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Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Das Vulvakarzinom und seine Vorstufen sind seltene Krankheitsbilder. Die operative Therapie ist Methode der Wahl beim Vulvakarzinom. Sie ist allerdings mit hohen postoperativen Komplikationen und psychosexuellen Problemen belastet. Probleme bei der Behandlung von vulvären intraepithelialen Neoplasien stellen vor allem die hohe Rezidivrate und das Risiko einer Karzinomentstehung dar. So ist es sowohl für die Therapie des Vulvakarzinoms als auch seiner Vorstufen wünschenswert, verlässliche Parameter zu finden, die eine Aussage über den wahrscheinlichen Verlauf der Krankheit erlauben und damit auch eine individualisierte, risikoadaptierte Therapie ermöglichen können. In der vorliegenden Arbeit sollten neben klinischen und histologischen Merkmalen insbesondere der immunhistologische Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette im Hinblick auf die Prognose der vulvären intraepithelialen Neoplasie (VIN III) und des Plattenepithelkarzinoms der Vulva untersucht werden. Der immunhistochemische Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette wurde gewählt, da für diesen Marker bisher keine Ergebnisse an tumorösen Veränderungen der Vulva vorliegen. Die laminin-5-gamma-2 Kette wird von invasiv wachsenden Zellen unterschiedlicher Tumoren im Zytoplasma exprimiert (Adenokarzinome des Dickdarms, des Magens und der Brust sowie Plattenepithelkarzinome der Zervix und der Mundhöhle). Dabei konnte ein Zusammenhang zwischen einer Überexprimierung der laminin-5-gamma-2 Kette und geringer Gewebedifferenzierung, größerer Tiefeninfiltration, dem Auftreten von Metastasen und einer schlechteren Überlebensprognose nachgewiesen werden. Folgende Fragestellungen sollten bei den Patientinnen mit VIN beurteilt werden: 1. Sind die bekannten histologischen Parameter mit dem Auftreten von Rezidiven assoziiert? 2. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit den bekannten histologischen Parametern assoziiert? 3. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit dem Auftreten von Rezidiven assoziiert? 4. Kann mit der immunhistologischen Anfärbung der laminin-5-gamma-2 Kette die frühe Invasivität nachgewiesen werden? Folgende Fragestellungen sollten bei Patientinnen mit Plattenepithelkarzinom der Vulva bearbeitet werden: 1. Sind die bekannten histologischen Parameter mit dem Lymphknotenbefall, dem Auftreten von Rezidiven und dem Gesamtüberleben assoziiert? 2. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit den bekannten histologischen Parametern assoziiert? 3. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit dem Lymphknotenbefall, dem Auftreten von Rezidiven und dem Gesamtüberleben assoziiert? Nach einem festgelegten Merkmalkatalog wurden die anamnestischen und therapeutischen Daten aus den Krankenunteralgen der Patientinnen entnommen. Die histologischen Parameter wurden anhand von Hämatoxylin-Eosin gefärbten Großflächenschnitten erhoben. Für den immunhistologischen Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette wurden die Gewebeblöcke herausgesucht, um neue Schnitte anzufertigen, die mit Hilfe der Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC) und 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) gefärbt wurden. Die Auswertung erfolgte semiquantitativ mit Abschätzung des Anteils der gefärbten Zellen an der Gesamtzahl der Tumorzellen in Prozent. Die statistische Analyse erfolgte univariat durch Prüfung auf Signifikanz mit dem χ2-Tests oder – wenn erforderlich – mit dem exakten Test nach Fisher. Die Überlebenskurven (rezidivfreies Überleben, Gesamtüberleben) wurden nach der Kaplan-Meier-Methode errechnet und mit dem Log-Rank-Test auf signifikante Unterschiede geprüft. Ein derartiger Unterschied wurde bei p-Werten kleiner 0,05 angenommen. Die retrospektive Studie umfasste zwei Patientengruppen: • 88 Patientinnen mit VIN aus der Zeit von 1991 bis 2002 • 155 Patientinnen mit Plattenepithelkarzinom der Vulva von 1987 bis 2002 Alle Patientinnen wurden im angegebenen Zeitraum an der I. Frauenklinik der Universität München, Maistraße, behandelt. Für die Patientinnen mit VIN zeigte nur das histologische Merkmal „Entfernung in sano / non in sano“ einen statistisch auffälligen Unterschied im rezidivfreien Überleben. Alle anderen histologischen Merkmale, einschließlich des immunhistologischen Nachweises der laminin-5-gamma-2 Expression, zeigten keinen Zusammenhang mit der Häufigkeit von Rezidiven. Bei den Patientinnen mit Plattenepithelkarzinom der Vulva korrelierten folgende histologischen Merkmale statistisch auffällig mit Nachweis von inguinalen Lymphknotenmetastasen: Infiltrationstiefe, Anzahl der Mitosen, Differenzierungsgrad, Lymphangiosis carcinomatosa und lokales Tumorstadium (pT). Der immunhistologische Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette zeigte hingegen keine Assoziation zur lymphatischen Metastasierung. Das lokale Tumorstadium (pT) und die Entfernung in sano zeigten eine statistisch auffällige Korrelation mit der Rezidivhäufigkeit: 100% Rezidive bei pT3 versus 34% bei pT1 und pT2. 60% Rezidive bei Entfernung non in sano versus 31% bei Entfernung in sano. Neben diesen beiden Merkmalen zeigten auch die Infiltrationstiefe und der Nachweis von inguinalen Metastasen einen statistisch auffälligen Unterschied im rezidivfreien Überleben. Karzinome, die laminin-5-gamma-2 exprimierten, zeigten sowohl häufiger Rezidive als auch eine kürzere mittlere rezidivfreie Zeit. Ein statistisch auffälliger Unterschied im Gesamtüberleben ließ sich in Abhängigkeit von folgenden histologischen Merkmalen nachweisen: Infiltrationstiefe, Grading, Lymphangiosis und Hämangiosis carcinomatosa, lokales Tumorstadium (pT), inguinaler Lymphknotenstatus sowie Karzinomentfernung im Gesunden. Patientinnen, deren Karzinome laminin-5-gamma-2 exprimierten, hatten ein deutlich schlechteres Gesamtüberleben gegenüber Patientinnen, deren Karzinome keine Expression aufwiesen (5-Jahresüberlebensrate 97% versus 68%). Weiter konnten folgende Ergebnisse beobachtet werden: Laminin-5-gamma-2 war vor allem in Tumorzellen an der Tumor-Stroma-Grenze positiv nachweisbar. Karzinome mit ungünstigen histologischen Parametern (Infiltrationstiefe > 1mm, G2 oder G3, Lymphangiosis und Hämangiosis carcinomatosa) zeigten häufiger positive Ergebnisse für die laminin-5-gamma-2 Färbung. Rezidive traten häufiger bei laminin-5-gamma-2 exprimierenden Tumoren auf. Die Überlebenszeit war kürzer bei Patientinnen, deren Vulvakarzinom laminin-5-gamma-2 exprimieren. Aus diesen zunächst univariat gewonnenen Ergebnissen lassen sich folgende vorläufige Schlüsse ziehen: 1. der Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette hat für die Prognose der vulvären intraepithelialen Neoplasie keine Bedeutung. 2. Die Expression der laminin-5-gamma-2 Kette scheint mit einem aggressiveren Tumortyp und damit einer schlechteren Prognose des Vulvakarzinoms verbunden zu sein. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zu überprüfen, welche Bedeutung die immunhistologische Darstellung der laminin-5-gamma-2 Kette in der Prognose der vulvären intraepithelialen Neoplasie und des Vulvakarzinoms hat. Auf Grund der hier gewonnenen univariaten Ergebnisse scheinen weitere Untersuchungen mit multivariater Analyse und an größeren Patientenkollektiven sicher sinnvoll. So könnte in Zukunft vielleicht die immunhistologische Färbung mit dem laminin-5-gamma-2 Antikörper zusammen mit histologischen Untersuchungen eine genauere Einschätzung der Prognose erlauben und zur individuellen, tumoradaptierten Therapie beitragen.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Identifikation und Lokalisation eines ATP-abhängigen Kaliumkanals (KATP) in isolierten humanen Granulosazellen und im humanen Ovar. In RT-PCR- und Western Blot-Experimenten zeigte sich, dass dieser in humanen GZ von IVF-Patientinnen ohne und mit PCOS aus den Untereinheiten Kir 6.1 und SUR 2B besteht. Die Proteine der KATP-Untereinheiten in kultivierten humanen GZ ließen sich in immunzytochemischen Färbungen mit Antikörpern, die gegen die Kir 6.1- und die SUR 2B-Untereinheit gerichtet waren, nachweisen. Immungoldfärbungen mit anschließender elektronenmikroskopischer Betrachtung zeigten, dass sich der KATP in der Plasmamembran humaner GZ befindet, nicht jedoch in Mitochondrien. Dies ergab sich auch in funktionellen Untersuchungen, in denen Diazoxid und Glibenclamid keine Wirkung auf das mitochondriale Membranpotential hatten. Der KATP, der aus den Untereinheiten Kir 6.1 und SUR 2B zusammengesetzt ist, entspricht dem Subtyp des KATP-Kanals, der typischerweise im glatten Muskel in Gefäßen vorkommt. Die elektrophysiologischen Eigenschaften des KATP wurden durch Einzelkanalmessungen untersucht und ergaben, dass der beschriebene Kanal alle charakteristischen Merkmale eines KATP aufweist, nämlich eine Leitfähigkeit von etwa 44 pS, Einwärtsgleichrichtung und eine Regulation durch Nukleotide. Neben der Charakterisierung des KATP auf Einzelkanalebene wurde auch das Ansprechen des Kanals auf KATP-Öffner und -Inhibitoren in Whole-Cell-Messungen und durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Der KATP spricht auf den KATP-Inhibitor Glibenclamid an, was zu einer Depolarisation der Plasmamembran führt. Somit ist der KATP der erste Kanaltyp in humanen GZ, für den eine Rolle bei der Regulation des Membranpotentials gezeigt werden konnte. Es ergaben sich Hinweise darauf, dass der KATP-Inhibitor Glibenclamid Auswirkungen auf die Expression des für die Östradiolsynthese wichtigen Enzyms Aromatase hat. Des Weiteren führte das Schließen des KATP durch Glibenclamid zu einer Senkung der hCG-induzierten Progesteronproduktion, der Hauptaufgabe der Granulosalutealzellen. Zur Klärung des zugrundeliegenden Mechanismus wurde der Einfluss des KATP auf verschiedene Syntheseschritte der Progesteronproduktion und die daran beteiligten Enzyme untersucht. Es konnte jedoch weder für das Enzym StAR noch für die Enzyme SCC und 3β-HSD eine Veränderung der Expression durch die Behandlung humaner GZ mit den KATP-Modulatoren Diazoxid und Glibenclamid nachgewiesen werden. Bei der Betrachtung von Ultradünnschnitten im Elektronenmikroskop zeigten sich in humanen GZ, die mit hCG und Glibenclamid behandelt worden waren, weniger Lipidtröpfchen als nach der Behandlung mit hCG und DMSO. Zudem traten unter hCG und Glibenclamid vermehrt Mitosen und Apoptose auf, aber es bleibt unklar, wie sich dies auf die Progesteronproduktion auswirkt. Diese Effekte von Glibenclamid auf den KATP bzw. das Membranpotential einerseits und auf die hCG-induzierte Progesteronproduktion in humanen GZ andererseits legt einen Zusammenhang zwischen der KATP-Aktivität und der Steroidhormonsynthese in humanen GZ nahe. Der Mechanismus dieses Effekts bleibt aber noch zu klären. Da der KATP in humanen GZ vorkommt und einen potentiellen Angriffspunkt für pharmakologische Wirkstoffe darstellt, sollte er als möglicher Auslöser eventuell noch nicht berücksichtigter Wirkungen im Ovar weiter untersucht werden.

Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der bovinen Eileiterepithelzellen ex vivo und in Suspensionskultur. Ein Schwerpunkt meiner Arbeit bezüglich des bovinen Eileiters ex vivo lag bei den zyklischen Veränderungen des Eileiterepithels, über die bisher wenig präzise Daten vorlagen. Die Ampulla und der Isthmus wurden sowohl bei den Untersuchungen ex vivo als auch in der Zellkultur getrennt betrachtet. Es wurde deutlich, dass das Epithel der Ampulla stärkere morphologische Veränderungen während des Zyklus aufweist, als das Epithel des Isthmus. So war im Epithel der Ampulla die Bildung von Protrusionen zu beobachten, die abhängig vom Zyklusstadium verschiedenen Inhalt aufweisen. Die maximale Höhe des Epithels wurde in beiden Eileiterabschnitten im Östrus erreicht. Im Isthmus war das Epithel jedoch etwas niedriger als in der Ampulla. Im Metöstrus war die stärkste sekretorische Aktivität zu verzeichnen. Dies zeigte insbesondere die massive Ansammlung von sekretorischen Granula unter der apikalen Zytoplasmamembran. Nur in diesem Stadium konnte auch Exozytose der Granula beobachtet werden. Eine Veränderung der Anteile zilientragender und sekretorischer Zellen im Epithel, wie sie bei anderen Spezies beschrieben wurde, konnte beim Rindereileiter nicht festgestellt werden. Meine elektronenmikroskopischen Ergebnisse zeigen, dass beim Rind zumindest ein partieller Zilienverlust im Eileiter stattfindet. Durch die massiven Protrusionen der sekretorischen Zellen werden die Zilienbüschel außerdem im Diöstrus zur Seite gedrängt und teilweise verdeckt. Dadurch kann der Eindruck entstehen, dass die Anzahl der zilientragenden Zellen im Diöstrus abnimmt. Im bovinen Eileiterepithel wurde eine nur sehr geringe Mitoserate festgestellt, die in den verschiedenen Zyklusstadien kaum variiert. Sowohl in der Zellkultur als auch im Eileiterepithel ex vivo konnten Mitosen ausschließlich bei nicht-zilientragenden Zellen beobachtet werden. Die Zilien der Sphäroidzellen wiesen nach außen und waren während der gesamten Kultivierung vorhanden. Demnach blieb die Polarisierung der Epithelzellen erhalten. Dies sind Indize dafür, dass die Zellen einer nur geringen Dedifferenzierung während der Kultur unterliegen. Die sekretorische Aktivität der kultivierten Epithelzellen erscheint aber beeinträchtigt. Während sich die sekretorischen Granula bis zum 3. Kulturtag unter der apikalen Zellmembran ansammelten, waren sie am 5. Kulturtag bereits großflächig im apikalen Zytoplasma verteilt und an späteren Kulturtagen nur noch vereinzelt vorhanden. Da die sekretorische Funktion jedoch essentiell für die embryo-maternale Kommunikation ist, scheint die Suspensionskultur nur mit frisch isolierten Eileiterepithelzellen sinnvoll zu sein. Als weiteres Anzeichen einer Dedifferenzierung in Kultur ist die reduzierte Expression der Rezeptoren für Progesteron und Östrogen zu interpretieren. Nach diesen Ergebnissen sind die Sphäroiden in den ersten drei Kulturtagen für eine Kokultur geeignet, da sie während dieser Zeit nur leichte Anzeichen einer Dedifferenzierung aufweisen. Auch die physiologische Aufenthaltszeit des Embryos im Eileiter beträgt ungefähr drei Tage. Demnach scheint die Suspensionskultur als Kurzzeitmodell für eine Kokultur mit Embryonen gut geeignet zu sein.