Podcasts about probenmaterial

Archäologie trifft Naturwissenschaft! In der Februar-Ausgabe des Podcasts geht es um Probenmaterial, das Jahrhunderte und Jahrtausende alt ist. Dr. Ina Reiche vom Chemischen Institut in Paris ist diesmal zu Gast. Sie erzählt von ihrer Arbeit an Höhlenmalereien, Elfenbein Statuen und Gemälden und mit welchen naturwissenschaftlichen Methoden sie diese analysiert.

Die Identifizierung unbekannter oder unvermuteter Viren in Probenmaterial stellt eine Herausforderung im Diagnostikalltag dar. Sequenzunabhängige molekulare Methoden können eine Ergänzung zu konventionellen Techniken bieten. Ziele dieser Arbeit waren die vergleichende Prüfung der sequence-independent single primer amplification (SISPA) und random-PCR als Vertreter sequenz-unabhängiger Methoden zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren und die Evaluierung ihrer Tauglichkeit als universell einsetzbare, schnelle, einfache und kostengünstige Alternativen für die Routinediagnostik. Als Modell diente das Equine Herpesvirus-1 (EHV-1), das in verschiedenen Probenmaterialien in ab-steigender Konzentration bei ansteigendem Fremd-DNA-Gehalt vorlag. Durch Schritte zur physikalischen und enzymatischen Virusanreicherung, sequenz-unabhängigen Amplifikation in Kombination mit der konventionellen Sanger-Sequenzierung und einem Datenbankabgleich sollte EHV-1 wiedergefunden werden. Trotz variabler Inhibition durch Gewebebestandteile stellte sich die Enzymbehandlung unter Einsatz einer geeigneten DNase als effektive Methode zur Elimination von Fremd-DNA heraus. Die Protektion viraler Nukleinsäuren durch Viruskapsid bzw. -hülle, die die Voraussetzung für eine erfolgreiche Durch-führung darstellte, konnte in verschiedenen Materialien gezeigt werden. Weiterhin wurde ein gradueller Verlust an viraler DNA im Verlauf beider Methoden festgestellt, der eine hohe Viruslast im Ausgangsmaterial nötig macht. Sowohl die SISPA als auch die random-PCR führten zu einem vergleichbaren Erfolg beim Virusnachweis in Zellkulturüberstand, infizierten Zellen und Lebergewebe, was für ihre Anwendbarkeit in zellarmen wie auch in zellreichen Proben spricht. Der entscheidende Faktor für den Erfolg beider Methoden schien dabei vor allem die Viruslast zu sein. Ein hoher Zellgehalt in der Probe beeinflusste die Methodik hin-gegen offenbar weniger stark. Der nachgewiesene sequenzunabhängige Charakter stellte aufgrund einer damit einhergehenden erhöhten Kontaminationsanfälligkeit einen Schwachpunkt in der Methodik der random-PCR dar. In dieser Arbeit ist es gelungen, SISPA und random-PCR erfolgreich zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren in Gewebe anzuwenden. Für die universelle Einsetzbarkeit zur Diagnostik unbekannter bzw. unvermuteter Viren sollten als nächstes geeignete Schritte der reversen Transkription und Zweitstrangsynthese erprobt werden.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

Unsere Forschungsgruppe hat eine neue, sensitive und robuste Methode entwickelt, um selektiv die Fettsäuren der Glycerophospholipidfraktion im Plasma zu bestimmen, welche nur wenig vom postprandialen Status des Probanden beeinflusst werden. Bei diesem neuen Verfahren wird die konventionelle Lipidextraktion und deren Auftrennung durch eine methanolische Ausfällung der Proteine mit zusätzlicher Ausfällung von Triglyceriden und Cholesterinestern ersetzt. In Kombination mit basenkatalysierter Synthese von Methylestern bei Raumtemperatur wird die ausschließliche Umesterung der Glycerophopholipid (GPL) Fettsäuren gesichert. In der Vergangenheit hat sich gezeigt, dass sich dieses Verfahren nicht einfach von Plasma auf Erythrozyten übertragen lässt, sodass es notwendig war, die Anwendbarkeit der Plasma-GPL Methode auf Erythrozyten zu überprüfen, zu optimieren und zu validieren, bevor sie in klinischen Studien Anwendung finden kann. Im Rahmen dieser Untersuchung bestimmten wir auch den Omega-3-Index und verglichen diese mit in der Literatur beschriebenen Werten. Außerdem haben wir eine robuste Methode für die Analyse von Wangenschleimhaut Glycerophopholipid (GPL) gebundenen Fettsäuren entwickelt, welche nur wenig Probenmaterial benötigt und einfach anzuwenden ist. Die genannten Methoden zur Extraktion von GPL wurden im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie evaluiert. Dabei wurden vor allem der Docosahexanensäure(DHA)-Anstieg im zeitlichen Verlauf der Studie zwischen den verschiedenen Kompartimenten Plasma, Erythrozyten und Wangenschleimhautzellen verglichen und Korrelationen berechnet, um eine Aussage darüber treffen zu können, welcher Biomarker, welche Änderungen widerspiegelt und wie geeignet die Analyse von GPL der Fettsäuren im Vergleich zu langjährig etablierten Markern, wie Gesamt-Phospholipide ist.

Das porzine reproduktive und respiratorische Syndrom Virus (PRRSV) wird bis 42 Tage über den Speichel übertragen. Aus diesem Grund wurde in den USA der Nachweis PRRSV-spezifischer Genomfragmente und Antikörper aus Speichelproben der Schweine entwickelt. Ziel dieser Arbeit war, Speichelproben als alternatives Probenmaterial für den Nachweis einer PRRSV-Infektion zu etablieren. In der vorliegenden Studie wurde der Nachweis PRRSV-spezifischer Genomfragmente und Antikörper in Serum- und Speichelproben untersucht. Für die Adaptation des molekularbiologischen Nachweises PRRSV-spezifischer Genomfragmente wurde PRRSV-negativer Speichel mittels zwei Entnahmesystemen gewonnen und Virus zugesetzt. Der Einfluss von Lagerungszeit und -temperatur des Speichels wurde überprüft. Im Rahmen der Überwachung des PRRSV-Status durch den Steirischen Tiergesundheitsdienst wurden insgesamt 539 Serumproben und 58 Speichelproben aus vier steirischen schweinehaltenden Betrieben auf das Vorhandensein PRRSV-spezifischer Genomfragmete und Antikörper untersucht. Es konnten über 72 Stunden PRRSV-spezifische Genomfragmente im Speichel nachgewiesen werden. Die höchste Anzahl genomischer Kopien / ml konnten bei einer Lagerungstemperatur von 4-10°C nachgewiesen werden. Nach einer 30-minütigen Strickexposition haben im Mittel 75,9-79,4 % der Tiere in der 7./8. Lebenswoche am Stick gekaut. Die untersuchten Serum- und Speichelproben hatten eine annähernd vollständige und signifikante Übereinstimmung (κ = 0,829; p < 0,001) im Nachweis PRRSV-spezifischer Antikörper. Der Nachweis PRRSV-spezifischer Genomfragmente in den Serum- und Speichelproben zeigte eine ausreichende, aber nicht signifikante Übereinstimmung (κ= 0,347, p > 0,05). Die mittlere Seroprävalenz lag zwischen 36 % in der Zuchtsauenherde und 67 % in der Aufzucht. Die durchschnittliche Virusprävalenz variierte zwischen 1 % in der Zuchtsauenherde und 36 % in der Aufzucht. Die mittlere Virusprävalenz der gewonnenen Speichelproben lag bei 30 % und die Mittlere Seroprävalenz lag bei 83 %. Die daraus resultierende Stichprobengröße variierte zwischen 95 Proben für den Nachweis viraler RNA in der Zuchtsauenherde und 3 zum Nachweis PRRSV-spezifischer Antikörper in Speichelproben. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigten, dass PRRSV eine höhere Sero- und Virusprävalenz in der Aufzucht hat. Der Einsatz von Speichelproben zum Nachweis PRRSV-spezifischer Antikörper und Genomfragmente stellt eine sinnvolle Ergänzung des Nachweises einer PRRSV-Infektion dar.

Die Messung von Körperflüssigkeiten stellt für viele Laboratorien eine besondere Herausforderung dar. Neben dem erschwerten Umgang mit dem Probenmaterial sind standardisierte Prozesse im Labor gefragt. Am Beispiel von Liquor und CAPD erklären Experten aus Labor und Klinik, wie man einen höheren Grad an Standardisierung erreichen kann.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufige (10%), spontane, immun-mediierte, wiederkehrende Entzündung des inneren Pferdeauges, die letztendlich zur Erblindung des betroffenen Auges führt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin stellt die ERU das einzige spontane Tiermodell für die autoimmun-mediierte Uveitis des Menschen dar, so dass Fortschritte in der Erforschung der ERU auch einen Beitrag für ein besseres Verständnis dieser Erkrankung beim Menschen leisten. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen am Zielorgan, die zur Entstehung der ERU und den rezidivierenden Entzündungsschüben führen, sind bis heute nicht geklärt. Durch seinen unmittelbaren Kontakt zur Retina ermöglicht der Glaskörper einen indirekten Einblick auf die in der Retina ablaufenden pathophysiologischen Prozesse und stellt ein wertvolles Probenmaterial bei der Erforschung vitreoretinaler Erkrankungen wie der ERU dar. Ziel dieser Arbeit war es, Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 119 Glaskörperproteine mittels LC-MS/MS identifiziert. Hiervon konnte durch eine Label-free Quantifizierung für 79 Proteine eine differenzielle Expression nachgewiesen werden. 17 Proteine zeigten eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben von an ERU erkrankten Pferden, wohingegen 62 Proteine in ihrer Expression vermindert waren. Durch die mit der Software STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins) durchgeführte Protein-Interaktionsnetzwerk-Analyse konnten vier Cluster von Proteinen identifiziert werden, die bei der ERU verändert exprimiert werden. Neben einer Gruppe von Plasmaproteinen, einer aus Zelladhäsions-Proteinen bestehenden Gruppe und Proteinen des Wnt-Signalweges wurde erstmalig eine funktionell mit den Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 assoziierte Gruppe identifiziert, für deren Vertreter ebenfalls eine differenzielle Expression in der Pferderetina nachgewiesen wurde. Der Wnt-Inhibitor SFRP-2 war in den Glaskörpern von an ERU erkrankten Pferden vermindert nachweisbar und zeigte eine Assoziation mit der Expression seines Interaktors Wnt3a in der gesunden Pferderetina. Mit A2M konnte durch SF-TAP Aufreinigung ein bislang unbekannter Interaktor für SFRP-2 identifiziert und in Bezug zur ERU weiter charakterisiert werden. Für das Protein Osteopontin konnte eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben und Retinae der Kontrollpferde nachgewiesen werden. Rückblickend erwies sich die Protein-Netzwerkanalyse der durch LC-MS/MS identifizierten, differenziell exprimierten Proteine als geeignete Methode, um Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Weitere Experimente sind nun notwendig, um die funktionelle Bedeutung der neu identifizierten Proteine und der mit ihnen assoziierten Signalwege in der ERU zu evaluieren.

Das Auftreten von Resistenzen ist eines der Hauptprobleme der heute angewandten antiretroviralen Therapie. Resistenzen können diagnostisch mit dem sog. genotypischen oder dem phänotypischen Verfahren festgestellt werden. Die genotypische Diagnostik beruht auf der Nukleotid-Sequenzierung der viralen Target-Gene Reverse Transkriptase (RT) oder Protease (PR), die relativ einfach zu bewerkstelligen ist. Ein phänotypischer Resistenztest und damit direkter Aktivitätstest der Enzyme RT und PR ist sehr viel präziser. Dies ist z.B. beim Vorliegen komplexer Resistenzmuster oder einem Mangel an genotypischer Information von resistenzrelevanten Mutationen bei einem neu verwendeten antiviralen Medikament von großer Bedeutung. Die zu testenden Enzyme werden entweder aus DNA, isoliert aus PBMCs aus Patientenvollblut oder Plasma-RNA rekombinant hergestellt. Vor kurzem wurde nun die Frage erhoben, ob die diagnostisch gemessenen Werte Unterschiede aufweisen, je nachdem ob DNA oder RNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Die Veröffentlichungen zu diesem Thema waren diskreptant in ihren Aussagen. Zur Klärung dieser Frage wurde in der vorliegenden Arbeit das phänotypische Resistenzverhalten der HIV-Protease von 12 Patienten gegenüber 5 verschiedenen Proteaseinhibitoren untersucht. Aus jedem der Patienten wurde ein "Protease-Paar" sowohl aus HIV-DNA als auch HIV-RNA (via cDNA) rekombinant produziert. Die Patienten wiesen eine unterschiedliche Höhe der Viruslast auf, sie lag zwischen 1.900 cp/ml und 230.000 cp/ml, und hatten unterschiedlich hohe CD4-Zellzahlen. Mit dieser Untersuchung sollte also erstens die Frage beantwortet werden, ob zu einem gegebenen Zeitpunkt Abweichungen im Resistenzprofil zwischen den beiden Formen genetischer Information von HIV im Körper vorliegen können. Im positiven Fall sollte festgestellt werden, welchen Einfluss die Virusvermehrung/Virusdynamik und der Immunstatus des betroffenen Patienten, ausgedrückt durch die Laborparameter Viruslast und CD4-Zellzahl, darauf haben. Zweitens sollte dasjenige Probenmaterial gefunden werden, welches für den phänotypischen Resistenztest das optimale Resultat ergibt: entweder HIV-DNA aus PBMCs im Vollblut oder HIV-RNA aus Blutplasma. Der hier verwendete phänotypische Resistenztest (PRT) basiert auf der direkten Messung der HIV-Proteaseaktivität, die durch rekombinante Expression der gesamten Population von HIV-Protease eines Patienten hergestellt wurde. Für die vorliegende Arbeit wurde parallel sowohl HIV-DNA aus PBMCs im Vollblut als auch cDNA aus viraler RNA im Blutplasma des Patienten als Ausgangsmaterial für die nested PCR verwendet. Nach erfolgter Expression des Enzyms in E. coli und effektiver Ein-Schritt-Aufreinigung wurde die Proteaseaktivität mit einem neuen und schnellen phänotypischen Testsystem mittels eines Fluoreszenzsubstrates in Ab- und Anwesenheit der verschiedenen Inhibitoren gemessen. Durch den Vergleich mit Wildtyp-Werten konnten die entsprechenden Resistenzfaktoren berechnet werden. Ergebnis: Von den 12 untersuchten Patienten zeigten sich in 3 "DNA/RNA-Paaren" signifikante Unterschiede in mindestens einem Proteaseinhibitor, während bei 9 Patienten übereinstimmende Resistenzmuster gefunden wurden. Schlussfolgernd wird festgestellt, dass die Verwendung von entweder DNA oder RNA als Ausgangssubstanz für den benutzten Resistenztest unterschiedliche Ergebnisse im Resistenzmuster erbringen kann, dies aber nicht notwendigerweise der Fall ist. Zwischen dem Auftreten bzw. Fehlen von unterschiedlichen Resistenzmustern und den virologischen und immunologischen Parametern Viruslast und Anzahl der CD4 positiven Zellen konnte keine klare Korrelation festgestellt werden. Ein Auftreten von Differenzen zwischen den Resistenzmustern von DNA und RNA kann die Folge eines Populationswechsels der HIV-RNA sein, die im Gegensatz zur archivarischen Natur der meist integrierten DNA aus ruhenden CD4 positiven T-Gedächtniszellen oder Monozyten erst kürzlich von aktiv infizierten Zellen produziert wurde. Ein Fehlen von Unterschieden kann bedeuten, dass die Hauptfraktion der DNA entweder erst kürzlich generiert wurde oder die RNA sich nicht verändert hat. Für die diagnostische Anwendung des PRT haben diese Ergebnisse folgende Konsequenzen: um die aktuelle Resistenzsituation abzubilden, ist virale RNA aus dem Blutplasma das bevorzugte Ausgangsmaterial. Um dagegen stille Mutationen aufzudecken, die z.B. für zukünftige Therapien oder eine adäquate Postexpositionsprophylaxe von Bedeutung sind, sollte virale DNA, stammend aus PBMCs des Vollblutes, verwendet werden.

Die Prophylaxe gewinnt nicht zuletzt auch angesichts des notwendigen finanziellen und gesellschaftlichen Sparpotentials immer stärker an Bedeutung; nicht zu Unrecht, da schließlich die meisten kariösen und parodontalen Läsionen durch rechtzeitige, fachgerecht und regelmäßig durchgeführte Prophylaxemaßnahmen in ihrer Entstehung vermieden werden könnten, so auch gesundheitliches Wohlbefinden fördernd. Das nach wie vor verbreitetste und am häufigsten angewandte „Prophylaxe-Werkzeug“ ist zweifellos die Handzahnbürste. Die vorliegende Untersuchung setzte sich zum Ziel, Unterschiede bezüglich der Dentinabrasivität zwischen verschiedenen aktuellen Handzahnbürsten mit hohem Marktdurchsatz zu ermitteln. Wie sich herausstellte, erwiesen sich die ausgewählten modernen Handzahnbürsten mit ebensolchem Bürstenkopfdesign ausnahmslos als signifikant weniger abrasiv im Vergleich zu der Referenzzahnbürste, der „ADA Control“. Die ADA Control - Zahnbürste verfügt dabei über ein einfaches Design mit geraden Borsten und planem Borstenfeld. Bereits dieses Ergebnis zeigt, eine wie rasante Entwicklung die Handzahnbürsten in den letzten Jahren genommen haben. Nicht nur das Aussehen hat dabei eine spürbare Verbesserung erfahren und sich dem Zeitgeschmack angepaßt, sondern auch die Eigenschaften wurden offensichtlich (hier die Abrasivität) deutlich verbessert. Im gesamten Testfeld zeigten drei Zahnbürsten auffallend günstige Eigenschaften in Bezug auf den Dentinverschleiß. Die „Dr. Best Brillant sensitive“, die „Oral B Advantage Plus“ und die „Dr. Best X-Sensorkopf sensitive“ zeigten die geringsten Dentinabrasionstiefen. Das Ergebnis läßt den Schluß zu, daß diese Bürsten Patienten mit parodontal vorgeschädigtem Gebiß besonders zu empfehlen sind. Gegen diese Empfehlung ist aus Sicht der Abrasionswirkung auch gewiß nichts einzuwenden, Aussagen über die Reinigungswirkung lassen sich daraus jedoch nicht ableiten. Es ist durchaus denkbar (aber keinesfalls sicher, bewegen wir uns mit folgender Schlußfolgerung doch im spekulativen Raum), daß die Bürsten mit der geringsten abrasiven Wirkung nur eine unterdurchschnittliche Reinigungswirkung zeigen. Hier liegt ein Schwachpunkt der Ergebnisse. Um zuverlässige Empfehlungen aussprechen zu können, sollte zukünftig parallel zum Verschleiß an der Zahnoberfläche auch die Reinigungswirkung getestet werden. Schließlich ist in der Reinigung der eigentliche Zweck der Handzahnbürste zu sehen! Ein weiteres Anliegen dieser Untersuchung war es, eine validierbare und zuverlässige Methode zur Testung von Zahnbürsten zu entwickeln. Um die Leistungsfähigkeit des Versuchsaufbaues zu verbessern, mußten exemplarisch zahlreiche Modifikationen an der „Zahnputz-Maschine“ vorgenommen werden. Es wurden beispielsweise neue Halterungen für die Handzahnbürsten entworfen, da die neuen Bürsten über teilweise sehr dicke, ergonomisch gestaltete Handgriffe verfügen. Die alten Halter waren für obige Studie wertlos. Ebenso mußten die Eichgewichte am Putzarm neu hergestellt und in ihrer Bauform geändert werden, um unseren Ansprüchen gerecht zu werden. Die Abrasiv-Slurry-Bäder wurden modifiziert, um einen reibungslosen Versuchsablauf zu gewährleisten. Auch Adapter, die sicherstellen, daß die Zahnbürsten während des gesamten Versuches in der vollen Länge des Bürstenkopfes aufliegen, wurden erdacht und hergestellt. Selbst die Matrize zur Probeneinbettung war zu ändern, die Schlitzfräsung wurde von 14mm auf Maximallänge von ca. 20mm vergrößert, um den Einbau größerer Proben zu ermöglichen, anderenfalls hätten zur Auswertung keine ungeputzten Dentinareale als Referenzflächen mehr genutzt werden können. Da sich die Matrize als tauglich erwiesen hat, sollte eine weitere Matrizenvariante aus dauerhaftem Stahl hergestellt werden und die mechanisch anfällige Variante aus Aluminium ersetzen. Im Rückblick sei auch kritisch vermerkt, daß sich der Nachschub an extrahierten menschlichen Zähnen zur Dentinprobengewinnung problematisch darstellt, herrscht doch oft Mangel an geeigneten Zähnen. Zudem lassen sich Störfaktoren von außen oder Lagerungsfehler nur schwer beeinflussen oder erkennen, da man notwendigerweise auf viele verschiedene Quellen zurückgreifen muß. Beispielsweise wurden stark gebleicht aussehende Zähne nicht zur Probengewinnung herangezogen, um Fehler zu vermeiden. Vermutlich wurden diese Zähne zu irgendeinem Zeitpunkt nicht in physiologischer Kochsalzlösung, sondern in Wasserstoffperoxid gelagert. Trotz Rückfragen war nicht verifizierbar, ob es tatsächlich zu solchen Lagerungsfehlern gekommen war. Obgleich die Verwendung von humanem Dentin sehr realistische Ergebnisse erwarten läßt, stellt sich jedoch die Frage, ob interindividuelle Unterschiede in der Dentinfestigkeit nicht zufällige Fehler der Ergebnisse bedingen. Bei bovinem Dentin hingegen bestehen kaum Nachschubprobleme. Außerdem lassen sich Proben in nahezu beliebiger Größe wählen und verändern. Nicht zuletzt ist es möglich, aus einem Rinderzahn, sogar aus ein und derselben Dentinschicht mehrere Dentinproben zu gewinnen, die in ihren Eigenschaften geradezu identisch sind. Ein weiterer Vorteil bovinen Dentins ist die wesentlich geringere Infektionsgefahr für den Experimentator im Gegensatz zu menschlichem Dentin, sieht man von der Bovinen Spongoencephalopathie (BSE) ab. Die Gleichwertigkeit bovinen Dentins im Vergleich zu humanem Dentin beim Einsatz in Abrasionsversuchen ist inzwischen wissenschaftlich gesichert (Imfeld, 2001). Daher sollte in zukünftigen Untersuchungen vorrangig bovines Dentin als Probenmaterial eingesetzt werden. Die vorliegenden Ergebnisse eröffnen insgesamt die Möglichkeit zu weite-ren gezielten Untersuchungen, von Zahnbürsten-Vergleichen bezüglich Abrasivität und Reinigungswirkung sowie zu Studien mit Blick auf weitere Wirkmechanismen und Interdependenzen von Abrasivität und Reinigungswirkung.

In der Literaturübersicht wird der derzeitige Kenntnisstand zum epizootischen ulzerativen Syndrom (EUS), einer Erkrankung bei zahlreichen Süß- und Brackwasserfischen, die sich innerhalb kurzer Zeit in vielen Teilen der Welt ausgebreitet hat und eine potentielle Bedrohung für europäische Süß- und Brackwasserfische darstellt, zusammengefasst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zuallererst, eine PCR-Methode geeignet zum Nachweis von Aphanomyces invadans direkt aus erkrankten Fischen zu entwickeln, und weiterhin, die Empfänglichkeit ausgewählter Süßwasser-fischarten, die von Bedeutung für die europäische Aquakultur sind, gegenüber diesem Erreger zu untersuchen. Hierzu wurde eine Semi-Nested PCR-Methode angewandt, die Teile der ITS-Region amplifiziert (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen). Die PCR-Methode erwies sich sowohl als hochspezifisch gegenüber allen untersuchten Aphanomyces invadans-Stämmen als auch hochsensitiv. Die Spezifität wurde unter Einsatz von DNA verschiedener Oomyceten, anderer relevanter Pathogene und Kommensalen sowie Wirts-DNA in die PCR untersucht. Die untere Nachweisgrenze der Semi-Nested PCR lag bei Einsatz von genomischer DNA aus Mycel bei 25 fg und bei Einsatz von Aphanomyces invadans-Zoosporen in die DNA-Extraktion bei 0,025 Zoosporen. Um die PCR-Methode an diagnostischen Proben zu testen, wurden Infektionsversuche durchgeführt. Hierzu wurden Blaue Fadenfische (Trichogaster trichopterus) und drei in Deutschland wirtschaftlich bedeutsame Fischarten ausgewählt: Regenbogenforellen (Oncorynchus mykiss), Europäische Welse (Silurus glanis) und Europäische Aale (Anguilla anguilla). 36 Fischen von jeder der vier Spezies wurde intramuskulär eine Aphanomyces invadans-Sporensuspension injiziert. Während eines Versuchszeitraumes von 35 Tagen wurden laufend Fische zu vorher festgelegten Entnahmezeitpunkten euthanasiert, auf Hautveränderungen untersucht und Probenmaterial aus dem Injektionsbereich für die PCR-Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung entnommen. Die Fadenfische und die Welse zeigten im Versuchsverlauf deutlich sichtbare, teilweise ulzerative Hautläsionen. Während bei der histopathologischen Untersuchung der Fadenfische die EUS-typischen mykotischen Granulome, die die Hyphen umschlossen, auftraten, konnten bei den Welsen zwar zahlreiche Hyphen nachgewiesen werden, die Entzündungreaktion bestand hier jedoch aus einer losen Anordnung von Makrophagen, wenigen Lymphozyten und Riesenzellen. Bei den Regenbogenforellen traten nur geringgradige, bei keinem Tier ulzerative Hautveränderungen auf. Nur bei vier Regenbogenforellen konnten die EUS-typischen mykotischen Granulome nachgewiesen werden. Keiner der Aale wies makroskopisch sichtbare Hautveränderungen auf mit Ausnahme eines Aals mit einer geröteten Injektionsstelle, der an Tag 2 post infectionem entnommen wurde. Bei diesem Tier konnten mit Hilfe der Grocott-Reaktion lokalisiert einzelne Hyphen sichtbar gemacht werden. Das Auftreten mykotischer Granulome oder einer zellulären Wirtsreaktion konnte bei den Aalen nicht beobachtet werden. Die PCR-Methode wurde für den Nachweis von Aphanomyces invadans aus den Fischen der Infektionsversuche angewandt. Der Erregernachweis gelang bei allen Fischen, die makroskopisch sichtbare Hautläsionen zeigten. Bei den Fadenfischen und den Welsen gelang der Erregernachweis bei allen Versuchsgruppen ab dem ersten Entnahmezeitpunkt an Tag 1 p. i. Die Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Methode sich für den Nachweis von Aphanomyces invadans bei erkrankten Fischen eignet. Zur Empfänglichkeit von Europäischen Welsen und Aalen lagen bisher keine Daten vor. Die Ergebnisse der Infektionsversuche liefern klare Hinweise dafür, dass Europäische Welse gegenüber dem EUS empfänglich sind, während Aale nicht und Regenbogenforellen nur geringgradig empfänglich zu sein scheinen.

Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung. Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden. Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel (Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von 3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert, wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt, jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt voneinander untersucht. Die Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene. Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt. Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert. Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst werden, untersucht werden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Vorkommen der Erreger FSMEV und Borrelia sp. in Zecken und Wildmäusen in ausgewählten Gebieten Bayerns zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurden insgesamt 836 Wildmäuse in den Gebieten Erlangen, Grafrath und Traunstein sowie 1552 Zecken in Münchens Parkanlagen und in Schöngeising gefangen. Für die Untersuchung der Proben erfolgte die Etablierung neuer, hochsensitiver nested PCRs. Für das FSME-Virus wurde das Hüllgen-(E-) Protein als Zielgen verwendet und eine Nachweisgrenze von 0,4 TCID50 ermittelt. Zum Nachweis von Borrelien DNS diente das OspA-Gen, die Nachweisgrenze betrug 64 DNS Moleküle pro PCR Ansatz. Die Spezifität konnte anhand von 11 Stämmen gezeigt werden. Eine Inhibition der PCRs durch Probenmaterial wurden in Vorversuchen ausgeschlossen. Um die Qualität der extrahierten RNS bestätigen zu können, wurden interne Kontrollen durchgeführt, die sogenannte house-keeping Gene (Zecke: 16sRNS; Maus: Cytochrom b) als Zielsequenz hatten. Positive Proben wurden sequenziert und die ermittelten Daten für phylogenetische Analysen verwendet. In keiner der untersuchten 359 Wildmausproben und 1552 Zeckenproben konnte FSMEV nachgewiesen werden, was auf ein niedriges Infektionsrisiko mit FSMEV in den Landkreisen Erlangen, Fürstenfeldbruck, Traunstein und München hinweisen könnte. In 836 Wildmausproben konnte in 91 Proben Borrelien DNS nachgewiesen werden, womit sich eine Gesamtprävalenz von 11 % ergab. Für das Gebiet Traunstein wurde mit 34 % die höchste Borrelien-Prävalenz ermittelt. In Erlangen lag die Prävalenz in den untersuchten Proben bei 26 % und in Grafrath ergab sich eine Borrelien Prävalenz von 6 %. Dabei war B. afzelii in allen Fanggebieten die am häufigsten isolierte Spezies (81 %). B. burgdorferi wurde in 6 %, B. garinii in 2 % der untersuchten Proben isoliert. Parasitenbefall, Gewicht und Gonadengröße konnten als Einflussfaktoren für die Befallshäufigkeit mit Borrelien ermittelt werden. Ebenso konnte eine jahreszeitliche Häufung der Borrelien-Infektionen beobachtet werden, die sich jedoch in den untersuchten Regionen unterschied. Da diese Untersuchung nur eine Momentaufnahme des Erregergeschehens in den ausgewählten Gebieten wiederspiegelt, werden in Zukunft weitere Studien erforderlich sein, auch um Veränderungen in der Erregerdynamik und der Erreger-Wirts-Beziehung erfassen zu können.

Infektionen der Tränenwege können sowohl bei Kindern als auch beim Erwachsenen zum Problemfall in der niedergelassenen Praxis werden. Stenosen und Tränenstau, welche sich vor allem an den physiologischen Engstellen der Tränenwege entwickeln, bieten ideale Bedingungen für ein Bakterienwachstum. Es kann selbst bei adäquater Therapie oft zu langwierigen und rezidivierenden Verläufen kommen. Probleme treten vor allem dann auf, wenn ohne entsprechenden Erregernachweis antibiotisch behandelt wird oder eine bereits chronisch gewordene Entzündung einer operativen Therapie vorenthalten wird. Die vorliegende retrospektive Studie basiert auf den Daten von 144 Patienten, die zwischen 1990 und 1998 in der Universitäts-Augenklinik München behandelt wurden. Von den 144 Patienten litten 64 Patienten an einer Dakryocystitis, 43 Patienten litten an einer Canaliculitis und 37 waren Kinder, welche eine eitrig infizierte Tränenwegsstenose hatten. Noch vor einer weiteren Diagnostik wurden mikrobiologische Probenentnahmen vorgenommen, das entnommene Probenmaterial sofort im mikrobiologischen Forschungslabor der Universitäts-Augenklinik München auf Kulturmedien übertragen sowie beurteilt. Bei sämtlichen Kulturen wurden zusätzlich Resistenzbestimmungen für verschiedene Antibiotika und Antimykotika durchgeführt. In 140 von 144 Fällen konnten mit der gewählten Methode zur Probenentnahme positive mikrobiologische Ergebnisse erzielt werden. Das Erregerspektrum umfasste 193 Keime, 149 (77,3%) grampositive, 40 (20,8%) gramnegative und außerdem 3 (1,9%) Pilze. Der Anaerobieranteil betrug 16% (31Keime), wobei sich die meisten Anaerobier bei Canaliculitiden fanden. Auffällig waren auch hier die oft vorkommenden Aktinomyzeten-Infektionen. Bei den Kindern fielen die häufigen Infektionen mit penicillinresistenten vergrünenden Streptokokken auf und die insgesamt am häufigsten nachgewiesenen Keime waren koagulasenegative Staphylokokken, gefolgt von Staphylococcus aureus und vergrünenden Streptokokken. Mit Hilfe wiederholt durchgeführter Antibiogramme konnte eine medikamentöse Therapie auch beim Vorliegen von Erregern mit multiplen Resistenzen effizient und innerhalb kürzester Zeit eingeleitet werden und der Heilverlauf vor und nach operativen Eingriffen erregerspezifisch unterstützt werden. Nach Vorliegen der mikrobiologischen Ergebnisse in den Gruppen A, B, C erfolgte in 51%, 18% bzw. 35% eine Umstellung der antibiotischen Therapie. Diese Zahlen zeigen, wie wichtig die Keimidentifizierung und Resistenzbestimmung bei der Behandlung von Tränenwegsinfektionen sind. Neben der Diagnose und der Erregeridentifikation wurde Alter, Geschlecht, die Dauer der Symptomatik, die vorangegangene Therapie und die anhand der mikrobiologischen Ergebnisse eingeleitete Behandlung dokumentiert und der Krankheitsverlauf evaluiert. Anderen Studien entsprechend überwog auch in dieser Untersuchung vor allem bei den Dakryocystitiden eindeutig das weibliche Geschlecht im postmenopausalen Alter. Bei den Kindern und Canaliculitiden konnte kein deutlich bevorzugtes Geschlecht festgestellt werden. Die Dauer der Symptomatik schwankte zwischen 5 Monaten (Median, Gruppe A), 6 Monaten (Median, Gruppe B) und sogar 24 Monaten (Median, GruppeC). Dies hing stark davon ab, ob es sich um einen akuten oder chronischen Prozess handelte. Die meisten (111 von 144 Patienten) der Patienten hatten bei der Vorstellung in der Klinik schon eine oder mehrere Vortherapien hinter sich. Dabei handelte es sich in den meisten Fällen um antibiotische Augentropfen und Spülungen und Sondierungen. Die in der Klinik angewendeten Therapien waren unterschiedlich erfolgreich. Konnten die angeborenen Stenosen gut durch Spülungen, Sondierungen und lokale Antibiotika behoben werden, so mussten bei den Dakryocystitiden meist systemische Antibiotika angewendet und operativ vorgegangen werden, um Beschwerdefreiheit zu erreichen. Das gleiche gilt für die Canaliculitiden, die nur durch eine operative Ausräumung der Tränenwege ausreichend therapiert werden konnten. Aus den Ergebnissen lassen sich folgende Therapieempfehlungen ableiten: Im akuten Stadium der Tränenwegsinfektionen steht die Antibiose im Vordergrund und sollte bei schweren Krankheitsbildern systemisch, zum Beispiel mit einem Oralcephalosporin (Cefalexin), erfolgen. Dies wird durch eine lokale Behandlung unterstützt. Besonders zu empfehlen sind Substanzen mit einem breiten Wirkungsspektrum, etwa ein Gyrasehemmer oder eine Kombination aus Polymyxin B, Neomycin und Bacitracin. Nach Abklingen der Infektion und einer wegweisenden Diagnostik ist meist eine operative Sanierung der Tränenwege durch eine Dakryocystorhinostomie notwendig, um erneuten Rezidiven vorzubeugen. Eine Art Sonderfall stellt die chronische Canaliculitis dar, die in der Praxis nicht selten fehlgedeutet wird. Hier sollten die Tränenkanälchen operativ eröffnet werden, da sich meist nur dadrch ein dauerhafter Therapieerfolg erzielen lässt. Begleitend sollte eine lokale Antibiose und Antibiotika-Spülungen der Tränenwege erfolgen. Viele Erkenntnisse früherer Studien konnten anhand dieser Arbeit bestätigt werden, wenngleich bisher noch keine vergleichbare Publikation mit derart ausführlichen und erfolgreichen Erregernachweisen mit Resistenzenbestimmungen existiert. Durch diese sorgfältige mikrobiologische Analyse konnte bei der Mehrzahl der Patienten eine gezielte und erregerspezifische Therapie eingeleitet oder umgestellt werden, so dass die Effizienz der Behandlung bedeutend verbessert werden konnte. Es wurden auch kaum beachtete Tendenzen aufgezeigt, die zukünftig bei der Therapie von Infektionen der Tränenwege berücksichtigt werden sollten.