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Klinische Studien zeigen, dass die Zusammensetzung von zirkulierenden, freien AS im Blut, ein Marker für monogene und multigenetische Krankheiten ist. Die Analyse von hohen Probandenzahlen in klinischen Studien wird oftmals durch aufwendige und lange Probenaufarbeitungsschritte begrenzt. Im Rahmen der Metabolomics Plattform, die im Dr. von Haunerschen Kinderspitals etabliert wurde, wurde eine Hochdurchsatzmethode entwickelt, die eine selektive, sensitive, präzise und robuste Quantifizierung von 22 AS aus kleinen Probenvolumina ermöglicht. Im Laufe der Zeit konnten noch weitere Aminosäuren zur Methodik hinzugefügt werden. Dabei können innerhalb von 36 Stunden 96 Proben analysiert werden. Mit Hilfe eines deuterierten, interenen Standards in methanolischer Lösung werden Proteine aus nur 10 μL Probenvolumen gefällt. Zur Quantifizierung der AS wird anschliessend der eingedampfte Überstand derivatisiert und in Kombination mit einem Ionen-Paar- Reagenzes chromatographiert. Der Methodenaufarbeitung liegt eine umfassende und ausführliche Validierung zugrunde, die einer Interday Precision von 3.1 -10.8 % für alle Analyten erzielt. Zusätzlich unterzieht sich unsere Methode jedes Jahr an einem Ringversuch, der eine exakte Bestimmung aller Analyten gewährleistet. Im Zusammenhang mit der Programmierung des Stoffwechsels durch die Ernährung im Säuglingsalter wurde die neu entwickelte AS-Methode zur Quantifizierung von 726 Serum Proben in einer randomizierten klinischen Studie eingesetzt. Dabei wurde der Bezug zwischen Proteinzufuhr (Formelnahrung mit hohem Eiweißanteil bzw. niedriegem Eiweißanteil) und AS-Profil bei 6 Monate alten Säuglingen analysiert. Eine signifikante Veränderung der Plasmakonzentrationen zeigte sich in der Gruppe der formelernährten Kindern mit hohem Proteinanteil für folgende AS: BCAA, Gly, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp und Tyr. Essentielle AS werden über die Nahrung aufgenommen und vermutlich über das L-Transportsystem in die Zirkulation freigesetzt. Im Vergleich dazu werden nicht essentielle AS im Darm katabolisiert und mit Hilfe der de novo Synthese in gleichbleibenden Konzentrationen reguliert, sodass kein signifikanter Unterschied in beiden Gruppen beobachtet wurde. Durch eine proteinreiche Nahrung können AS vermehrt an der Aktivierung von Wachstumshormonen (mTOR, IGF-1) teilhaben, was sich im vermehrten Zellwachstum und –proliferation manifestiert. Nichts desto trotz kann die vermehrte Wachstumshormonaktivierung Krankheiten wie Insulinresistenz, Diabetes oder auch Übergewicht hervorrufen. Aufgrund des erhöhten Krankheitsrisikos ist einerseits von einer proteinreichen Ernährung im frühen Säuglingsalter abzuraten, andererseits kann das Stillen bzw. eiweißänhnliche Brustmilchzusammensetzung gesundheitsunterstützend sein. Auch im Rahmen eines Supplementierungsprojektes bei Kühen, hat sich die neu entwickelte AS-Methode bewährt. Dazu wurden jeweils 10 Kühe kurz vor und nach der Geburt mit CLA (CLA-Gruppe) oder mit Linolsäure (Kontroll-Gruppe) supplementiert. Ziel der Studie war es, den Zusammenhang zwischen CLA Supplementierung und AS- Profil im Blut zu analysieren. Dazu wurden zu insgesamt 8 Zeitpunkten vor und nach der Geburt, Blutproben entnommen. Es kristallisierten sich 3 verschiedene Zeitverläufe heraus, wobei die meisten AS-Konzentrationen nach der Geburt abfallen und langsam wieder auf ihre Ausgangswerte ansteigen. AS wie Glu sinken vor der Geburt stark ab, was dafür sprechen könnte, dass der Fetus mit ausreichend Glu versorgt wird und nach der Geburt vermehrt in die Milch transportiert wird. Gly, HPro, MHis und Ser steigen bis zur Geburt an und fallen dann wieder ab wobei Mhis durch den Muskelproteinabbau keinen Konzentrationsanstieg in den ersten 12 Laktationswochen erfährt. Die Supplementierung mit CLA zeigte keinen signifikanten Unterschied beider Gruppen auf das AS-Profil und zeigte somit keine Auswirkungen auf die AS-Synthese.

Dem Nachweis von Drogen und psychotropen Substanzen im Speichel kann bei verschiedenen klinisch-forensischen Fragestellungen, zum Beispiel im Bereich der Verkehrsmedizin, eine große Bedeutung zukommen. Die Reliabilität des so genannten Drogenscreenings im Speichel mit Hilfe des CEDIA-Verfahren sowie mit dem EMIT-Verfahren (für Cannabinoide) untersucht. Für die Speicheltestung wurde durch Vorversuche eine untere Nachweisgrenze (LOD) festgelegt. Die Festlegung des jeweiligen Cut-offs der einzelnen Analyte erfolgte nach Auswertung der ROC-Kurve. Sämtliche Urinproben wurden mit dem CEDIA-Verfahren sowie mit Urinstäbchen (GLORIA-Verfahren) untersucht. Zur Auswertung kamen 96 Speichel- und 103 Urinproben von insgesamt 31 opiatabhängigen Patienten. Es zeigte sich, dass im Speicheltestverfahren nur für Methadon vergleichbar gute Ergebnisse wie im Urintestverfahren erreicht werden konnten. Nur mäßige Testergebnisse hinsichtlich der Aussagefähigkeit der Immunoassayverfahren im Speichel ergaben sich für die meisten anderen untersuchten Drogen wie Amphetamine und Barbiturate, Kokain und Opiate. Für Cannabinoide und Benzodiazepine erscheint diese Methode nicht geeignet zu sein. Dagegen zeigten sich bis auf eine niedrige Sensitivität bei Kokain bei allen Analyten mit Urinstäbchen gute Nachweisergebnisse. Die Kombination von einem Immunoassayverfahren und Bestätigungsanalysen, wie zum Beispiel Gaschromatographie (Massenspektroskopie) im Urin, erscheint daher weiterhin als die Methode der ersten Wahl bei nicht invasiven Testverfahren. Dagegen ist der Einsatz von Speicheltestverfahren, etwa in dem Bereich der Verkehrsmedizin eher kritisch zu werten und erscheint am ehesten bei Substitutionsbehandlungen als zusätzliches Testverfahren sinnvoll.

Die Belastung des Menschen mit verschiedenen alkylierenden Agenzien ist auf unterschiedliche Quellen zurückzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten durch ein Biomonitoring insbesondere die Beiträge von Nahrung, Rauchen und Passivrauchen möglichst umfassend geklärt werden. Als Biomarker wurden neben Hämoglobinaddukten methylierender, ethylierender, hydroxyethylierender und cyanoethylierender Precursoren mit dem N–terminalen Valin die korrespondierenden alkylierten Mercaptursäuren gewählt, erweitert um eine hydroxypropyl-alkylierte Mercaptursäure. Zur Erfassung der Gesamtbelastung sollte neben den Mercaptursäuren auch die Thioether-Gesamtausscheidung bestimmt werden. Um das Gesamtbild abzurunden, ist allerdings auch die Erfassung von Addukten auf dem Level der DNA nötig. Diese Marker sollten möglichst mit genetischen Prädispositionen in Verbindung gebracht werden, wobei ein Hauptaugenmerk auf den fremdstoffmetabolisierenden Phase-II-Enzymen der Glutathion-S-Transferasen GSTM1, GSTT1 und GSTP1 lag. Die Hauptaufgabe der vorliegenden Arbeit bestand darin, geeignete Methoden zum Nachweis der genannten Verbindungen zu entwickeln oder in geeigneter Weise weiterzuentwickeln, so dass unter den Gesichtspunkten der Anwendbarkeit im Humanbiomonitoring im Rahmen einer Studie bei relativ geringem Aufwand, niedrigen Kosten pro Analyse, hoher Selektivität und Sensitivität bei paralleler Gruppenbestimmung ein möglichst effektives Biomonitoring möglich ist. Dazu wurde eine publizierte Methode der DFG zur Bestimmung der Hämoglobinaddukte so weiterentwickelt, dass sie die Simultanbestimmung des Ethylvalinadduktes mittels GC-MS-EI gestattet. Zum Nachweis der Mercaptursäuren alkylierender Verbindungen aus Humanurin wurde eine neue Methode entwickelt, die sich auf eine einfache Probenvorbereitung durch Festphasenextraktion und anschließende Detektion mittels HPLC-APCI-MS/MS stützt. Die Ionisierung der Analyten durch die APCI-Quelle hat gegenüber einer Ionisierung durch Elektrospray-Verfahren wesentliche Vorteile vor allem im Routinebetrieb. Durch den Einsatz des Tandem-Massenspektrometers und Messung selektiver Ionenübergänge ist eine zuverlässige Identifizierung der gesuchten Komponenten gewährleistet. Obwohl Bestimmungen der Gesamt-Thioetherausscheidung schon lange bekannt sind, war die Anwendbarkeit der Methodik insofern begrenzt, als die Probenvorbereitung und die Messungen einen für größere Studien nicht vertretbaren Zeitaufwand bedeuteten. Durch die im Rahmen dieser Arbeit eingeführten Modifikationen ist es möglich, den Arbeitsablauf in den meisten Schritten zu beschleunigen und den Probendurchsatz damit zu erhöhen. Die Kenndaten der Methode werden durch die erhöhte Anzahl an Messungen pro Probe verbessert. Durch den Einsatz eines Multikanalreaders kann die Messung und Auswertung gleichzeitig rechnergestützt erfolgen. Die Bestimmung von 3-Methyl- und 3-Ethyladenin in Urin als Marker für die Alkylierung der DNA setzte bislang im Bereich einer Hintergrundbelastung den Einsatz immunochemischer Methoden voraus. Durch die neuentwickelte Methode reduzieren sich die Probenvorbereitung und –Anreicherung auf eine Festphasenextraktion. Vorteil davon ist ein erhöhter Probendurchsatz bei reproduzierbaren Bedingungen. Die Messung mit HPLC-APCI-MS/MS gestattet die sichere Quantifizierung selbst unbelasteter Nichtraucherproben mit hoher Genauigkeit. Auch in diesem Falle zeigt die Ionisierung mit APCI bedeutende Vorteile gegenüber der Elektrospray-Ionisation, vor allem bei den bedingt durch die hohe Konzentrierung stark matrixbelasteten Proben. Im Rahmen einer longitudinalen Feldstudie mit 69 Probanden wurden die Thioether, Mercaptursäuren, sowie die Hämoglobin- und DNA-Addukte alkylierender Verbindungen untersucht. Die Ergebnisse bestätigen andere Studien, wonach Aktivraucher bezüglich der MeVal-, HyEtVal- und CyEtVal-Addukte erhöhte Level aufweisen. Gleiche Resultate sind für die Mercaptursäuren MMA und HPMA, die Thioether-Gesamtausscheidung sowie für die untersuchten DNA-Addukte gefunden worden. Die vom Probanden selbst berichtete Passivrauchbelastung hatte keinen messbaren Einfluss auf die Biomarker der Exposition gegenüber alkylierenden Agenzien. Es wurde auch kein Zusammenhang zwischen der durch Biomonitoring ermittelten Belastung und der durch Cotinin im Urin und Plasma bzw. der objektiv gemessenen Passivrauchbelastung (Nikotin auf Passiv-Diffusionssammlern) gefunden. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Exposition gegenüber alkylierenden Verbindungen aus weiteren exogenen und endogenen Quellen einen wesentlichen Beitrag zur Gesamtexposition leistet. Im Falle der Nahrung sind die Precursoren allerdings in der Regel zu unspezifisch, als dass sie bestimmten biochemischen Effektmarkern zugeordnet werden könnten, so dass keine Effekte beobachtet werden können und eine eventuelle zusätzliche Belastung beispielsweise durch Passivrauchen im Hintergrundrauschen untergeht. Allerdings lässt sich ein Einfluss der genetisch bedingten Enzymausstattung auf die Level bestimmter Marker feststellen. Vor allem die Träger des GSTT1*0-Gens zeigen eine verringerte Mercaptursäurebildung und ähnlich wie bei doppelten Nullgenotypen GSTM1 T1 vermehrte Bildung von Hämoglobinaddukten, zumindest für methylierende Spezies. Bei hydroxy- und cyanoethylierenden Verbindungen lässt sich allenfalls ein Trend erkennen, der jedoch nicht signifikant ist. Dies ist vermutlich auf die zu geringe Anzahl an Probanden und den Einfluss weiterer im Rahmen einer Feldstudie nicht kontrollierbarer Parameter zurückzuführen.