Podcasts about versuchsverlauf

Die Mastitis des Rindes ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchwirtschaft. Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) zählen zu den wichtigsten Mastitiserregern, die jedoch zumeist sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. So verursacht E. coli hauptsächlich transiente, akute klinische Mastitiden, während S. aureus als bedeutendster Verursacher chronischer bis subklinischer Mastitiden mit persistierendem Verlauf angesehen wird. In den letzten Jahrzehnten wurde die Pathophysiologie der entzündeten Milchdrüse eingehend wissenschaftlich bearbeitet. Frühe Zeitpunkte einer intramammären Infek-tion, zu denen die Pathogene zwar bereits erkannt wurden, aber noch keine klinischen Symptomen in Erscheinung getreten sind, wurden bislang in vivo noch nicht untersucht. Zu den ersten wirtsseitigen Ereignissen nach dem Eindringen und Erkennen der Patho-gene zählen Veränderungen in der Abundanz von mRNA-Transkripten immun-relevanter Gene. Vertreter dieser differentiell exprimierten Gene gehören z.B. zu den Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Diese sollen es dem Wirt ermöglichen, eine adäquate Immunantwort zu initiieren, welche als entscheidend für den klinischen Verlauf der Erkrankung gilt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur Simulation der ersten 3 h nach dem Eindringen der Pathogene E. coli und S. aureus in das Euter etabliert. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Untersuchung von Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene nach unterschiedlich langer Erregerexposition (1-3 h) in verschiedenen Kompartimenten der Milchdrüse. Dabei wurden die Lokalisationen Zitzenzisterne (ZZ), Drüsenzisterne (DZ) und das ventrale Euterparenchym (EU) näher untersucht. Großes Augenmerk lag auf einer strengen Standardisierung der Versuchs-tiere, um die Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse sicherzustellen. Der Versuch umfasste 12 erstlaktierende Kühe der Rasse Holstein-Friesian mit makelloser Allgemein- und Eutergesundheit und einer Zellzahl < 50.000/ml Milch in allen 4 Eutervierteln. Bei den Tieren wurden 3 Euterviertel jeweils sequentiell über einen Zeitraum von 1, 2 und 3 h entweder mit 5*106 CFU E. coli1303 (n = 6) oder S. aureus1027 (n = 6) intrazisternal inokuliert. Ein Kontrollviertel blieb unbehandelt und diente der Ermittlung von Basisexpressionswerten. Mit Hilfe der unterschiedlich lange inokulierten Viertel konnte ein zeitlicher Verlauf der Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene extrapoliert werden. Wie erwartet traten innerhalb des dreistündigen Versuchszeitraumes keinerlei klinische Effekte bei den Versuchstieren auf. Die innere Körpertemperatur, der Leukozytengehalt im Blut, der SCC und verschiedene Milchinhaltsstoffe erfuhren keine Veränderungen, die auf die Pathogen-Exposition zurückzuführen waren. Durch wiederholte Unter-suchung von Milchproben im Versuchsverlauf wurde die bakterielle Vermehrung analysiert. Hierbei konnte eine Vervielfachung von E. coli um durchschnittlich das 30-fache festgestellt werden, wohingegen sich S. aureus innerhalb der ersten 3 h p. inoc. vergleichsweise schwach vermehrte (durchschnittlich 1,8-fach). Die beiden im Tiermodell verwendeten Bakterienstämme wurden parallel in vitro in Milch und in Nährmedium kultiviert, um deren Wachstum und Adaptationsfähigeit zu untersuchen. E. coli erreichte nach 14-stündiger Inkubation in Milch ein Maximum von 1,2*109 ± 2,5*108 CFU/ml (MW ± SD), während S. aureus mit 5,3*108 ± 8,9*108 CFU/ml (MW ± SD) eine deutlich schwächere und heterogenere Vermehrung zeigte. Im Anschluss an diese Vorinkubation in Vollmilch wurde untersucht, ob sich die Pathogene an das spezifische Wachstumsmedium Milch anpassen konnten. Nach Umsetzen in frische Vollmilch zeigten die Pathogene jedoch kein verbessertes und beschleunigtes Wachstum im Vergleich zu in standardisiertem Medium vorkultivierten Bakterien. Um die Vergleichbarkeit mit früheren Experimenten sicherzustellen, wurden E. coli und S. aureus deshalb mit Nährmedium für die in vivo-Versuche präpariert. Drei Stunden nach Inokulation des ersten Euterviertels wurden die Tiere getötet und Gewebeproben innerhalb von 20 min aus den drei zu untersuchenden Lokalisationen (ZZ, DZ, EU) der einzelnen Euterviertel gewonnen. Die Proben wurden unmittelbar nach Entnahme in Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei -80°C tiefgefroren. Im Rahmen weiterer Untersuchungen fand dann die mRNA-Extraktion sowie die Analyse der Transkript-Abundanzen entzündungsrelevanter Kandidatengene (IL6, TNF, CXCL8, CCL20, S100A9, LAP, LCN2, MX2 und CYP1A1) mittels qRT-PCR statt. Die Auswahl geeigneter Gene erfolgte sowohl anhand eines orientierenden Vorversuchs in vivo als auch anhand bekannter, in vergleichbaren in vitro-Experimenten regulierten Genen der Milchdrüsenepithelzelle. Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsänderungen nach Kontakt mit E. coli deutlich stärker und homogener ausfielen als nach Kontakt mit S. aureus. Bereits nach 1-stündiger Erregerexposition konnten signifikante Steigerungen der mRNA-Expression einiger Gene verzeichnet werden. Dies galt vor allem für die Chemokine CCL20 und CXCL8 sowohl nach Exposition mit E. coli, als auch mit S. aureus. Für die Zytokine IL6 und TNF konnte eine rasche mRNA-Expressionssteigerung nach 1-stündiger intramammärer Inokulation von E. coli nachgewiesen werden, während eine Regulation im Euter mit S. aureus inokulierter Tiere erst nach 2 h und vergleichsweise schwächer eintrat. Die antibakteriell wirkenden Faktoren S100A9 und LAP waren den Chemo-kinen und Zytokinen zeitlich nachgeschaltet, wurden aber nur nach Exposition mit E. coli deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu in vitro-Untersuchungen mit Milch-drüsenepithelzellen konnte für die Gene LCN2, MX2 und CYP1A1 keine nennenswerte Regulation nach Inokulation mit E. coli und S. aureus festgestellt werden. Des Weiteren fiel auf, dass die untersuchten Kandidatengene invariant stärker in ZZ und DZ heraufreguliert wurden, als im EU. Meist ähnelten sich ZZ und DZ in Stärke und Verlauf der Expressionsänderung. Im ventralen Euterparenchym dagegen konnte nach Inokulation von E. coli nur für die Gene IL6, TNF, CXCL8 und S100A9 eine vergleichsweise schwache, aber statistisch signifikante Steigerung der mRNA-Expression aufgezeigt werden. Nach Inokulation mit S. aureus konnte in dieser Lokalisation keine Hochregulation der untersuchten Kandidatengene festgestellt werden. Das in dieser Arbeit etablierte Tiermodell zeigt erstmalig in vivo die frühe patho-genspezifische und kompartimentabhängige Regulation immunrelevanter Gene im Eutergewebe der Milchkuh auf. Es bietet damit eine gute Basis für holistische Ansätze zur Untersuchung sehr früher Ereignisse bei der Wirt-Pathogen-Interaktion. Mittelfristig soll hiermit aufgeklärt werden, welche wirts- und pathogenseitigen Mechanismen zur Entstehung akuter und chronischer Mastitiden führen und welche Faktoren persistente Infektionen der Milchdrüse fördern oder verhindern. Detaillierte Kenntnisse über solche frühen Ereignisse ebnen den Weg, Ansätze für eine verbesserte Mastitis-Diagnostik, -Prophylaxe und -Therapie bei der bovinen Mastitis zu finden.

Ziel der Studie war es zu untersuchen, welche Beckengrößen, -formen und –anordnungen geeignet sind, den Nerzen eine weitgehende Ausübung ihres arteigenen Verhaltens zu ermöglichen. Von Ende Juli bis Anfang Dezember 2007 fand der erste Versuchsdurchgang (Grundlagenforschung) im Rahmen eines längerfristig angelegten Nerzprojekts statt. Für das Projekt wurden 40 amerikanische Nerze (Neovison vison) aus einer kommerziellen Pelztierfarm in zwei identisch aufgebauten Freigehegen (ca. 300 m2) in zwei Gruppen (A und B) mit jeweils 20 Tieren aufgestallt. Die Tiere wurden vom Muttertier mit neun Wochen abgesetzt und in der 13. LW in das Versuchsgehege eingesetzt. Der Vergleich dreier unterschiedlicher Ausführungen ist besonders wichtig, um geeignete Ableitungen für die Ausgestaltung der Vorgaben der Tierschutz- Nutztierhaltungsverordnung (2006) zu ermöglichen. In den beiden Arealen wurden den Nerzen je drei verschiedene Wasserbereiche angeboten, die sich jeweils in Form, Tiefe und Fläche voneinander unterschieden. Es standen eine rechteckige „Schwimmrinne“ (Wasserfläche ca. 20,5 m2, Tiefe ca. 30 cm), ein runder „Teich“ (Wasserfläche ca. 4,9 m2, Tiefe ca. 80 cm) und ein fließender „Bach“ (Länge ca. 10 m, Tiefe 3 bis 4 cm mit zwei gumpenartigen Vertiefungen) zur Verfügung. Die Beurteilung des Tierverhaltens erfolgte mittels Direkt- und Videobeobachtung. Es wurde insgesamt fünfmal jeweils in ca. einmonatigem Abstand an sieben aufeinanderfolgenden Tagen beobachtet. Die Direktbeobachtung wurde mit der „Scan Sampling“-Methode nach Martin und Bateson (1993) durchgeführt. Alle 2,5 min wurden folgende Verhaltensweisen der Tiere erfasst: wasserassoziiertes Verhalten, jeweils „an“ (mind. eine Pfote am Beckenrand) oder „in“ (alle vier Pfoten im Wasser) der Schwimmrinne, dem Teich oder dem Bach. Bei dem Verhalten auf dem Gelände wurde unterschieden zwischen Sozialverhalten, Gehen/Stehen/Laufen/, Ruhen, Trinken an den Nippeltränken, Graben, Klettern, Wälzen, Tragen und Sonstiges. Für die Videobeobachtung wurden pro Areal drei Kameras installiert, jeweils eine Kamera pro Wasserbereich. Die Aufnahmen erfolgten an jeweils sieben aufeinanderfolgenden Tagen vom Morgengrauen bis zur Abenddämmerung in Echtzeit. Es wurden von je drei Tagen pro Beobachtungswoche jeweils zwei Stunden in den Hauptaktivitätszeiten der Tiere ausgewertet. Für die Auswertung wurden die oben beschriebenen wasserassoziierten Verhaltensweisen herangezogen. Die Auswertung erfolgte mittels „behaviour sampling“ und „continuous recording“ (Martin und Bateson, 1993). Um eine Aussage über die Nutzung der Wohnkästen und den Aktivitätsrhythmus der Nerze zu erzielen, wurden alle Tiere mit einem Mikrochip versehen und alle Wohnkästen der Gruppe A mit einem elektronischen Registrierungssystem ausgestattet, das am Institut für Landtechnik, entwickelt wurde. Mit diesem elektronischen Registrierungssystem konnte sekundengenau individuell für jeden Nerz erfasst werden, ob er sich im Wohnkasten, im Schlupfrohr oder auf dem Gelände befand. Somit war eine Aussage über Ruhe- und Aktivitätsphasen, deren tageszeitlichen Schwankungen und deren Dauer möglich. Diese Daten wurden auch zur Festlegung der Auswertungszeiten der Videobeobachtung herangezogen. Des Weiteren sollte mittels des elektronischen Registrierungssystems geklärt werden, ob mehrere Nerze einen Wohnkasten nutzen und ob die Tiere bestimmte Wohnkästen zum Ruhen bevorzugen. Sowohl die Ergebnisse der Direkt- als auch der Videobeobachtung zeigten, dass die Nerze beider Versuchsgruppen grundsätzlich alle drei angebotenen Wasserbecken annahmen und von Versuchsbeginn bis zum Versuchsende nutzten. Diese grundsätzlichen Beobachtungen stehen im Einklang mit dem in der Literatur geschilderten Verhalten wildlebender Nerze, die semiaquatisch leben. Dabei konnte im Versuchsverlauf von Ende Juli bis Anfang Dezember eine insgesamt tendenziell steigende Nutzungsintensität festgestellt werden. Bei dem Vergleich der Becken miteinander zeigten die Ergebnisse eine eindeutige Präferenz für die Schwimmrinne. Diese wies über den gesamten Zeitraum gesehen die längste Aufenthaltsdauer auf. Der Bach wurde insgesamt am kürzesten aufgesucht. Zu beachten ist dabei, dass bei den statistischen Auswertungen die Becken als in sich geschlossene Einheit betrachtet wurden, obwohl sie sich in jeweils mehreren Faktoren, wie Umfang, Wasserfläche, Wasservolumen und Entfernung zu den Wohnboxen, unterschieden. Da die Haltung von Jungnerzen in der Gruppe mit dem freien Zugang zu Schwimmbecken erfolgreich war, sollte dieser Ansatz weiter verfolgt werden. Die Ergebnisse dieser Studie legen die Verwendung eines Wasserbeckens mit ca. 30 cm Tiefe und eine Größe von 1 m2 pro Tier nahe. Fließendes Wasser ist nach den Ergebnissen dieser Studie nicht notwendig. Dies stimmt weitgehend mit den Anforderungen der aktuell gültigen Tierschutz- Nutztierhaltungsverordnung (2006) überein, die ein Wasserbecken mit 30 cm Tiefe und einer Mindestfläche von 1 m2 vorschreibt. Die Ergebnisse des elektronischen Registrierungssystems zeigten, dass die Nerze nach einer mehrwöchigen Eingewöhnungsphase einen festen Aktivitätsrhythmus entwickelten, der jeweils in der Morgen- und in der Abenddämmerung einen Aktivitätspeak aufwies. Tagsüber hielten sich die meisten Tiere in den Wohnkästen auf und schliefen. Im Versuchsverlauf stieg die in den Wohnkästen verbrachte Zeit an, das während der Aktivitätsphasen beobachtete Verhalten in und an den Wasserflächen blieb jedoch konstant bzw. nahm tendenziell zu. Die Nerze hielten sich bevorzugt in den Wohnboxen auf, die zu den Futterstellen hin ausgerichtet waren, und verbrachten weniger Zeit in den Boxen, die zur Wasserseite hin lagen. Sie entwickelten dabei (ebenfalls nach einer Eingewöhnungsphase) Präferenzen für bestimmte Wohnboxen auf beiden Seiten. Bestimmte Boxen dienten als Schlafboxen und wiesen überdurchschnittlich lange Aufenthaltsdauern auf. Andere Boxen wurden als „Kotboxen“ verwendet und immer nur sehr kurz aufgesucht. Diese Wohnboxpräferenz variierte im Lauf der Zeit. Die einzelnen Tiere entwickelten dagegen keine Standorttreue hinsichtlich bestimmter Wohnboxen. Gemeinsame Aufenthalte von zwei bis sechs (maximal zehn) Tieren kamen sehr häufig vor, sodass ein Tier-/Wohnboxverhältnis von 1:1 nicht erforderlich zu sein scheint, obwohl Nerze in der Literatur als Einzelgänger beschrieben sind.

In der Literaturübersicht wird der derzeitige Kenntnisstand zum epizootischen ulzerativen Syndrom (EUS), einer Erkrankung bei zahlreichen Süß- und Brackwasserfischen, die sich innerhalb kurzer Zeit in vielen Teilen der Welt ausgebreitet hat und eine potentielle Bedrohung für europäische Süß- und Brackwasserfische darstellt, zusammengefasst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es zuallererst, eine PCR-Methode geeignet zum Nachweis von Aphanomyces invadans direkt aus erkrankten Fischen zu entwickeln, und weiterhin, die Empfänglichkeit ausgewählter Süßwasser-fischarten, die von Bedeutung für die europäische Aquakultur sind, gegenüber diesem Erreger zu untersuchen. Hierzu wurde eine Semi-Nested PCR-Methode angewandt, die Teile der ITS-Region amplifiziert (Genabschnitte, die zwischen den die ribosomale RNA kodierenden Genen liegen). Die PCR-Methode erwies sich sowohl als hochspezifisch gegenüber allen untersuchten Aphanomyces invadans-Stämmen als auch hochsensitiv. Die Spezifität wurde unter Einsatz von DNA verschiedener Oomyceten, anderer relevanter Pathogene und Kommensalen sowie Wirts-DNA in die PCR untersucht. Die untere Nachweisgrenze der Semi-Nested PCR lag bei Einsatz von genomischer DNA aus Mycel bei 25 fg und bei Einsatz von Aphanomyces invadans-Zoosporen in die DNA-Extraktion bei 0,025 Zoosporen. Um die PCR-Methode an diagnostischen Proben zu testen, wurden Infektionsversuche durchgeführt. Hierzu wurden Blaue Fadenfische (Trichogaster trichopterus) und drei in Deutschland wirtschaftlich bedeutsame Fischarten ausgewählt: Regenbogenforellen (Oncorynchus mykiss), Europäische Welse (Silurus glanis) und Europäische Aale (Anguilla anguilla). 36 Fischen von jeder der vier Spezies wurde intramuskulär eine Aphanomyces invadans-Sporensuspension injiziert. Während eines Versuchszeitraumes von 35 Tagen wurden laufend Fische zu vorher festgelegten Entnahmezeitpunkten euthanasiert, auf Hautveränderungen untersucht und Probenmaterial aus dem Injektionsbereich für die PCR-Untersuchung und eine histopathologische Untersuchung entnommen. Die Fadenfische und die Welse zeigten im Versuchsverlauf deutlich sichtbare, teilweise ulzerative Hautläsionen. Während bei der histopathologischen Untersuchung der Fadenfische die EUS-typischen mykotischen Granulome, die die Hyphen umschlossen, auftraten, konnten bei den Welsen zwar zahlreiche Hyphen nachgewiesen werden, die Entzündungreaktion bestand hier jedoch aus einer losen Anordnung von Makrophagen, wenigen Lymphozyten und Riesenzellen. Bei den Regenbogenforellen traten nur geringgradige, bei keinem Tier ulzerative Hautveränderungen auf. Nur bei vier Regenbogenforellen konnten die EUS-typischen mykotischen Granulome nachgewiesen werden. Keiner der Aale wies makroskopisch sichtbare Hautveränderungen auf mit Ausnahme eines Aals mit einer geröteten Injektionsstelle, der an Tag 2 post infectionem entnommen wurde. Bei diesem Tier konnten mit Hilfe der Grocott-Reaktion lokalisiert einzelne Hyphen sichtbar gemacht werden. Das Auftreten mykotischer Granulome oder einer zellulären Wirtsreaktion konnte bei den Aalen nicht beobachtet werden. Die PCR-Methode wurde für den Nachweis von Aphanomyces invadans aus den Fischen der Infektionsversuche angewandt. Der Erregernachweis gelang bei allen Fischen, die makroskopisch sichtbare Hautläsionen zeigten. Bei den Fadenfischen und den Welsen gelang der Erregernachweis bei allen Versuchsgruppen ab dem ersten Entnahmezeitpunkt an Tag 1 p. i. Die Ergebnisse zeigen, dass die PCR-Methode sich für den Nachweis von Aphanomyces invadans bei erkrankten Fischen eignet. Zur Empfänglichkeit von Europäischen Welsen und Aalen lagen bisher keine Daten vor. Die Ergebnisse der Infektionsversuche liefern klare Hinweise dafür, dass Europäische Welse gegenüber dem EUS empfänglich sind, während Aale nicht und Regenbogenforellen nur geringgradig empfänglich zu sein scheinen.

Vorliegende Studie befasst sich mit den hämodynamischen Veränderungen sowie den Veränderungen des Endothelin-1 (ET-1) Plasmaspiegels am aortopulmonalen Shuntmodell beim Schwein. Hierzu werden in Vorversuchen die akuten hämodynamischen Veränderungen, wie sie nach Shuntimplantation auftreten, an Ferkeln im Alter von 3 bis 8 Wochen erfasst. Dabei ist ein signifikanter Abfall des mAoP sowie ein signifikanter Anstieg des mPAP, sowie PVR bei nahezu gleichbleibendem pulmonalarteriellem Fluss zu verzeichnen. Schließlich wird an 12 Absatzferkeln im Alter von durchschnittlich 32 Tagen wie auch schon bei der Vorversuchsgruppe ein aortopulmonaler Shunt mit einem Durchmesser von 6 mm und einer Länge von ca. 2 cm unter Propofolnarkose implantiert. Dabei werden vor Shuntimplantation die Basalwerte der Hämodynamik sowie des ET-1-Plasmaspiegels erfasst. Nach Shuntimplantation kommt es zu einem signifikanten Anstieg des ET-1, der sich bis zum Ende der Operation weiter erhöht. Die postoperative Mortalität der Shuntgruppe liegt bei 50%. Von diesen sterben 2 Schweine bereits wenige Stunden nach dem Eingriff an akutem Lungenödem. Der weitere Versuchsverlauf erstreckt sich über 5 Wochen. In die Kontrollgruppe gehen 4 Tiere in die Endauswertung ein, in die Shuntgruppe 6 Tiere. Bei 5 Shuntschweinen ist nach 5 Wochen der Shunt mit einem organisierten Thrombus verschlossen, lediglich bei einem Schwein ist der Shunt durchgängig. Deutliche hämodynamische Unterschiede von der Shunt- zur Kontrollgruppe bestehen zur Finalmessung im pulmonalarteriellen sowie rechtsventrikulären Druck. Die ET-1-Plasmakonzentration der Shuntgruppe ist im Vergleich zum Ausgangswert immer noch erhöht, jedoch nicht signifikant unterschiedlich zur Kontrollgruppe. In Lungenbiopsien zeigen sich nach 5 Wochen in der Shuntgruppe Parenchymverdichtungen, beim Shuntschwein mit offenem Shunt zusätzlich perivaskuläre Ödeme und Entzündungsreaktionen sowie Gefäßthromben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aortopulmonale Shuntmodell am Schwein dienliche Hinweise bezüglich der ET-1-Ausschüttung aus Endothelzellen bei erhöhtem Fluss liefert, sich jedoch wegen der Neigung zur Thrombenbildung im Shunt nicht zum Langzeitversuch eignet.