Podcasts about tochterzellen

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Willkommen in der Welt der Biologie! Mein Name ist Alia Korth und heute geht es um Mitose. Als Mitose bezeichnet man den Vorgang der Zellteilung bei Zellen, die einen Zellkern besitzen. Aus einer Mutterzelle werden also zwei Tochterzellen. Man teilt die Mitose in die folgenden 5 Phasen ein: In der Interphase werden die Chromosomen, also die DNS, verdoppelt. Während der Prophase ziehen sich die Chromatidfäden zusammen, es entstehen Paare, die von einem sich bildenden Zentromer zusammen gehalten werden. Anschließend wandern die Zentriolen zu den Polen, also den gegenüberliegenden Seiten des Zellkerns. Nun löst sich die Wand des Zellkerns auf. Im Anschluss daran kommt die Metaphase, in welcher sich die Chromosomen an der Äquatorialebene, der Mitte des Zellkerns, ausrichten. Es bilden sich Spindelfasern, welche zu den Zentromeren wandern. In dem Moment, in dem die Chromatiden der Chromosome auseinander gezogen werden, beginnt die Anaphase. Darauf folgend, in der Telophase, bildet sich die Zellwand des Zellkerns wieder, die Zentriolen bauen sich ab und die Äquatorialebene zieht sich zusammen. Es entstehen zwei Tochterzellen. Die eigentliche Mitose ist nun abgeschlossen, nun wachsen die Tochterzellen. Dies nennt man Zytokinese. Für die Phasen der Mitose gibt es verschiedene Merksprüche. Ich finde den Spruch “Ich pauke Mitose alle Tage.” am einfachsten, die Anfangsbuchstaben der Worte sind die Anfangsbuchstaben der einzelnen Phasen. Wenn euch die vielen Fachbegriffe, die wir in dieser Folge nicht alle ausführlich erklären konnten, teilweise noch nicht klar sind, dann schaut doch einfach in unserem Glossar auf www.in2minuten.com nach. Dort haben wir alle unklaren Begriffe noch mal kurz erklärt. Wenn ihr noch Fragen oder Anregungen habt, dann schreibt mir einfach eine E-Mail an biologie@in2minuten.com. Weitere “in 2 Minuten” Podcasts findet ihr auch im Internet unter www.in2minuten.com. Vielen Dank für’s Zuhören und bis zum nächsten Mal!

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Antikörpern und ihrer immunsuppressiven Wirkung im präklinischen Hundemodell. Dazu wurde eine T-Zelldepletionsmethode mit dem caninen CD6-Antikörper MT-606 und Kaninchen-komplement zur alleinigen GvHD-Prophylaxe bei der allogenen Knochenmark-transplantation entwickelt. Zusätzlich sollten die regulatorischen Eigenschaften von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in vitro in der gemischten Lymphozytenkultur untersucht werden. Mit Hilfe des kreuzreagierenden Antikörpers MT-606, der das canine CD6-Antigen erkennt, konnte eine einfache und kostengünstige Depletionsmethode etabliert werden, welche die Fähigkeit des CD6-Antikörpers MT-606 zur Aktivierung der Komplement-kaskade ausnützt. Es wurde zunächst durch in vitro-Experimente gezeigt, dass die Methode mit MT-606 und Kaninchenkomplement eine effektive Depletion der CD6-positiven Zellen gewährleistet, wohin gegen die hämatopoetischen Stammzellen unangetastet bleiben. Die CD6-Depletion geht einher mit einer nahezu vollständigen Depletion der CD4-positiven Zellen, während die CD8-positiven Zellen nur teilweise depletiert werden. Durch drei Knochenmarktransplantationen im homo-hetero-System und zwei im DLA-identischen System wurde gezeigt, dass sich die CD6-Depletion als alleinige Methode zur GvHD-Prophylaxe eignet. Die Etablierung einer Toleranz gegenüber dem Spenderorganismus wurde durch eine Hauttransplantation vom Spender auf den Empfänger bei einem Hund gezeigt. Regelmäßige Analysen des Spenderchimärismus konnten zeigen, dass die Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark eine langfristige Erholung des hämatopoetischen Systems garantiert. In mehreren in vitro-Experimenten sollte die regulatorische Fähigkeit von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in der gemischten Lymphozytenkultur (MLC) untersucht werden. Die MLC ist eine Kurzzeit-Suspensionskultur, die es erlaubt, die Reaktivität von T-Zellen eines Spenders gegen die durch Bestrahlung inaktivierten PBMCs eines anderen Spenders zu untersuchen. Die Lymphozytenproliferation oder ihre eventuelle Inhibition können durch den Einbau von radioaktiv markiertem Thymidin oder durch die Weitergabe des Farbstoffs CFSE von der Mutter- auf die Tochterzellen quantifiziert werden. Trotz Anwendung unterschiedlicher Analysesysteme konnte kein supprimierender Effekt von CD6-depletierten Knochenmarkzellen auf die Lymphozytenproliferation in der gemischten Lymphozytenkultur nachgewiesen werden. In einigen Fällen wirkten die CD6-depletierten Knochenmarkzellen sogar stimulierend auf die Proliferation der Lymphozyten. Um die generelle Anwendbarkeit des verwendeten MLC-Systems zum Nachweis von supprimierenden Eigenschaften einer Zellpopulation zu zeigen, wurden mesenchymale Stammzellen an Stelle von CD6-depletierten Knochenmarkzellen eingesetzt. Diese bewiesen eine hohe Potenz zur Unterdrückung der Lymphozytenproliferation in der MLC. Trotz offensichtlicher Wirkung bei der GvHD-Prophylaxe konnte ein regulatorischer Effekt von CD6-depletierten Knochenmarkzellen in der MLC nicht gezeigt werden, obwohl das System durchaus zum Nachweis von supprimierenden Eigenschaften anderer Zellen geeignet ist. In einer zweiten Reihe von Transplantationen wurde untersucht, ob durch zusätzliche Transfusion von Spenderlymphozyten (DLT) nach der Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark im Empfänger eine GvHD induziert werden kann. Der Zeitpunkt der DLT variierte bei den einzelnen Transplantationen, es wurde aber immer eine Zelldosis von ca. 1 ∙ 108 MNCs/kg Körpergewicht transfundiert. Bei je einem Hund konnte durch DLT an den Tagen 3, 14 oder 20 eine GvHD induziert werden, deren Hauptmanifestationsort bei zwei Hunden die Leber und bei einem Hund die Haut war. Bei einer Wiederholung des Transplantationsschemas mit DLT an Tag 20 konnte bei einem weiteren Hund keine GvHD induziert werden. Offensichtlich bestand zu diesem Zeitpunkt bereits eine Toleranz gegenüber dem Spenderorganismus. Das etablierte System mit Transplantation von CD6-depletiertem Knochenmark und DLT vor Tag 20 zur Induktion einer GvHD eignet sich hervorragend, um die Einsetzbarkeit von HSV-TK-transduzierten Zellen zur Gentherapie zu testen. Dies wird Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.

Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.