Podcasts about resistenztestung

Zur Beurteilung der Resistenzlage aerober Bakterien des Wirtschaftsgeflügels wurden von September 2006 bis April 2008 insgesamt 2462 bakterielle Isolate aus Routineuntersuchungen von Organ- und Tupferproben auf deren in-vitro-Resistenzverhalten gegenüber antibiotischen Wirkstoffen hin untersucht. Von den erfassten Bakterienstämmen stammten 2227 von Mastküken oder Broilern, und die übrigen von Legehennenküken, Legehennen, Peking- und Moschusenten. Mit dem Agardiffusionstest erfolgte eine qualitative Beurteilung der Keime als resistent, intermediär oder sensibel. Von einem Teil dieser Bakterien wurde parallel hierzu die Antibiotikaempfindlichkeit mittels Bouillon-Mikrodilution bestimmt. Dabei wurden die entsprechenden MHK-Werte erhoben und beurteilt. Die qualitativen Ergebnisse beider Testmethoden wurden verglichen. Die Testdurchführung erfolgte auf der Grundlage von CLSI-Vorgaben. Im Ergebnis konnte ein Überblick über die aktuelle Antibiotikaempfindlichkeit bakterieller Keime des Wirtschaftsgeflügels im Einzugsbereich der Klinik für Vögel der LMU München erhoben werden. Unterschiede zu Ergebnissen anderweitiger Untersuchungen in Deutschland sind teilweise gegeben; so ergab sich in der vorliegenden Arbeit aus der MHK-Bestimmung für E. coli mit jeweils knapp 60 % sensiblen Isolaten eine höhere Resistenz gegenüber Enrofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxacol, während sich Staph. aureus mit jeweils fast 80 % sensiblen Isolaten als deutlich empfindlicher gegenüber Ampicillin und Penicillin erwies. Es zeigt sich daher die Notwendigkeit Klinik- oder ggf. Praxiseigener Monitoring-programme, um den behandelnden TieräztInnen für eine antibiotische Erst- oder Notfallbehandlung von Geflügelbestände eine geeignete Entscheidungsgrundlage geben und damit den Anforderungen an einen vernünftigen Antibiotikaeinsatz gerecht werden zu können. Ampicillin und Penicillin zeigten die breiteste Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien. Über 85 % der untersuchten Keime waren empfindlich gegenüber diesen Antibiotika. Bei gramnegativen Keimen erwies sich Colistin als das am häufigsten wirksame Antibiotikum, mehr als 94 % der Isolate wurden als sensibel beurteilt. Die Resistenzlage vieler Bakterien des Geflügels stellte sich jedoch als relativ unsicher heraus. Daher sind Resistenztests für eine wirksame antibiotische Behandlung von Nutzgeflügelbeständen unabdingbar. Nur so kann ein falscher oder unnötiger Antibiotikaeinsatz vermieden und der Verbraucher vor resistenten Keimen tierischer Herkunft geschützt werden. Im Vergleich beider Testmethoden unterschieden sich die qualitativen Ergebnisse in 13,8 % der Fälle. In 9 % der Fälle lag ein kleiner Fehler (minor error) vor. Aufgrund der guten Korrelation der Ergebnisse wird gefolgert, dass sich beide Methoden gleichermaßen für die Resistenztestung bakterieller Keime des Geflügels eignen und einen Platz in der Routine- und Notfalldiagnostik haben. Die Problematik fehlender geflügelspezifischer Grenzwerte ist unabhängig von der Methode vorhanden. Die Bouillon-Mikrodilution zur Erhebung quantitativer und vergleichbarer MHK-Werte stellt aber die Methode der Wahl für das Resistenzmonitoring dar. Dabei sollte jedoch beachtet werden, dass eine möglichst große Anzahl an Konzentrationsstufen getestet werden sollte, da die erhobenen MHK-Werte zum Teil über einen großen Bereich verteilt lagen.

In der vorliegenden Arbeit wurde basierend auf der genotypischen Charakterisierung von Stämmen des Mycobacterium tuberculosis - Komplexes anhand des gyrA-Gens mit Hilfe einer auf dem LightCycler® System basierenden gyrA Real-time-PCR ein neuartiges Testverfahren zur Bestimmung von Chinolonresistenzen konzipiert und etabliert. Bei der Evaluierung des Testverfahrens mit 13 phänotypisch resistenten Stämmen mit einer MHK ≥ 4 µg/ml für Ciprofloxacin zeigten 9 Stämme bei der Schmelzpunktanalyse einen eine Mutation anzeigenden Shift des Tm’s, 2 weitere wiesen die typische Schmelzkurve einer Heteroresistenz auf. Die Sequenzierung ergab, dass 5 dieser Stämme eine Mutation des Codon 90 (Ala→Val, GCG→GTG) und 6 Stämme eine Mutation des Codons 94 (Asp→Gly, GAC→GGC) aufwiesen. Die beiden verbliebenen Stämme hatten den Schmelzpunkt des Wildtyps, der durch die Sequenzierung bestätigt werden konnte. Die molekularepidemiologische Unabhängigkeit der resistenten Stämme wurde durch das IS6110 Fingerprinting bestätigt. 44 phänotypisch sensible Stämme wiesen ebenfalls den Tm des Wildtyps auf. Damit besitzt das Testverfahren für den Nachweis von Chinolonresistenzen eine Sensitivität von 85% und eine Spezifität von 100%. Die Speziesspezifität wurde anhand von 7 typischen und 16 atypischen Mykobakterien sowie humanen DNA-Präparationen und Sputumproben überprüft, wobei sich eine Amplifikation nur bei Mitgliedern des M.tb. - Komplexes fand. Das Testverfahren ist somit hochspezifisch für den Mycobacterium tuberculosis - Komplex. Der Test wurde für die Bestimmung von der Primärkultur und für den Direktnachweis aus dem Sputum evaluiert. Der Nachweis von Mykobakterien direkt aus dem Sputum mit dem Testverfahren ist mit 103 KBE/ml eine Größenordnung sensitiver als die Mikroskopie. Das Testergebnis liegt in der Regel innerhalb eines Tages vor. Für die Testdurchführung und die Testauswertung wurden Standardprotokolle erstellt. Anhand einer kritischen Evaluation der Primärliteratur konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konkordanz von über 90% zwischen höhergradigen Chinolonresistenzen (MHK ≥ 4 µg/ml) und Mutationen des gyrA-Gens besteht. Die Informationen aus der phänotypischen und der genotypischen Resistenztestung sollte genutzt werden, um die beiden Verfahren gegenseitig zu evaluieren. So sprechen die bisherigen molekularbiologischen Daten für den von der WHO vorgeschlagenen Grenzwert von >2µg/ml bei der phänotypischen Resistenzbestimmung. Anhand von klinischen Studien sollte die Grenzwertsetzung überprüft und vor allem der Nutzen der Techniken für den Patienten evaluiert werden. Chinolone haben eine stark zunehmende Bedeutung bei der Behandlung der Tuberkulose und werden bisher vor allem bei der Behandlung der MDR-Tuberkulose eingesetzt. In mehreren klinischen Studien wird derzeit auch der Einsatz von Gyrasehemmern der neusten Generation als Standardmedikament untersucht. Hiervon verspricht man sich insbesondere eine Verkürzung und eine bessere Verträglichkeit der Therapie. Sollten sich die Chinolone als First Line Medikament zur Behandlung der Tuberkulose durchsetzten, könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte auf dem LightCycler® System basierende gyrA Real-time-PCR aufgrund der schnellen Resistenzbestimmung innerhalb eines Tages dem Kliniker entscheidende Hinweise für die primäre Einleitung einer effektiven Therapie geben.

Die vorliegende Untersuchung sollte die Rolle von Bakterien aus Schweinegülle im Zusammenhang mit dem humanrelevanten phänotypischen und genotypischen Resistenzgeschehen objektivieren. Hierzu wurde untersucht, ob und in welchem Umfang Bakterien in Schweinegülle zum Zeitpunkt des Ausbringens Resistenzen gegen ausgewählte veterinärmedizinische, vor allem aber gegen humantherapeutisch relevante antimikrobielle Wirkstoffe exprimieren. Zudem wurden die Gehalte an ausgewählten Tetrazyklin-Resistenzgenen erhoben und unter Einbeziehung verschiedener Einflussfaktoren, darunter auch des Tetrazyklin-Gehaltes der Gülle, verglichen. Zu diesen Zwecken wurden 306 Gülleproben mit bekanntem Antibiotikagehalt aus bayerischen Schweinehaltenden Betrieben mikrobiologisch-kulturellen Untersuchungen einschließlich der phänotypischen Resistenztestung der Isolate gegenüber bis zu 29 human-relevanten Wirkstoffen im Mikrodilutionsverfahren unterzogen. Das quantitative Vorkommen der Tetrazyklin-Resistenzgene tet(M), tet(O) und tet(B) in 115 der Gülleproben wurde mittels RealTime-PCR nach Direkt-Extraktion der DNA erhoben. 380 Gülleproben wurden auf das Vorkommen von Salmonella spp. untersucht. Verglichen mit den deutschlandweit erhobenen Daten zu human-klinischen Isolaten (GENARS-Projekt) lag der Prozentsatz resistenter Bakterienisolate aus Gülle in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle unter den humanmedizinischen Resistenzraten. Eine Ausnahme bildete Doxycyclin (als Vertreter der Tetrazykline) mit bis zu 20 % höherem Resistenzaufkommen in der Gülle, was mit dem weit verbreiteten Einsatz der Tetrazykline in der Nutztierhaltung begründet werden kann. Die Resistenz gegen Reserve-Antibiotika lag bei E. coli zwischen 0 und 2 %; im Einzelfall höher bei Enterokokken. Glykopeptid-resistente Enterokokken traten nicht auf. Es zeichnete sich übereinstimmend ein signifikanter Einfluss der Betriebsgröße auf die Resistenzparameter ab, mit höheren Resistenzraten in größeren Betrieben aller Betriebsformen. Abhängig davon, ob in der Gülle der Nachweis eines oder mehrerer Antibiotika (Tetrazykline, Sulfonamide) gelang, stiegen die Resistenzraten für mehrere Substanz-Keim-Paarungen. Von dieser Entwicklung sind neben veterinärmedizinischen Wirkstoffen, die im Antibiotika-Monitoring tatsächlich nachgewiesen worden waren, auch andere – teils veterinärmedizinisch nicht zugelassene – Wirksubstanzen betroffen, darunter auch solche, deren restriktive Handhabung empfohlen wird (Fluorquinolone, Synercid). Die Zahl der Gülleproben, die hochmehrfach-resistente Bakterien beherbergten, war zwischen antibiotikafreien und antibiotikahaltigen Proben nicht signifikant verschieden. Jedoch differierte der Prozentsatz hochmehrfach-resistenter Isolate nach Tetrazyklin-Gehalt. Zudem exprimierte der Querschnitt aller Isolate innerhalb einer Gülle mit hochmehrfach-resistenten Keime in nachweislich antibiotikahaltigen Proben signifikant mehr Antibiotikaresistenzen, verglichen mit analytisch negativen Proben. Bei der Verfütterung therapeutischer Chlortetrazyklin-Konzentrationen an Schweine konnte ein Anstieg der Gene tet(M) und tet(O) in den Faeces nachgewiesen werden. Quantitative Untersuchungen zum Vorkommen der Resistenzgene tet(M) und tet(O) in Praxisgülle zeigten einen signifikanten Anstieg der Resistenzgen-Gehalte bereits im Konzentrationsbereich ab 0,1 mg Tetrazyklin/kg Gülle (Summe der untersuchten Tetrazykline: Chlortetrazyklin, Tetrazyklin, Oxytetracyclin und Doxycyclin) gegenüber Tetrazyklin-„freier“ Gülle. Der Anteil der Resistenzgene, der sich nach Düngung mit Chlortetrazyklin-haltiger Gülle im Boden wiederfand, war erheblich geringer als die in Gülle gefundenen Gehalte; die maximalen nach CTC-Gülle-Düngung im Boden gefundenen tet(M)-Konzentrationen betrugen nur etwa 0,3 % der durchschnittlichen Gehalte in Gülle und erreichten in Ackerland bis zu einer Woche nach Ausbringung Maximalwerte von 480 000 copies/g. Ab Woche 3 nach Begüllung gab es keinerlei positive Befunde. Im Grünland waren die tet-Resistenzdeterminanten nach initialen Maximalwerten um 10 000 copies/g Boden nach sieben Wochen noch in Konzentrationen bis 100 copies/g nachzuweisen; nach 12 Wochen war jedoch keines der untersuchten Gene mehr detektierbar.