Podcasts about dna addukten

Wed, 14 Dec 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13840/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13840/1/Eggert_Heike.pdf Eggert, Heike

Das Oropharynxkarzinom steht in Deutschland mit einem Anteil von 3,3% an allen bösartigen Neubil¬dungen bei Männern an der siebten Stelle der Krebsneuerkrankungen. Der jahrelange Gebrauch von Tabakwaren ist ein wichtiger Risikofaktor, der durch gleichzeitige Anwendung hochprozentiger Alko¬holika multipliziert wird. In vielen westeuropäischen Industrieländern konnte eine Zunahme von Inzi¬denz und Mortalität festgestellt werden, dagegen weist Schweden die niedrigste Inzidenzrate auf. Eine mögliche Erklärung dafür wird im geringeren Anteil an Rauchern vermutet. Ein Viertel der schwe¬dischen Männer verwendet Tabak in Form des Schwedischen Kautabaks, der als Snus bekannt ist. Die tabakspezifischen Nitrosamine N'-Nitrosonornicotin (NNN) und 4 (Methylnitrosamino) 1-(3 pyri¬dyl)-1-butanon (NNK) erzeugen im Tierversuch nicht nur Tumoren im Ösophagus bzw. Lunge, Leber und Pankreas, sondern bei gemeinsamer Gabe auch in der Mundhöhle. Beide Substanzen unterliegen einer metabolischen Aktivierung, die über reaktive Zwischenstufen zu einer Pyridyloxobutylierung der DNA führen. Unter saurer Hydrolyse spalten diese Addukte 4-Hydroxy-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) ab, das nach Derivatisierung mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC-MS) nachgewie¬sen werden kann. Die Zielsetzungen der Studien mit männlichen Wistarratten waren die Bestimmung der Dosis-Wirkungs-Beziehung für die Bildung HPB-freisetzender Addukte in den Zielorganen Lunge und Leber, ausgelöst durch die Gabe von NNK und ihre Modulation durch Ethanol. Des Weiteren sollten protektive Effekte ausgewählter antioxidativer Substanzen auf die Entstehung der DNA-Addukte beur¬teilt werden. Der Vorversuch ergab, dass die 2- bis 4-wöchige Zufuhr von 1, 3 und 5 ppm NNK über das Trink¬wasser in Lunge und Leber der Ratten ausreichend hohe Konzentrationen HPB-freisetzender DNA-Addukten für die GC-MS-Bestimmung erzeugte. Für den Interaktionsversuch von NNK und Ethanol erhielten die Ratten über 4 Wochen 1 oder 5 ppm NNK alleine oder in Kombination mit 10% Ethanol über das Trinkwasser. NNK erzeugte in der Lunge doppelt so hohe HPB-Adduktwerte als in der Leber. Die 5fach höhere NNK-Konzentration führte nur zu einer Verdoppelung der Adduktkonzentrationen, eine Bestätigung für die in der Literatur berichtete Sättigung der Adduktbildung durch NNK. Die Alkoholzufuhr verminderte die Wasseraufnahme und damit die NNK-Dosis um etwa ein Drittel. Die Extrapolation auf die höhere NNK-Dosis bei alleiniger NNK-Gabe zeigt, dass die HPB-Adduktlevel in der Leber unter dem Einfluss von Ethanol deutlich geringer ausfielen. Dies spricht für eine kompetitive Hemmung der NNK-Aktivierung über CYP2E1 durch Ethanol in der Leber. Die Hemmung des Leberstoffwechsels führt zu einer höheren Verfügbar¬keit von NNK für die Lunge, in der leicht erhöhte HPB-Adduktlevel gefunden wurden. Der Chemopräventionsversuch diente der Untersuchung des Einflusses antioxidativer Substanzen auf die Schädigung der DNA in Leber- und Lungengewebe von Ratten durch 5 ppm NNK und die gemeinsame Gabe von 5 ppm NNK und 10% Ethanol 4 Wochen über das Trinkwasser. Die 5-wöchige Zufuhr der antioxidativen Substanzen über das Futter begann bereits 1 Woche vor der NNK- und Ethanolgabe in Konzentrationen von 7 g/kg Ellagsäure, 3 g/kg Chlorophyllin oder 10 g/kg Vitamin E. Bei alleiniger NNK-Gabe reduzierten alle drei Substanzen in der Reihenfolge Chlorophyllin (-41%, p Vitamin E ( 33%, p Ellagsäure (-22%; n.s.) die HPB-Addukte in der Leber. In der Lunge reduzierte nur Vitamin E signifikant die HPB-Adduktlevel (-25%, p

Die beiden tabakspezifischen Nitrosamine (TSNA) 4 (Methylnitrosamino) 1-(3 pyridyl)-1-butanon (NNK) und N'-Nitrosonornicotin (NNN) sind kanzerogene Inhaltstoffe des Tabakrauchs. NNK erzeugt im Tierversuch vor allem Tumoren in Lunge, Leber, Bauchspeicheldrüse und der Nasenhöhle. NNN führt dagegen zu Ösophagustumoren, aber auch zu Tumoren der Nasenhöhle. Unter metabolischer Aktivierung bilden beide TSNA eine reaktive Zwischenstufe, die mit Biomolekülen reagiert und nach Hydrolyse 4-Hydroxy-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) abspaltet. Nach Extraktion und Derivatisierung kann das HPB mit hoher Nachweisempfindlichkeit mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) bestimmt werden. Eine andere Quelle für diese Addukte stellt das Myosmin dar. Zwar ist es auch ein Nebenbestandteil der Alkaloidfraktion des Tabaks, aber unabhängig davon kommt es in einer Vielzahl von Nahrungsmitteln vor und kann in Plasma und Speichel des Menschen nachgewiesen werden. Myosmin bildet im sauren Milieu durch Nitrosierung bzw. Peroxidierung ebenfalls HPB-Addukte. Ähnliche Bedingungen liegen in der unteren Speiseröhre bei einer Refluxerkrankung vor. Bei einem Teil der Patienten kommt es zu einer Metaplasie der Speiseröhrenschleimhaut, dem Barrett-Ösophagus, der ein Präkanzerose darstellt, und aus dem sich pro Jahr bei 1-2% der Patienten ein ösophageales Adenokarzinoms (EAC) entwickelt. Das EAC zeigt vor allem in westlichen Industriestaaten eine stark steigende Inzidenzrate. Hauptrisikofaktoren für die Entstehung eines EAC sind neben dem Barrett-Ösophagus das männliche Geschlecht, Übergewicht und eine gemüse-/obstarme Ernährung bzw. der übermäßige Verzehr von tierischen Fetten. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Rolle von HPB-abspaltenden DNA-Addukten in Biopsien der unteren Speiseröhre für das Krankheitsbild, insbesondere der Sequenz Reflux, gastroösophageale Refluxkrankheit (GERD), Barrett, EAC und der mögliche Beitrag des Rauchens und der Myosminbelastung durch die Ernährung. Im Rahmen einer endoskopischen Untersuchung erhielten wir von nüchternen Patienten zwei Biopsien der Ösophagusschleimhaut oral and aboral der magennahen Läsion für die Bestimmung der DNA-Addukte und eine Blutprobe zur Bestimmung der Myosmin- und Cotininkonzentration. Zusätzlich wurden die Teilnehmer gebeten einen Fragebogen zu Lebens- und Ernährungsgewohnheiten auszufüllen. Vorrangiges Ziel war zunächst die Verbesserung der bestehenden analytischen Methoden. Bei der Bestimmung der Plasmakonzentration der Nicotinoide konnte durch Verwendung einer Mischpolymer-Festphase der Zeit- und Materialaufwand deutlich reduziert werden. Insgesamt nahmen 92 Patienten an der Studie teil, wobei von 84 Teilnehmern auch die HPB-Addukte und Plasmakonzentrationen bestimmt werden konnten. Die Konzentration der HPB-Addukte in Schleimhautbiopsien der unteren Speiseröhre war mit 4,75 pmol/mg deutlich höher als zuvor berichtete Adduktlevel von Gewebeproben, die im Rahmen von Autopsien gewonnen worden waren und auch untere Schichten der Ösophaguswand einschlossen. Insgesamt ergab sich keine Abhängigkeit der Adduktkonzentration vom Geschlecht oder Rauchstatus. In der Sequenz Reflux, GERD, Barrett, EAC zeigten Patienten mit Reflux eine deutliche Tendenz zu höheren Werten. Bei Patienten, die häufig unter Sodbrennen leiden, war die Konzentration der HPB-Addukte gegenüber symptomfreien Patienten signifikant erhöht. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese der Bildung von HPB-Addukten aus Myosmin in der unteren Speiseröhre. Hinsichtlich der Ernährungsgewohnheiten zeigten sich wenige Auffälligkeiten. Lediglich bei häufigem Verzehr von scharfen Speisen und nusshaltigen Lebensmitteln und bei regelmäßigem Alkoholkonsum zeigte sich eine Tendenz zu höheren Adduktwerten. Beim Milchkonsum verhielt es sich umgekehrt, der häufigere Verzehr führte zu einer Erniedrigung der HPB-Konzentration an der DNA. Die Myosminkonzentration im Plasma der nüchternen Patienten hatte aufgrund der anzunehmenden kurzen Halbwertszeit von Myosmin nur eine geringe Aussagekraft. Es bestand keine Korrelation mit den HPB-Addukten und auch keine Abhängigkeit vom Rauchstatus, während regelmäßiger Alkoholkonsum die Konzentration von Myosmin signifikant erhöhte.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Lokalanästhetikum Prilocain als mögliche Quelle für die Belastung des Menschen mit o-Toluidin. In diesem Zusammenhang wurden bei insgesamt 23 Patienten der Poliklinik München Hämoglobin (Hb)-Addukte von o-Toluidin und 4-Aminobiphenyl (4-ABP) 24 Stunden vor und nach s.c. Injektion von Prilocain untersucht. Dabei erhielten 20 Patienten 100 mg Prilocain, je ein Patient 50, 120 bzw. 200 mg Prilocain. Zusätzlich erhielten 6 freiwillige, gesunde Probanden der Uniklinik Regensburg („Prilotstudie“) 100 mg s.c. gespritzt. Von diesen Probanden wurde außer den Blutproben für die Bestimmung von Hb-Addukten auch Urinproben jeweils 24 Stunden vor und nach der Injektion zur Bestimmung der DNA-Addukte in den Urothelien gesammelt. Die Bestimmung der Hämoglobin- und DNA-Addukte erfolgte per GC-MS im NCI-Modus. Die Ergebnisse zeigen bei allen Probanden, die 100 mg Prilocain erhileten, einen deutlichen Anstieg der Hb-Addukte in Abhängigkeit von Prilocain. Bei den drei Patienten mit anderer Prilocaindosis stiegen die Hb-Addukte dosisabhängig in vergleichbarem Ausmaß an. Die Hb-Addukte von 4-ABP zeigten keine Abhängigkeit von Prilocain. Bei den Rauchern der HNO-Studie waren die Hb-Addukte von 4-ABP gegenüber den Nichtrauchern erwartungsgemäß signifikant erhöht. Dagegen zeigte sich für die Hb-Addukte von o-Toluidin keinerlei Abhängigkeit vom Raucherstatus. Erstmals konnten im Rahmen dieser Arbeit neben DNA-Addukten von 4-ABP auch DNA-Addukte von o-Toluidin im Harnblasenepithel des Menschen nachgewiesen werden. Die Werte für die DNA-Addukte von o-Toluidin vor der Prilocaingabe waren dabei niedriger als nach der Injektion. Allerdings erreichte der Anstieg nicht Signifikanzniveau . Bei der Bestimmung der DNA-Addukte von 4-ABP konnten wie bei den Hb-Addukten keine Unterschiede in Abhängigkeit von Prilocain festgestellt werden.

Die vorliegende Arbeit untersucht die Genotoxizität des Tabakalkaloids Myosmin mit Hilfe des Comet-Assays in der humanen Ösophagus-Adenokarzinomzelllinie OE33. Der Comet-Assay weist in seiner alkalischen Form Einzel- und Doppelstrangbrüche der DNA, sowie alkalilabile Stellen und DNA-Fragmente, die bei der Excisionsreparatur entstehen nach. Als wichtigster Risikofaktor für die Entstehung von Adenokarzinomen im Ösophagus gilt der Barrett-Ösophagus, bei dem es durch Reflux von Säure und Duodenalinhalten aus dem Magen zu Entzündungen kommt. Um die so im Ösophagus auftretenden Bedingungen abzubilden, wurden die OE33-Zellen zum einen bei sauren pH-Werten mit Myosmin allein oder gleichzeitig mit Myosmin und verschiedenen reaktiven Spezies behandelt. Dies führte zu einer Steigerung der durch Myosmin verursachten, im Comet-Assay nachweisbaren DNA-Schäden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Myosmin die Reparatur methylierter DNA in OE33-Zellen hemmt. Die genotoxische Wirkung von Myosmin beruht wahrscheinlich auf der Induktion von 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) freisetzenden DNA-Addukten. Diese Addukte werden außerdem von den als kanzerogen für den Menschen eingestuften Tabakspezifischen Nitrosaminen 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) und Nitrosonornicotin (NNN) verursacht. Myosmin kann zum einen zu NNN nitrosiert werden, das nach metabolischer Aktivierung HBP-Addukte verursachen kann. Darüber hinaus kann es durch Nitrosierung bzw. Peroxidierung aber auch direkt zu reaktiven Metaboliten umgesetzt werden, die HPB-Addukte bilden.

Ziel dieser Arbeit war es, durch die Untersuchung verschiedener Cisplatinanaloga zum einen Substanzen zu finden, die aufgrund ihrer cytotoxischen Wirkung antitumoraktiv sein könnten. Zum anderen sollte durch den Vergleich cytotoxischer und weniger cytotoxischer Verbindungen untersucht werden, ob die Aufnahme in die Zellen, die Bindung an DNA und den damit verbundenen Sekundärstrukturveränderungen, die Reparatur der DNA-Addukte und die koordinative Bindung von Proteinen an DNA über die Platinkomplexe die Cytotoxizität beeinflussen. Die Cytotoxizitätsuntersuchungen haben gezeigt, dass zwar viele der untersuchten Verbindungen [(1a), (8), (11), (12) und (13)] als inaktiv einzustufen sind, einige aber zeigten eine leichte [(9), (10), (14) und (15)] bis starke cytotoxische Wirkung (16). Da alle untersuchten Cisplatinanaloga Chelatliganden aufweisen, führt eine Verbrückung der Aminliganden allein nicht zu einer Erhöhung der Cytotoxizität. Die Verknüpfung zweier cis-Platineinheiten führte überwiegend zu geringen Cytotoxizitäten. Für die untersuchten Alkyl-bis-ethylendiaminplatin( II)-Verbindungen (11) – (14) nahm die cytotoxische Wirkung mit dem Abstand der Platinsphären zu. Die schwache Wirkung der Bisplatinkomplexe ist wahrscheinlich überwiegend auf die DMSO-Solvolyse zurückzuführen, die auch die Cytotoxizität von Cisplatin stark vermindert. Dementsprechend zeigten der wasserlösliche Platin(IV)-Komplexe (9) eine stärkere Cytotoxizität als der analoge Platin(II)-Komplex (8). Andererseits war der Chelatkomplex (16) des sterisch anspruchsvollen Anilin-4Hisochinolin-liganden trotz der Solvolyse in DMSO am wirkungsvollsten. Durch den Vergleich der unterschiedlichen Platinkomplexe konnte gezeigt werden, dass eine eingeschränkte Korrelation zwischen Zellaufnahme, der Bindung an zelluläre DNA und der Cytotoxizität existiert, dass aber beide Prozesse nicht allein ausschlaggebend für die großen Unterschiede in der Wirkung der verschiedenen Komplexe sein können. Eigenschaften, die die Zellaufnahme verbessern, wie z.B. die erhöhte Lipophilie mit zunehmender Länge der Alkylkette in den Alkyl-bis-ethylendiaminplatin(II)-Verbindungen (11) – (14), könnten die Cytotoxizität positiv beeinflussen. Die Vergleiche der Platinkomplexe haben zudem gezeigt, dass sich weder anhand der Platinmenge in den Zellen, noch anhand der Adduktmenge an zellulärer DNA auf die zu erwartende oder resultierende Cytotoxizität der jeweiligen Verbindung schließen läßt. So gibt es z.B. Verbindungen, die zwar vermehrt in die Zellen aufgenommen werden oder mehr DNA-Addukte bilden und dennoch weniger cytotoxisch sind, als Komplexe, die in geringerem Maße in den Zellen bzw. an DNA gebunden sind. Ebensowenig läßt sich anhand der Cytotoxizität auf die Komplexmenge in den Zellen bzw. an zellulärer DNA schließen. Die unterschiedlichen Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur und die Kinetiken der Interstrangverknüpfungen ermöglichen Rückschlüsse auf die Art der Addukte der jeweiligen Komplexe. So verlangsamt die Solvolyse in DMSO die Ausbildung bifunktionaler Addukte innerhalb einer Platinsphäre. Die Bisplatinverbindungen [(8), (9), (11), (12), (13) und (14)] drillen aufgrund von ligandenvermittelten bifunktionalen Addukten die DNA dennoch teilweise schneller als Cisplatin (1) auf und bilden mehr Interstrangverknüpfungen aus als Cisplatin (1). Da die meisten dieser Bisplatinverbindungen [(8), (11), (12) und (13)] aber in L1210 Zellen nur wenig cytotoxisch waren, kann daraus die Schlußfolgerung gezogen werden, dass weder das Ausbilden von mehr Interstrangverknüpfungen noch stärkeres Aufdrillen der DNA für die Cytotoxizität der Platinkomplexe verantwortlich ist. Nachdem auch die Verkürzung durch nicht-periodische Biegungen der DNA sowohl bei inaktiven oder wenig cytotoxischen Verbindungen [(10), (11) und (15)] als auch bei dem wirkungsvollen Cisplatin (1) beobachtet wurde, sind DNA-Biegungen an sich auch nicht ausreichend als Erklärung für die Cytotoxiziät. Eine Möglichkeit wäre, dass lokales Aufschmelzen der DNAStränge bzw. eine erhöhte Flexibiltät der DNA,133 die mit den angewendeten Methoden nicht detektiert werden können, die Wirkung der Addukte zusätzlich moduliert. Eine Sonderstellung nehmen die Platin(IV)-Verbindungen (9) und (10) ein, da sie DNA-Strangbrüche erzeugen. DNA-Strangbrüche stellen einen zusätzlichen Schaden neben dem eigentlichen Platinaddukt dar und könnten evtl. über einen anderen Mechanismus zum Zelltod führen. Als weitere Ursache für die unterschiedlichen cytotoxischen Wirkungen der Platinkomplexe wurde auch die Reparatur der DNA-Addukte in vitro untersucht. Dabei waren die Unterschiede in der Reparatur der Platinaddukte an DNA geringer als das Auflösungsvermögen des DNA-Reparatursynthesetests. Eventuelle Unterschiede in der Reparatur der Platinkomplexe sind auf jeden Fall so gering, dass sie nicht für die deutlichen Cytotoxizitätsunterschiede verantwortlich gemacht werden können. Es muß allerdings eingeschränkt werden, dass zwar prinzipiell die Reparaturenzyme alle untersuchten Addukte gleich effizient reparieren können, aber die tatsächliche Reparatur in Zellen durch Transkriptions- gekoppelte Reparatur oder induzierte Reparaturaktivität dominiert werden könnnte. Während der Behandlung von platinierter DNA mit Zellextrakten wurden ein Teil der an die DNA Addukte gebundenen Proteine über ein Platinatom koordinativ mit der DNA verknüpft. Dabei wurden die meisten DNA-Proteinquervernetzungen für inaktive Komplexe gefunden. Dabei handelt es sich um die tetrafunktionalen Bisplatinkomplexe und Platin(II)-Komplexe nach der Solvolyse in DMSO mit Ausnahme von Anilin-4H-isochinolinplatin(II) (16). Offenbar führt die größere Zahl freier Bindungsstellen zu mehr koordinativen Verknüpfungen von Proteinen an DNA. Aus den gewonnenen Erkenntnissen wurde zur Erklärung der unterschiedlichen Cytotoxizität der verschiedenen Komplexe folgendes Modell vorgeschlagen: Cisplatinanaloga bilden zuerst monofunktionale Addukte aus. Eine koordinative Bindung von Proteinen kann die Weiterreaktion zu bifunktionalen DNA-Addukten verhindern. Die monofunktionalen Addukte werden entweder toleriert oder repariert und sind dementsprechend nicht cytotoxisch. Wenigstens ein Teil der bifunktionalen Addukte wirkt dagegen, wahrscheinlich auch über induzierte Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur, cytotoxisch. Die langsame Ausbildung von bifunktionalen DNA-Addukten bzw. eine größere Zahl von DNAProteinquervernetzungen vermindert dementsprechend die Cytotoxizität. Je schneller sich also bifunktionale DNA-Addukte ausbilden bzw. je höher der Anteil an bifunktionalen Addukten ist, umso cytotoxischer ist der entsprechende Platinkomplex. Das in dieser Arbeit beschriebene Anilin-4H-isochinolinplatin(II) (16) ist ein vielversprechender Kandidat für die Tumortherpie, da es keine DNA-Proteinquervernetzungen ausbildet, deutliche Unterschiede in den induzierten DNA-Sekundärstrukturveränderungen zu Cisplatin (1) zeigt und stark cytotoxisch wirkt.