Podcasts about tetrazyklin

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und indu-ziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der Wachstumstransformation stellt ein Modellsystem dar, das die pathogenen Mechanismen in der Tumorentsteh-ung widerspiegelt. Die Epstein-Barr Virus nukleären Antigene 3A und 3C (EBNA-3A und EBNA-3C) werden in Publikationen aus dem Zeitraum von 1993 bis 1996 als essentiell für den Prozess der B-Zellimmortalisierung eingestuft. In dieser Arbeit wurde mit einer neuen Technologie, der Maxi-EBV Methode, die Rolle der EBNA-3A und -3C Proteine erneut untersucht. Sowohl mit EBNA-3A negativen als auch mit EBNA-3C negativen Viren konnten erstmals Kulturen von infizierten B-Zellen etabliert werden. Während sich aus EBNA-3A negativen B-Zellkulturen Langzeitkulturen etablieren ließen, starben EBNA-3C negative B-Zellkulturen in der Regel nach 40-70 Tagen ab. Die Effizienz der B-Zellimmortalisierung von EBNA-3A negativen Viren war im Vergleich zur Wildtyp infizierten B-Zellen 24-fach, die der EBNA-3C negativen Viren 140-fach erniedrigt. Sowohl EBNA-3A negative, als auch EBNA-3C negative LCLs sind in ihrer Viabilität eingeschränkt, weisen jedoch unveränderte Zellteilungsraten auf. Die weitere Charakterisierung der EBNA-3A negativen LCLs ergab, dass diese eine Variante des viralen LMP1-Proteins exprimieren. Offen blieb, ob diese Variante das Auswachsen der EBNA-3A negativen B-Zellkulturen begünstigt hat. In der Folge wurden die EBNA-3A negativen LCLs zur Identifizierung von EBNA-3A-Zielgenen eingesetzt und zahlreiche aktivierte und reprimierte Kandidatengene identifiziert. Eines dieser Kandidatengene, Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP-7), das durch EBNA-3A induziert wird, wurde im Rahmen dieser Arbeit validiert. Auch mit EBNA-3C negative Viren konnten wider Erwarten LCLs erzeugt werden, die für einen begrenzten Zeitraum in Kultur gehalten werden können. Aus dem Material eines Spenders war es auch möglich, EBNA-3C negative Langzeitkulturen zu etablieren. Die Mehrzahl der EBNA-3C negativen infizierten B-Zellkulturen durchlaufen jedoch zwischen Tag 40 und 70 eine Krise und sterben. Mit der Generierung eines konditionalen EBNA-3C Systems, durch Transfektion eines Tetrazyklin-regulierbaren EBNA-3C Expressionsvektors in frisch isolierte primäre B-Zellen und anschließender Infektion mit EBNA-3C negativen Viren, wurde ein neuer Weg geschaffen, um EBNA-3C-Funktionen zu untersuchen. Dieses 2-Schrittsystem kann nun im Prinzip für jede Virusmutante eingesetzt werden.

Die vorliegende Untersuchung sollte die Rolle von Bakterien aus Schweinegülle im Zusammenhang mit dem humanrelevanten phänotypischen und genotypischen Resistenzgeschehen objektivieren. Hierzu wurde untersucht, ob und in welchem Umfang Bakterien in Schweinegülle zum Zeitpunkt des Ausbringens Resistenzen gegen ausgewählte veterinärmedizinische, vor allem aber gegen humantherapeutisch relevante antimikrobielle Wirkstoffe exprimieren. Zudem wurden die Gehalte an ausgewählten Tetrazyklin-Resistenzgenen erhoben und unter Einbeziehung verschiedener Einflussfaktoren, darunter auch des Tetrazyklin-Gehaltes der Gülle, verglichen. Zu diesen Zwecken wurden 306 Gülleproben mit bekanntem Antibiotikagehalt aus bayerischen Schweinehaltenden Betrieben mikrobiologisch-kulturellen Untersuchungen einschließlich der phänotypischen Resistenztestung der Isolate gegenüber bis zu 29 human-relevanten Wirkstoffen im Mikrodilutionsverfahren unterzogen. Das quantitative Vorkommen der Tetrazyklin-Resistenzgene tet(M), tet(O) und tet(B) in 115 der Gülleproben wurde mittels RealTime-PCR nach Direkt-Extraktion der DNA erhoben. 380 Gülleproben wurden auf das Vorkommen von Salmonella spp. untersucht. Verglichen mit den deutschlandweit erhobenen Daten zu human-klinischen Isolaten (GENARS-Projekt) lag der Prozentsatz resistenter Bakterienisolate aus Gülle in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle unter den humanmedizinischen Resistenzraten. Eine Ausnahme bildete Doxycyclin (als Vertreter der Tetrazykline) mit bis zu 20 % höherem Resistenzaufkommen in der Gülle, was mit dem weit verbreiteten Einsatz der Tetrazykline in der Nutztierhaltung begründet werden kann. Die Resistenz gegen Reserve-Antibiotika lag bei E. coli zwischen 0 und 2 %; im Einzelfall höher bei Enterokokken. Glykopeptid-resistente Enterokokken traten nicht auf. Es zeichnete sich übereinstimmend ein signifikanter Einfluss der Betriebsgröße auf die Resistenzparameter ab, mit höheren Resistenzraten in größeren Betrieben aller Betriebsformen. Abhängig davon, ob in der Gülle der Nachweis eines oder mehrerer Antibiotika (Tetrazykline, Sulfonamide) gelang, stiegen die Resistenzraten für mehrere Substanz-Keim-Paarungen. Von dieser Entwicklung sind neben veterinärmedizinischen Wirkstoffen, die im Antibiotika-Monitoring tatsächlich nachgewiesen worden waren, auch andere – teils veterinärmedizinisch nicht zugelassene – Wirksubstanzen betroffen, darunter auch solche, deren restriktive Handhabung empfohlen wird (Fluorquinolone, Synercid). Die Zahl der Gülleproben, die hochmehrfach-resistente Bakterien beherbergten, war zwischen antibiotikafreien und antibiotikahaltigen Proben nicht signifikant verschieden. Jedoch differierte der Prozentsatz hochmehrfach-resistenter Isolate nach Tetrazyklin-Gehalt. Zudem exprimierte der Querschnitt aller Isolate innerhalb einer Gülle mit hochmehrfach-resistenten Keime in nachweislich antibiotikahaltigen Proben signifikant mehr Antibiotikaresistenzen, verglichen mit analytisch negativen Proben. Bei der Verfütterung therapeutischer Chlortetrazyklin-Konzentrationen an Schweine konnte ein Anstieg der Gene tet(M) und tet(O) in den Faeces nachgewiesen werden. Quantitative Untersuchungen zum Vorkommen der Resistenzgene tet(M) und tet(O) in Praxisgülle zeigten einen signifikanten Anstieg der Resistenzgen-Gehalte bereits im Konzentrationsbereich ab 0,1 mg Tetrazyklin/kg Gülle (Summe der untersuchten Tetrazykline: Chlortetrazyklin, Tetrazyklin, Oxytetracyclin und Doxycyclin) gegenüber Tetrazyklin-„freier“ Gülle. Der Anteil der Resistenzgene, der sich nach Düngung mit Chlortetrazyklin-haltiger Gülle im Boden wiederfand, war erheblich geringer als die in Gülle gefundenen Gehalte; die maximalen nach CTC-Gülle-Düngung im Boden gefundenen tet(M)-Konzentrationen betrugen nur etwa 0,3 % der durchschnittlichen Gehalte in Gülle und erreichten in Ackerland bis zu einer Woche nach Ausbringung Maximalwerte von 480 000 copies/g. Ab Woche 3 nach Begüllung gab es keinerlei positive Befunde. Im Grünland waren die tet-Resistenzdeterminanten nach initialen Maximalwerten um 10 000 copies/g Boden nach sieben Wochen noch in Konzentrationen bis 100 copies/g nachzuweisen; nach 12 Wochen war jedoch keines der untersuchten Gene mehr detektierbar.

In der vorgelegten Dissertation wurde die Rolle des onkogenen Transkriptionsfaktors c-Myc für eine schnelle Zellzyklusprogression untersucht. Der Stand der Forschung zu Beginn der Arbeit legte nahe, dass ohne die Expression von c-Myc eine Zelle nur verzögert den Teilungszyklus durchlaufen kann (Mateyak et al., 1997). Mit Hilfe eines neuen Experimentansatzes konnte gezeigt werden, dass diese Beobachtung korrigiert werden muss. Die Analyse der Zellzyklusprogression von einzelnen Zellen mit Hilfe von Zeitrafferfilmen ergab, dass c-myc-/- Zellen in gleicher Zeit die Teilung durchführen wie c-myc+/+ Zellen. Das Aufstellen von Stammbäumen zu den einzelnen Zellen ebnete den Weg zu einer umfassenden statistischen Auswertung. Mit der Kaplan-Meier Methode gelang eine detaillierte Beschreibung des beobachteten Sachverhaltes. c-myc-/- und c-myc+/+ Zellkulturen unterschieden sich vor allem in ihrer Teilungswahrscheinlichkeit und nicht in der Zellzyklusdauer der einzelnen Zellen. In Abwesenheit von c-Myc-Expression wurde ein großer Teil der Zellen nach erfolgter Teilung inaktiv. Der Anteil teilungsinaktiver Zellen akkumuliert und ließ die Gesamtzahl der Population deutlich langsamer ansteigen. Dieses Ergebnis konnte durch die Generierung einer neuen Zellinie weiter untermauert werden. Die Expression eines MycER Fusionsproteins in c-myc-/- Zellen (Smoxi-4) ermöglichte die wahlweise Aktivierung des MycER Proteins durch Zugabe von Tamoxifen (4-OHT). Eine unmittelbare Untersuchung der Auswirkung von c-Myc-Aktivität in einer einzigen Zellinie war dadurch möglich. Zeitrafferfilme und deren Auswertung bestätigten die bereits gemachten Ergebnisse. Durch die Verwendung der publizierten Osteosarkomzellinie M47 (Gehring et al., 2000) konnten die Beobachtung weiter verallgemeinert werden. In diesen Zellen ließ sich die Expression des c-Myc-antagonistisch wirkenden Transkriptionsfaktors Mad1 durch Zugabe von Tetrazyklin steuern. Der Antagonist Mad1 senkte vor allem die Teilungswahrscheinlichkeit der Zellen. Zusammenfassend ergibt sich daraus der Vorschlag eines neuen Modells. Die Expression von c-Myc in einer Zelle beeinflusst vor allem die Entscheidung, ob sie in einen weiteren Zellzyklus eintritt oder nicht. Der Geschwindigkeit der Zellzyklusprogression kommt dabei nur eine untergeordnete Rolle zu. Diese Beobachtung unterstreicht die Bedeutung von Restriktionspunkten und Aktivierungsschwellen bei der Kontrolle der Zellteilung durch c-Myc. Die erhöhte Apoptose- und Mitoserate von Smoxi-4 Zellen zeigte auf anschauliche Weise, wie durch eine einzige onkogene Läsion (c-Myc) die Entstehung weiterer Mutationen begünstigt werden kann.

Knorpeldefekte lassen sich nicht zufriedenstellend therapieren, da bis heute ein kontrollierter regenerativer Gewebeaufbau unmöglich war. Eine neue Strategie wäre eine Kombination von Chondrozytentransplantation mit gentherapeutischen Methoden, z. B. die stabile Ex-vivo-Transduktion von primären Chondrozyten mit retroviralen Vektoren, die gewebeaufbauende Zytokine exprimieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb Etablierung und Optimierung des retoviralen Gentransfers in primäre Kaninchenchondrozyten und die Beobachtung von Verbleib, Vitalität und Genexpression der Zelltransplantate in vivo. Transduzierte Zellen sollten ohne weitere Selektionsverfahren für eine spätere Transplantation verwendet werden können. Da regulierbare Genexpression in einem solchen Modell von Vorteil ist, war ein weiteres Ziel die Entwicklung retroviraler Tet-On-Vektoren. Es wurden konstitutiv exprimierende retrovirale Vektoren und Tet-On-Vektoren kloniert und Retroviren mit unterschiedlichen Infektionsspektren generiert. Effizienz und Stabilität des Gentransfers wurden ohne weitere Selektionsverfahren mit Hilfe konstitutiv nlslacZ-exprimierender retroviraler Vektoren in vitro und in vivo beurteilt. Zusätzlich wurde stellvertretend für ein therapeutisches Gen der Wachstumsfaktor hbmp-2 transferiert. Retrovirale Ein-Vektor-Systeme, die den reversen Transaktivator rtTA2s-M2 und den Tet-responsive Promotor enthielten, wurden in vitro durch die Expression der Reportergene nlslacZ oder egfp in verschiedenen Zelllinien getestet. Mit VSV.G-pseudotypisierten Retroviren konnte eine Transduktionseffizienz von bis zu 99 % erzielt werden, amphotrope Viren waren deutlich weniger effizient. Transduzierte Chondrozyten zeigten in vitro über mindestens 12 Wochen eine stabile Transgenexpression, die auch in 3D-Kultur auf Kollagenschwämmen fortbestand. In vivo war für mindestens drei Wochen Transgenexpression nachweisbar. hbmp-2 transduzierte Zellen exprimierten zudem dieses Transgen in vitro. Die neu entwickelten Tetrazyklin-induzierbaren Retroviren zeigten eine starke Basalexpression bei nur geringer Steigerung nach Induktion mit Doxyzyklin. Die Transduktionseffizienz dieser Retroviren war wesentlich geringer als bei der Verwendung konstitutiv exprimierender Vektoren. VSV.G-pseudotypisierte Retroviren sind eine optimale Methode für den retroviralen Gentransfer in primäre Kaninchenchondrozyten ohne weitere Selektionsverfahren. Neben dem Transfer von Markergenen ist dies die Grundlage für den Transfer von therapeutischen Genen, um deren Effekt in vitro und in vivo zu untersuchen. Zudem wurde ein neuartiger universal einsetzbarer Vektor entwickelt, der die Klonierung in die retroviralen U3 Region und somit die Konstruktion retroviraler Double-copy-Vektoren erlaubt. Die Entwicklung zuverlässiger retroviraler Tet-On-Vektoren bleibt weiterhin eine Herausforderung für die Zukunft.