Podcasts about die sequenzierung

Es ist soweit! Das internationale Weichtier des Jahres 2024 wurde gewählt und wir haben ja alle wie wild mit abgestimmt! Darum möchten wir jetzt in einer Spezialfolge – sogar mit dem Start eines neuen Forschungsprojektes – den Sieger der Wahl und seine Verwandten feiern. Und der Gewinner ist: Der Lebende Leuchtstab!!! Eine leuchtende Schnecke trägt also die Lorbeeren heim, kann die Siegesurkunde in ihr erleuchtetes Häuschen hängen und hat vor allem eine komplette Sequenzierung ihres Genoms gewonnen. Was das für diese Tierart bedeutet, das schauen wir uns in dieser Folge an. Vor allem starten wir aber ein neues, spektakuläres Langzeitforschungsprojekt! Nicht am lebenden Leuchtstab, aber mit seinen heimischen Verwandten: den Weinbergschnecken. Wir sind nämlich für eine Woche in Workation im Ferienhaus von Fraukes Familie. Und ihr seid in dieser Folge live dabei, wie wir dort im Garten Weinbergschnecken markieren, um mehr über das Leben dieser wunderbaren Weichtiere zu erfahren. Also: Auf geht's in die wunderbare Welt der Schnecken! Weiterführende Links: Pressemitteilung Internationale Weichtierwahl 2024: https://www.senckenberg.de/de/pressemeldungen/eine-leuchtende-landschnecke-ist-internationales-weichtier-des-jahres-2024/ Urlaub im Ferienhaus von Fraukes Familie: https://www.traum-ferienwohnungen.de/199794/ Wissenschaftliche Publikation zum lebenden Leuchtstab: https://www.nature.com/articles/s41598-023-42364-y Die Sequenzierung von Genomen: https://www.earthbiogenome.org/ Artenbeschreibung Weinbergschnecke: https://www.weichtiere-sachsen.de/Pages/TaxonomyBrowser.aspx?id=426188 Hosted on Acast. See acast.com/privacy for more information.

Die vorliegende Arbeit hatte die Untersuchung der saisonalen Aktivität von I. ricinus in Kombination mit der Prävalenz des FSME-Virus in Zecken an ausgewählten Stand¬orten in Bayern zum Ziel. Hierzu wurden von April 2006 bis Dezember 2007 in den Kreisen München, Dachau, Rosenheim, Amberg und Passau in monatlichen Ab¬stän¬den Zecken gesammelt. Unterschiede zwischen den Standorten ergaben sich hin¬sichtlich der Zeckendichte sowie der Anteile der verschiedenen Entwicklungs¬sta¬dien. Dabei war an Standorten mit FSME-Vorkommen eine zeitgleiche Aktivität von Larven und Nymphen erkennbar, wohin¬gegen niedrige Zeckenzahlen mit gerin¬gen Larvenanteilen an Standorten, an denen kein FSME-Virus nachge¬wie¬sen wurde, dies¬bezüglich keine sichere Aussage ermöglichten. Die Ergebnisse stützen so¬mit Aspekte der Hypothese, dass FSME-Naturherde nur an Standorten entstehen, an denen eine Virusübertragung via Cofeeding durch synchrone Aktivitätsmuster der juvenilen Entwicklungs¬stadien von I. ricinus ermöglicht wird (Randolph et al., 2000). Nach Extraktion der RNA von 1965 Nymphen und 1465 Adulten der Art I. ricinus wurde eine real-time RT-PCR zum Nachweis des FSME-Virus eingesetzt. Die Prä¬va¬len¬zen an den einzelnen Stand¬orten variierten von 0 % [95 %-KI: 0,0 % ; 0,6 %] bis 1,3 % [95 %-KI: 0,7 % ; 2,3 %]. Dabei zeigte sich eine Überein¬stim¬mung des FSME-Vor¬kommens in I. ricinus mit der jeweiligen, auf Fallzahlen basierenden, Klassi¬fizierung in Risiko¬gebiete durch das Robert Koch-Institut. Die Sequenzierung des nahezu kompletten viralen E Gens ergab insgesamt fünf Genotypen, welche sich nach phylogenetischer Analyse in zwei Clustern in den Europäischen Subtyp eingliederten. Auf Amino¬säure¬ebene zeigten sich im Vergleich zu der Sequenz des Stammes Neudoerfl fünf poly¬mor¬phe Positionen, wobei drei der am Standort Amberg festgestellten Mutationen unter den veröffentlichten Sequenzen neuartig oder bisher nur einmalig beschrieben waren. Aufgrund der Lage dieser Mutationen in einer für die Virulenz entschei¬denden Region ist ein Einfluss auf den klinischen Verlauf von Infektionen mit FSME-Viren dieses Stammes möglich. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Ermittlung der FSME-Infektionsrate in Zecken eine verlässliche Alternative zu der auf humanen Fallzahlen basierenden Ein¬schät¬zung bildet. Zudem können auch die phänotypischen Eigenschaften des vorkommenden Virus für die Risikobeurteilung wichtig sein.

In der vorliegenden Arbeit wurde basierend auf der genotypischen Charakterisierung von Stämmen des Mycobacterium tuberculosis - Komplexes anhand des gyrA-Gens mit Hilfe einer auf dem LightCycler® System basierenden gyrA Real-time-PCR ein neuartiges Testverfahren zur Bestimmung von Chinolonresistenzen konzipiert und etabliert. Bei der Evaluierung des Testverfahrens mit 13 phänotypisch resistenten Stämmen mit einer MHK ≥ 4 µg/ml für Ciprofloxacin zeigten 9 Stämme bei der Schmelzpunktanalyse einen eine Mutation anzeigenden Shift des Tm’s, 2 weitere wiesen die typische Schmelzkurve einer Heteroresistenz auf. Die Sequenzierung ergab, dass 5 dieser Stämme eine Mutation des Codon 90 (Ala→Val, GCG→GTG) und 6 Stämme eine Mutation des Codons 94 (Asp→Gly, GAC→GGC) aufwiesen. Die beiden verbliebenen Stämme hatten den Schmelzpunkt des Wildtyps, der durch die Sequenzierung bestätigt werden konnte. Die molekularepidemiologische Unabhängigkeit der resistenten Stämme wurde durch das IS6110 Fingerprinting bestätigt. 44 phänotypisch sensible Stämme wiesen ebenfalls den Tm des Wildtyps auf. Damit besitzt das Testverfahren für den Nachweis von Chinolonresistenzen eine Sensitivität von 85% und eine Spezifität von 100%. Die Speziesspezifität wurde anhand von 7 typischen und 16 atypischen Mykobakterien sowie humanen DNA-Präparationen und Sputumproben überprüft, wobei sich eine Amplifikation nur bei Mitgliedern des M.tb. - Komplexes fand. Das Testverfahren ist somit hochspezifisch für den Mycobacterium tuberculosis - Komplex. Der Test wurde für die Bestimmung von der Primärkultur und für den Direktnachweis aus dem Sputum evaluiert. Der Nachweis von Mykobakterien direkt aus dem Sputum mit dem Testverfahren ist mit 103 KBE/ml eine Größenordnung sensitiver als die Mikroskopie. Das Testergebnis liegt in der Regel innerhalb eines Tages vor. Für die Testdurchführung und die Testauswertung wurden Standardprotokolle erstellt. Anhand einer kritischen Evaluation der Primärliteratur konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konkordanz von über 90% zwischen höhergradigen Chinolonresistenzen (MHK ≥ 4 µg/ml) und Mutationen des gyrA-Gens besteht. Die Informationen aus der phänotypischen und der genotypischen Resistenztestung sollte genutzt werden, um die beiden Verfahren gegenseitig zu evaluieren. So sprechen die bisherigen molekularbiologischen Daten für den von der WHO vorgeschlagenen Grenzwert von >2µg/ml bei der phänotypischen Resistenzbestimmung. Anhand von klinischen Studien sollte die Grenzwertsetzung überprüft und vor allem der Nutzen der Techniken für den Patienten evaluiert werden. Chinolone haben eine stark zunehmende Bedeutung bei der Behandlung der Tuberkulose und werden bisher vor allem bei der Behandlung der MDR-Tuberkulose eingesetzt. In mehreren klinischen Studien wird derzeit auch der Einsatz von Gyrasehemmern der neusten Generation als Standardmedikament untersucht. Hiervon verspricht man sich insbesondere eine Verkürzung und eine bessere Verträglichkeit der Therapie. Sollten sich die Chinolone als First Line Medikament zur Behandlung der Tuberkulose durchsetzten, könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte auf dem LightCycler® System basierende gyrA Real-time-PCR aufgrund der schnellen Resistenzbestimmung innerhalb eines Tages dem Kliniker entscheidende Hinweise für die primäre Einleitung einer effektiven Therapie geben.

Der labordiagnostische Nachweis von Mikrosporidieninfektionen bereitet immer noch Probleme. Auf Grund ihrer geringen Größe und ihrer unspezifischen Färbeeigenschaften ist der lichtmikroskopische Direktnachweis schwierig. Der elektronenmikroskopische Nachweis ist aufwendig und insbesondere aus dem Stuhl wenig sensitiv. Nicht alle Mikrosporidienarten können in Zellkulturen angezüchtet werden. Molekularbiologische Nachweisverfahren wie die PCR sind aufwendig, noch nicht standardisiert und derzeit noch Speziallaboratorien vorbehalten. Zuverlässige immundiagnostische Tests mit ausreichender Sensitivität und Spezifität fehlen, da das immunogene Spektrum von Mikrosporidien weitgehend unerforscht ist und somit bis heute die Wahl eines geeigneten Antigens das Grundproblem darstellt. Dabei wäre gerade vor dem Hintergrund aktuell zunehmender HIV-Infektionen zum Beispiel die Entwicklung eines Koproantigen-ELISA zum Nachweis von Mikrosporidien aus Stuhl von großem praktischem Nutzen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war es, die Voraussetzungen hierfür durch die Anwendung molekularbiologischer Methoden zu verbessern. Als Modellorganismus wurde die kultivierbare Mikrosporidienspezies Encephalitozoon cuniculi gewählt und in der Zellkultur angezüchtet und vermehrt. Aus der Kultur wurden die Sporen von E. cuniculi in hoher Anzahl und Reinheit gewonnen und aus ihnen die mRNA isoliert, um sie mit Hilfe der Reversen Transkriptase in cDNA zu transkribieren. Mit dieser cDNA wurde eine Genexpressionsbank angelegt, die mit polyklonalen Serum-Antikörpern gescreent wurde, die durch Immunisierung von Kaninchen mit E. cuniculi gewonnen worden waren. Hierbei konnten mehrere Klone identifiziert werden, die immunogene Proteine bildeten. Die Sequenzierung der isolierten Klone und Analyse der cDNA-Sequenzen ergab die vollständige Übereinstimmung mit einer einzigen Konsensussequenz. Durch die Suche in einer Gendatenbank konnte ein Sporenwandprotein als immunogenes Protein identifiziert werden. Des Weiteren war es möglich, mit Hilfe von Deletionsmutanten eine immunogene Domäne auf der gefundenen Sequenz ausfindig zu machen. Schließlich wurde in der Arbeit ein Vorschlag für die Verwendung dieser Sporenwanddomäne als Antigen für die Entwicklung immundiagnostischer Tests gemacht. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit (a) das immunogene Spektrum von Encephalitozoon cuniculi als im Wesentlichen auf das Sporenwandprotein beschränkt beschrieben, (b) bei dem identifizierten Protein eine immunogene Domäne charakterisiert und (c) dadurch die Voraussetzungen für die Entwicklung immundiagnostischer Tests bei Mikrosporidieninfektionen verbessert.

Die Rolle der Transduktion beim horizontalen Gentransfer ist bislang wenig untersucht. Die Bedeutung, die diesem Mechanismus beim Austausch von genetischem Material in der Natur zukommt, kann nur geklärt werden, wenn möglichst umfassende Informationen über das Vorkommen von transduzierenden Bakteriophagen verfügbar sind. Zur Erforschung des Ausmaßes des phagenvermittelten Gentransfers war es notwendig, Methoden zu entwickeln, die nicht auf die Verfügbarkeit kultivierbarer Indikatorbakterien zum Nachweis von Phagen sowie Spender- und Empfängerstämme zum Nachweis der Transduktion angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur indikatorunabhängigen Identifizierung transduzierender Bakteriophagen entwickelt. In Phagenpartikel verpackte DNA wurde als Template für die PCR-Amplifikation von bakterieller 16S rDNA eingesetzt. Dabei wurden PCR-Primer verwendet, die eine Amplifikation der 16S rRNA-Gene der meisten Eubakteria ermöglichen. Die Sequenzierung der klonierten Amplifikationsprodukte ermöglichte die retrospektive Identifizierung der Wirtsbakterien. Zur Etablierung dieser Methode wurde der generell transduzierende Salmonella-Phage P22 eingesetzt. Erste Anwendungen auf verschiedene Umweltproben zeigten, daß dieser Ansatz den Nachweis generell transduzierender Bakteriophagen ohne Isolierung und Kultivierung der Wirtszellen ermöglicht. Daher ist es auch möglich, Phagen, die am Gentransfer beteiligt sind, ohne Selektion durch die derzeit kultivierbaren Wirte zu detektieren. Schon in den ersten Testanwendungen konnten Phagen von 26 verschiedenen Gramnegativen Bakterienspezies nachgewiesen werden, bei denen bisher keine transduzierenden Viren bekannt waren. Die Untersuchung einer Moorquellwasserprobe brachte Informationen über Phagen mit bisher unbekannten Wirtszellen. Die hier vorgestellte Methode kann als Prototyp des indikatorunabhängigen Nachweises generell transduzierender Phagen für prinzipiell alle Bakterienarten gelten. Unter Einsatz verschiedener 16S rDNA-Primerpaare ist der Suche nach transduzierenden Partikeln in der Umwelt nahezu keine Grenze gesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Überprüfung einer Probe auf das Vorkommen transduzierender Phagen mit unterschiedlichen Wirtsspezifitäten als auch die gezielte Suche nach am DNA-Transfer beteiligten Phagen spezieller Vertreter der Prokaryonten. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der bisher unbekannten Salmonella-Phagen 7D, PS79 und A12. Es konnte gezeigt werden, daß diese nicht mit P22 sowie anderen prominenten Bakterienviren verwandt sind und daher drei neue Phagenfamilien repräsentieren. Mikrobiologische Untersuchungen erbrachten, daß es sich dabei um zwei temperente und einen virulenten generell transduzierenden Phagen handelt. Bezüglich ihrer morphologischen und Nukleinsäure-Merkmale zählen sie zur Familie der Caudovirales. Die Phagen wurden in Hinsicht auf ihr Wirtsspektrum sowie auf phagenvermittelte Schutzmechanismen lysogener Zellen untersucht. Im Rahmen der molekulargenetischen Analyse konnte die Größe der Phagengenome ermittelt werden und für 7D und PS79 konnten Restriktionskarten für acht bzw. sieben Enzyme erstellt werden. Der Phage A12 entzog sich, wahrscheinlich aufgrund ausgeprägter DNASekundärstrukturen, einer ausführlichen Restriktionskartierung, so daß diese auf ein Enzym beschränkt werden mußte. Untersuchungen PS79-lysogener Zellen weisen darauf hin, daß der Prophage als extrachromosomale Replikationseinheit vorliegt. Für den Phagen 7D wurde die Integration durch ortsspezifische Rekombination sowie der Integrationsort auf dem Chromosom von Salmonella nachgewiesen. Die Charakterisierung der Phagen 7D, PS79 und A12 erbrachte neue Informationen über die Vielfalt generell transduzierender Bakteriophagen bei Salmonella. Insgesamt zeigen die erzielten Ergebnisse deutlich, daß der horizontale Transfer genetischen Materials durch Transduktion, insbesondere im Hinblick auf die Sicherheitsforschung im Zusammenhang mit der Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen, nicht länger als vernachlässigbarer Faktor eingestuft werden kann.