Podcasts about infektionsversuche

Hochpathogene Aviäre Influenzaviren (HPAIV) des Subtypes H5N1 zirkulieren seit den ersten Ausbrüchen vor mehr als 10 Jahren in Wirtschaftsgeflügel und Wildvögeln, vor allem in Asien und Afrika. Vakzinekampagnien mit ungeeigneten oder unwirksamen Impfstoffen sowie Transporte von infiziertem Geflügel, sowie Wildvogelzüge führten nicht nur zur Verbreitung der Viren, sondern auch zu Reassortierungen mit anderen zirkulierenden Influenzaviren und zur antigenetischen Drift. Bis heute ist kein Impfstoff verfügbar der ausreichenden und schnellen Schutz vor einer HPAIV H5N1 Infektion, sowie der Ausscheidung bietet, genauso wie eine einfache Applikation ermöglicht und sowohl im Säugetier, als auch Vogel einsetzbar ist. Im Falle eines Ausbruches wäre eine solche Vaccine das perfekte Werkzeug, um eine Pandemie zu verhindern. Die in dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten zeigen die in-vitro und in-vivo Charakterisierung und einer Neuraminidase-negativen H5N1 Mutante, so wie den Einsatz als Impfstoffmodel zur Untersuchung der Frühimmunisierung. Ein hochpathogenes H5N1 Isolat des Stammes 2.1 (A/swan/Germany/R65/2006) wurde fünfzigmal im embryonierten Hühnerei passagiert. Den Passagen wurde bei jedem Durchgang polybasisches Hühnerserum mit Antikörper gegen H5 und N2 beigemischt, um einen selektiven Druck auf das Virus zu erzeugen. Die daraus resultierende Mutante zeigte überaschenderweise nicht die erwarteten Veränderungen und Anpassungen im Haemagglutinin, sondern Deletionen und „Segment-shuffling“ im Segment 6, welches für das Neuraminidaseprotein kodiert. Des Weiteren konnte keine Neuraminidaseaktivität mehr nachgewiesen werden. Die Deletionen führten zu Veränderungen im Wachstumsverhalten des Virus und der Pathogenität im Tier. So konnte hier gezeigt werden, dass die Mutante ohne Zugabe von externer Neuraminidase oder Adaptation des Haemagglutinins in Zellkultur und Ei hohe Infektionstiter erreichen kann. Im Vergleich zum Ursprungsvirus aber Wachstumsdefizite aufweist, die sich in kleineren Plaques und langsamerem Wachstum auf Zellkultur zeigen. Infektionsversuche im Huhn zeigten, dass das Virus weder Klinik auslöst, noch ausgeschieden oder übertragen wird, aber eine gute Immunantwort induziert. Hohe Antikörper konnten nur erreicht werden, wenn Hühner intramuskulär infiziert wurden, wohingegen eine Applikation über den oronasalen Weg nicht bei allen Tieren gelang. Die gute Immunantwort und Apathogenität des Virus machten es im weiteren Verlauf zu einem geeigneten Kandidaten für Frühimmunisierungsversuche im Säugetier- und Vogelmodell. So wurden Balb/C Mäuse, Frettchen und Hühner ein, drei und sieben Tage vor einer H5N1 Belastungsinfektion mit der H5N1 Mutante intramuskulär oder intranasal immunisiert. Dabei konnte ein 100% Schutz vor klinischen Symptomen und der Ausscheidung des Challenge-Virus nach nur 7 Tagen gezeigt werden. Darüber hinaus waren die Tiere vor Klinik bereits drei Tage nach der Immunisierung geschützt, wobei aber virale RNA in oronasalen Proben und auch den Organen nachgewiesen werden konnte. Die Neuraminidasedeletion der Mutante ermöglichte außerdem eine Unterscheidung von immunisierten zu infizierten Tieren, da erstere im ELISA NP- aber keine NA-Antikörper zeigten, wohingegen infizierte Tiere Antikörper gegen beide Proteine bildeten. In Zukunft könnten NA negative Influenzaviren zusätzlich oder als Alternative zu den gängigen stamping out Strategien eingesetzt werden. Dafür aber sind weiter Untersuchungen essentiell. Die hochpathogene Spaltstelle im HA von „EscEgg50A“ impliziert das Risiko mit zirkulierenden AI Stämmen zu reassortieren und ist daher für den Einsatz zum Beispiel in Zuchtherden ungeeignet. Darüber hinaus ist das Wissen über das NA Protein und seine Funktionsweise sehr lückenhaft und NA-negative Mutanten könnten für zukünftige Untersuchungen genutzt werden.

In der Literaturübersicht wird der derzeitige Kenntnisstand zum epizootischen ulzerativen Syndrom (EUS), einer Erkrankung bei zahlreichen Süß- und Brackwasserfischen, die sich innerhalb kurzer Zeit in vielen Teilen der Welt ausgebreitet hat und eine potentielle Bedrohung für europäische Süß- und Brackwasserfische darstellt, zusammengefasst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zuallererst, eine PCR-Methode geeignet zum Nachweis von Aphanomyces invadans direkt aus erkrankten Fischen zu entwickeln, und weiterhin, die Empfänglichkeit ausgewählter Süßwasser-fischarten, die von Bedeutung für die europäische Aquakultur sind, gegenüber diesem Erreger zu untersuchen. Hierzu wurde eine Semi-Nested PCR-Methode angewandt, die Teile der ITS-Region amplifiziert (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen). Die PCR-Methode erwies sich sowohl als hochspezifisch gegenüber allen untersuchten Aphanomyces invadans-Stämmen als auch hochsensitiv. Die Spezifität wurde unter Einsatz von DNA verschiedener Oomyceten, anderer relevanter Pathogene und Kommensalen sowie Wirts-DNA in die PCR untersucht. Die untere Nachweisgrenze der Semi-Nested PCR lag bei Einsatz von genomischer DNA aus Mycel bei 25 fg und bei Einsatz von Aphanomyces invadans-Zoosporen in die DNA-Extraktion bei 0,025 Zoosporen. Um die PCR-Methode an diagnostischen Proben zu testen, wurden Infektionsversuche durchgeführt. Hierzu wurden Blaue Fadenfische (Trichogaster trichopterus) und drei in Deutschland wirtschaftlich bedeutsame Fischarten ausgewählt: Regenbogenforellen (Oncorynchus mykiss), Europäische Welse (Silurus glanis) und Europäische Aale (Anguilla anguilla). 36 Fischen von jeder der vier Spezies wurde intramuskulär eine Aphanomyces invadans-Sporensuspension injiziert. Während eines Versuchszeitraumes von 35 Tagen wurden laufend Fische zu vorher festgelegten Entnahmezeitpunkten euthanasiert, auf Hautveränderungen untersucht und Probenmaterial aus dem Injektionsbereich für die PCR-Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung entnommen. Die Fadenfische und die Welse zeigten im Versuchsverlauf deutlich sichtbare, teilweise ulzerative Hautläsionen. Während bei der histopathologischen Untersuchung der Fadenfische die EUS-typischen mykotischen Granulome, die die Hyphen umschlossen, auftraten, konnten bei den Welsen zwar zahlreiche Hyphen nachgewiesen werden, die Entzündungreaktion bestand hier jedoch aus einer losen Anordnung von Makrophagen, wenigen Lymphozyten und Riesenzellen. Bei den Regenbogenforellen traten nur geringgradige, bei keinem Tier ulzerative Hautveränderungen auf. Nur bei vier Regenbogenforellen konnten die EUS-typischen mykotischen Granulome nachgewiesen werden. Keiner der Aale wies makroskopisch sichtbare Hautveränderungen auf mit Ausnahme eines Aals mit einer geröteten Injektionsstelle, der an Tag 2 post infectionem entnommen wurde. Bei diesem Tier konnten mit Hilfe der Grocott-Reaktion lokalisiert einzelne Hyphen sichtbar gemacht werden. Das Auftreten mykotischer Granulome oder einer zellulären Wirtsreaktion konnte bei den Aalen nicht beobachtet werden. Die PCR-Methode wurde für den Nachweis von Aphanomyces invadans aus den Fischen der Infektionsversuche angewandt. Der Erregernachweis gelang bei allen Fischen, die makroskopisch sichtbare Hautläsionen zeigten. Bei den Fadenfischen und den Welsen gelang der Erregernachweis bei allen Versuchsgruppen ab dem ersten Entnahmezeitpunkt an Tag 1 p. i. Die Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Methode sich für den Nachweis von Aphanomyces invadans bei erkrankten Fischen eignet. Zur Empfänglichkeit von Europäischen Welsen und Aalen lagen bisher keine Daten vor. Die Ergebnisse der Infektionsversuche liefern klare Hinweise dafür, dass Europäische Welse gegenüber dem EUS empfänglich sind, während Aale nicht und Regenbogenforellen nur geringgradig empfänglich zu sein scheinen.

Im Literaturüberblick der vorliegenden Arbeit wird besonders auf die ökonomische und ökologische Bedeutung der Flusskrebse, den derzeitigen Stand der Forschung die Krebspest betreffend und die aktuelle taxonomische Klassifikation des Krebspesterregers, Aphanomyces astaci, eingegangen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine zuverlässige und schnelle Methode zum spezifischen und sensitiven Nachweis von Aphanomyces astaci direkt aus Krebsgewebe zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein kommerzielles Fertigkit (DNeasy® Tissue Kit, Qiagen) als geeignete DNA-Extraktionsmethode ausgewählt. Als Untersuchungsmaterial wurde die Abdominalkutikula von Edelkrebsen (Astacus astacus) eingesetzt. Anhand von Genomanalysen der ITS-Regionen (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen) verschiedener Oomycota wurden Oligonukleotid-Primer konstruiert, optimiert und auf ihre Eignung überprüft. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurden zwei PCR-Protokolle etabliert: eine Semi-Nested und eine Nested PCR. Die Semi-Nested PCR, die sich für die Routinediagnostik von Aphanomyces astaci als wenig geeignet erwiesen hat, bietet das Potential, als Grundlage für weiterführende Studien an anderen Arten der Gattung Aphanomyces zu dienen. Die Nested PCR mit den äußeren Primern NS 166/NS 681 und den inneren Primern BO 525/BO 640 ergab mit allen 20 untersuchten Aphanomyces astaci-Stämmen ein PCR-Produkt von etwa 115 bp, das mit einer anschließenden Restriktionsenzym-Analyse mit der Endonuklease Hph I verifiziert werden konnte. Die Nested PCR zeigte sich hochspezifisch gegenüber Aphanomyces astaci, während die DNA von anderen bei Krebsen und im Wasser vorkommenden Krankheitserregern und die DNA von Wirtsgewebe nicht amplifiziert wurde, was Grundvoraussetzung für den Einsatz dieser PCR als Standardmethode ist. Die Nachweisgrenze der Nested PCR lag bei Verwendung von Plasmid-DNA bei 1,9 genomischen Einheiten und bei Einsatz von genomischer DNA aus Pilzmyzel bei 1 ag. Als Zusammenfassung 172 Aphanomyces astaci-Sporen in die DNA-Extraktion eingesetzt wurden, lag die Nachweisgrenze bei 1 Spore. Zusätzlich wurden Infektionsversuche durchgeführt, bei denen Edelkrebse mit 10, 100 und 1000 Aphanomyces astaci-Zoosporen/ml infiziert wurden. Ein positives PCR-Ergebnis konnte ab Tag 2 post expositionem (entspricht dem Tag der ersten Probenentnahme) mit der beschriebenen Methode bei allen untersuchten Tieren beobachtet werden. Schließlich wurde eine Validierung der entwickelten Nested PCR unter Einsatz von Wirtskutikula anhand 19 diagnostischer Proben unterschiedlicher Herkunft innerhalb Europas (aus Deutschland, der Schweiz, Österreich, Schweden und England) durchgeführt und die Ergebnisse mittels RFLP verifiziert. Mit der in der vorliegenden Arbeit entwickelten molekularbiologischen Nachweismethode steht ein Verfahren zur Verfügung, das eine zuverlässige Diagnose von Aphanomyces astaci bereits im Anfangsstadium der Infektion direkt aus Krebsgewebe ermöglicht und innerhalb von 12 bis 15 Stunden (Sektion, DNA-Extraktion, Nested PCR, Agarosegel-Elektrophorese und bestätigende Restriktionsenzym-Analyse) durchführbar ist. Diese Methode ist somit ein geeignetes und zuverlässiges Mittel, um in Programmen zur Seuchenbekämpfung der Krebspest (Aphanomyces astaci) eingesetzt zu werden.