxisch. Wenigstens ein Teil der bifunktionalen Addukte wirkt dagegen, wahrscheinlich auch über induzierte Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur, cytotoxisch. Die langsame Ausbildung von bifunktionalen DNA-Addukten bzw. eine größere Zahl von DNAProteinquervernetzungen vermindert dementsprechend die Cytotoxizität. Je schneller sich also bifunktionale DNA-Addukte ausbilden bzw. je höher der Anteil an bifunktionalen Addukten ist, umso cytotoxischer ist der entsprechende Platinkomplex. Das in dieser Arbeit beschriebene Anilin-4H-isochinolinplatin(II) (16) ist ein vielversprechender Kandidat für die Tumortherpie, da es keine DNA-Proteinquervernetzungen ausbildet, deutliche Unterschiede in den induzierten DNA-Sekundärstrukturveränderungen zu Cisplatin (1) zeigt und stark cytotoxisch wirkt.