Podcasts about resistenztests

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen von Bakterien im unteren Respirationstrakt von Hunden mit Atemwegserkrankungen und deren Resistenzverhalten gegenüber klinisch relevanten Antibiotika untersucht. Hierfür wurden die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen und Resistenztests von 502 Proben von 493 Hunden retrospektiv ausgewertet, die im Zeitraum von 1989 bis 2011 an der Medizinischen Kleintierklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München mit respiratorischen Symptomen vorgestellt wurden. Aerobe Bakterien wurden aus 65 % der Proben isoliert, wobei in 47 % der positiven Kulturen mehrere Isolate nachgewiesen wurden. Grampositive Bakterien wurden aus 52 % und gramnegative Bakterien aus 77 % der Proben mit bakteriellem Wachstum kultiviert. Die häufigsten Isolate umfassten Spezies der Gattungen Streptococcus (31 %), Staphylococcus (19 %), Pasteurella (16 %) und Pseudomonas (14 %). Weiterhin konnten Enterobakterien in 30 % der positiven Proben nachgewiesen werden, bei denen es sich in der Hälfte der Fälle um Escherichia coli (15 %) handelte. Bordetella bronchiseptica als primär pathogenes Bakterium wurde in 8 % der positiven Fälle vergleichsweise selten isoliert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde anhand der Ergebnisse des Agardiffusionstests die in-vitro-Sensibilität der häufigsten bakteriellen Isolate gegenüber den antibiotischen Wirkstoffen Enrofloxacin, Gentamicin, Cefalexin/Cefalotin, Amoxicillin-Clavulansäure, Sulfonamid/Trimethoprim, Cefotaxim, Doxycyclin und Ampicillin ausgewertet. Enrofloxacin zeigte die höchste Gesamtwirksamkeit aller getesteten antibiotischen Wirkstoffe gegenüber 86 % aller Keime, darunter 87 % der gramnegativen Isolate. Hochwirksam gegenüber grampositiven Bakterien erwiesen sich Amoxicillin-Clavulansäure (92 %) und Cephalosporine der ersten Generation (86 %), wobei 40 % der gramnegativen Isolate resistent gegenüber diesen Wirkstoffen waren. Ausgedehnte Resistenzen zeigten sich vor allem unter gramnegativen Spezies gegenüber Beta-Laktam-Antibiotika, potenzierten Sulfonamiden und Doxycyclin. Sehr hohe Resistenzraten wurden für Escherichia coli und Pseudomonas spp. nachgewiesen. Lediglich Enrofloxacin und Gentamicin wiesen eine Wirksamkeit gegenüber 70 bis 73 % dieser Isolate auf. Am empfänglichsten zeigten sich Pasteurella spp. mit weniger als 15 % Resistenzen gegenüber den meisten Antibiotika. Eine günstige Resistenzlage konnte auch für Bordetella bronchiseptica nachgewiesen werden. Hier lagen über 90 % sensible Isolate gegenüber Enrofloxacin, Gentamicin, Amoxicillin-Clavulansäure und Doxycyclin vor. Im Verlauf des Studienzeitraums konnte eine signifikante Abnahme der in-vitro-Wirksamkeit von Enrofloxacin gezeigt werden. Insbesondere für Escherichia coli konnte in der zweiten Hälfte des Untersuchungszeitraums ein signifikanter Anstieg des Anteils Enrofloxacin-resistenter Isolate nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung unterstreichen aufgrund des nicht exakt vorhersehbaren Resistenzverhaltens der isolierten Bakterien die Notwendigkeit zur routinemäßigen Durchführung von bakteriologischen Untersuchungen und antibiotischen Resistenztests bei Hunden mit bakteriellen Atemwegsinfektionen. Anhand der erhobenen Daten kann Enrofloxacin zur empirischen antibiotischen Behandlung oder zur Initialen Therapie bis zum Vorliegen der Ergebnisse aus Erregerkultivierung und Resistenztests bei Infektionen mit gramnegativen oder unbekannten Erregern eingesetzt werden, während Amoxicillin-Clavulansäure zur Behandlung von Infektionen mit grampositiven Bakterien geeignet erscheint.

Die gebräuchliche Therapie gegen Milzbrand besteht aus der Gabe von Antibiotika. Als Therapie der Wahl gilt hierbei das Fluorochinolon Ciprofloxacin. Resistenzen gegen dieses Antibiotikum wurden bei B. anthracis in vivo noch nicht, in vitro jedoch im Rahmen mehrerer Studien beschrieben. Es existieren herkömmliche Resistenztests, wie der Gradientendiffusions- oder der Mikrodilutionstest, welche bei einer Milzbranderkrankung genutzt werden können. Diese nehmen jedoch aufgrund der kulturellen Anzucht in einem Labor der Schutzstufe 3 vor der Durchführung des Tests ein bis zwei Tage Zeit in Anspruch. Um diese Zeitspanne zu verkürzen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Schnelltests entwickelt. Diese basieren auf einer real-time-PCR Methode, mit welcher Ciprofloxacin-Resistenz verursachende Punktmutationen (= SNPs), nachgewiesen werden. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde der B. cereus Stamm ATCC10987 resistent gegen Ciprofloxacin generiert. Aufgrund der Dual-Use-Research-of-Concern-Problematik wurde dieser, wenig pathogene, aber genotypisch sehr nah mit B. anthracis verwandte, BSL-2-Organismus verwendet. Die Resistenzbildung erfolgte durch natürliche Selektion, indem der B. cereus Wildtyp mehrfach auf Ciprofloxacin-haltigen Agar-Platten, welche eine steigende Konzentration des Antibiotikums enthielten, angezüchtet wurde. Es folgte eine Sequenzierung der Quinolone Resistance Determinig Region (= QRDR), bestehend aus den Genen gyrA, gyrB, parC und parE, von neun B. cereus Mutanten, welche CIP-Resistenzen entwickelt hatten. Eine der Mutanten besaß einen SNP im Gen gyrA an Stelle 254 mit einer Mutation der Base Cytosin in ein Thymin. Solche SNPs stellen eine mögliche Ursache der Resistenz gegen Fluorochinolone dar. Acht der B. cereus Mutanten besaßen jedoch keine SNPs in der QRDR. Die Ursache für deren Resistenz wird in der erhöhten Funktion von Effluxpumpen vermutet. Im zweiten Teil der Studie wurden die Schnelltests entwickelt. Es wurden mehrere Protokolle für die beiden real-time-PCR Methoden TaqMan® und MeltMAMA (= Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays) erstellt und getestet. Der Vergleich beider Methoden wertete den TaqMan® als die Methode der Wahl für die gesetzte Zielstellung. Daraufhin wurden für acht bekannte Ciprofloxacin-Resistenzen auslösende SNPs TaqMan®-Protokolle entwickelt. Im Abschluss wurden diese durch Versuche mit verschiedenen B. anthracis Stämmen, dem B. cereus ATCC10987 Wildtyp und seinen Mutanten, synthetisch hergestellten Templates, die als Mutationskontrollen genutzt wurden, sowie verschiedenen Bacillus Spezies hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität erprobt. Es wurden acht TaqMan® Protokolle erarbeitet, welche SNPs in der QRDR von B. anthracis nachweisen und somit eine schnelle Diagnose vieler Ciprofloxacin-resistenter Stämme gewährleisten. Der Einsatz dieser Schnelltests zusätzlich zu den herkömmlichen Empfindlichkeitstests gibt die Möglichkeit eine optimale Therapie von Milzbrandinfektionen in einem verkürzten Zeitraum zu gewährleisten.

Zur Beurteilung der Resistenzlage aerober Bakterien des Wirtschaftsgeflügels wurden von September 2006 bis April 2008 insgesamt 2462 bakterielle Isolate aus Routineuntersuchungen von Organ- und Tupferproben auf deren in-vitro-Resistenzverhalten gegenüber antibiotischen Wirkstoffen hin untersucht. Von den erfassten Bakterienstämmen stammten 2227 von Mastküken oder Broilern, und die übrigen von Legehennenküken, Legehennen, Peking- und Moschusenten. Mit dem Agardiffusionstest erfolgte eine qualitative Beurteilung der Keime als resistent, intermediär oder sensibel. Von einem Teil dieser Bakterien wurde parallel hierzu die Antibiotikaempfindlichkeit mittels Bouillon-Mikrodilution bestimmt. Dabei wurden die entsprechenden MHK-Werte erhoben und beurteilt. Die qualitativen Ergebnisse beider Testmethoden wurden verglichen. Die Testdurchführung erfolgte auf der Grundlage von CLSI-Vorgaben. Im Ergebnis konnte ein Überblick über die aktuelle Antibiotikaempfindlichkeit bakterieller Keime des Wirtschaftsgeflügels im Einzugsbereich der Klinik für Vögel der LMU München erhoben werden. Unterschiede zu Ergebnissen anderweitiger Untersuchungen in Deutschland sind teilweise gegeben; so ergab sich in der vorliegenden Arbeit aus der MHK-Bestimmung für E. coli mit jeweils knapp 60 % sensiblen Isolaten eine höhere Resistenz gegenüber Enrofloxacin und Trimethoprim-Sulfamethoxacol, während sich Staph. aureus mit jeweils fast 80 % sensiblen Isolaten als deutlich empfindlicher gegenüber Ampicillin und Penicillin erwies. Es zeigt sich daher die Notwendigkeit Klinik- oder ggf. Praxiseigener Monitoring-programme, um den behandelnden TieräztInnen für eine antibiotische Erst- oder Notfallbehandlung von Geflügelbestände eine geeignete Entscheidungsgrundlage geben und damit den Anforderungen an einen vernünftigen Antibiotikaeinsatz gerecht werden zu können. Ampicillin und Penicillin zeigten die breiteste Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien. Über 85 % der untersuchten Keime waren empfindlich gegenüber diesen Antibiotika. Bei gramnegativen Keimen erwies sich Colistin als das am häufigsten wirksame Antibiotikum, mehr als 94 % der Isolate wurden als sensibel beurteilt. Die Resistenzlage vieler Bakterien des Geflügels stellte sich jedoch als relativ unsicher heraus. Daher sind Resistenztests für eine wirksame antibiotische Behandlung von Nutzgeflügelbeständen unabdingbar. Nur so kann ein falscher oder unnötiger Antibiotikaeinsatz vermieden und der Verbraucher vor resistenten Keimen tierischer Herkunft geschützt werden. Im Vergleich beider Testmethoden unterschieden sich die qualitativen Ergebnisse in 13,8 % der Fälle. In 9 % der Fälle lag ein kleiner Fehler (minor error) vor. Aufgrund der guten Korrelation der Ergebnisse wird gefolgert, dass sich beide Methoden gleichermaßen für die Resistenztestung bakterieller Keime des Geflügels eignen und einen Platz in der Routine- und Notfalldiagnostik haben. Die Problematik fehlender geflügelspezifischer Grenzwerte ist unabhängig von der Methode vorhanden. Die Bouillon-Mikrodilution zur Erhebung quantitativer und vergleichbarer MHK-Werte stellt aber die Methode der Wahl für das Resistenzmonitoring dar. Dabei sollte jedoch beachtet werden, dass eine möglichst große Anzahl an Konzentrationsstufen getestet werden sollte, da die erhobenen MHK-Werte zum Teil über einen großen Bereich verteilt lagen.

Ziel dieser Arbeit war die Vereinfachung und Optimierung der bekannten hochsensitiven RT-Nachweisverfahren. Hochsensitive RT-Nachweisverfahren bestehen aus der Generierung von cDNA aus einem heteropolymeren Template mit anschließender Amplifikation der entstandenen cDNA mittels PCR. Bei den ersten in der Literatur beschriebenen Verfahren zum hochsensitiven RT-Aktivitätsnachweis mit PCR-Amplifikationsschritt (PERT, Pyra 1994; AmpRT, Heneine 1995) handelt es sich um qualitative Verfahren mit Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid Färbung der PCR-Produkte als Read-out. Von diesen beschriebenen Verfahren wurde die Auswahl des heteropolymeren RNA-Templates und der grundsätzliche Ablauf, sowie einige Überlegungen zur Optimierung übernommen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue, optimierte Primersequenzen für den RT-Schritt sowie für den PCR-Amplifikationsschritt entworfen. Diese Primersequenzen ermöglichen die Untersuchung der RT-Aktivität im Verlauf des RNA-Templates sowie die Untersuchung des Einflusses von RT-Inhibitoren. Es wurden die üblichen Optimierungsschritte wie MgCl2-Titration, Titration der Primerkonzentration und Variation der Annealing-Temperatur durchgeführt. Um eine Kontamination im Sinne eines Carry-over von PCR-Produkten zu verhindern, wurde ein UNG/dUTP System integriert und in seiner Wirksamkeit überprüft. Zwei verschiedene quantitative Read-out Verfahren wurden verglichen: Die Bestimmung der Menge an entstandenem PCR-Produkt am Ende des PCR-Schrittes stellte sich als arbeitsaufwändig heraus und ermöglichte nur einen geringem linearen Messbereich. Die Real-Time-Quantifizierung zeigte dagegen einen weiten linearen Messbereich und benötigt nach dem PCR-Schritt keine zusätzlichen Arbeitsschritte. Es konnte somit die Überlegenheit des Nachweises mittels Real-Time-PCR im Vergleich zur Endpunkt-Bestimmung gezeigt werden. Zur Real-Time Quantifizierung wurde für die Fluoreszenz-Detektion statt einer Exonuklease-Sonde (TM-PERT, TaqMan-Verfahren, z.B. von Maudru 1998 beschrieben) ein Molecular Beacon verwendet. Auch hier wurden die üblichen Optimierungsverfahren (Sonden-Titration, Einsaatmenge cDNA) durchgeführt. Mit dem entwickelten Verfahren können so geringste Mengen von RT-Aktivität, entsprechend ca. 40 Viruspartikeln mit hoher Kontaminationssicherheit und hoher Spezifität nachgewiesen werden. Es konnte das Ansprechen auf nukleosidische RT-Inhibitoren gesteigert werden, mit der Möglichkeit phänotypische Resistenztests auch gegen AZT durchzuführen. Zahlreiche viel versprechende Anwendungsgebiete des RT-Aktivitäts Nachweises mit dem hier etablierten Test sind jedoch derzeit für die Routineanwendung nicht zugänglich, solange die Probleme durch unspezifische Inhibitoren, wie sie beispielsweise im Blutplasma vorkommen, nicht gelöst sind. Um dieses Nachweisverfahren für die virologische Diagnostik einzuführen, wird ein stabiles und einfaches Aufreinigungsverfahren für RT aus Blutplasma von Patienten benötigt.