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Latent infizierte Nutztiere, und so auch Schafe und Ziegen, können Träger verschiedener lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger sein, ohne dabei selbst klinische Symptome zu zeigen. Da es im Rahmen des Schlachtprozesses sowie der weiteren Verarbeitung zu einer Kontamination des Schlachttierkörpers und der Organe und somit zu einem Eintrag in die Lebensmittelkette kommen kann, ist es notwendig, das Vorkommen dieser Zoonoseerreger zu kennen, um das Risiko einer Kontamination abschätzen zu können. Das Ziel dieser Studie war, die Prävalenz lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger bei kleinen Wiederkäuern aus der Schweiz zu ermitteln, um somit ihre Bedeutung als Reservoir und Infektionsquelle für den Menschen beurteilen zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tonsillen und der Kot von 100 Schafen und 100 Ziegen auf das Vorkommen von thermotoleranten Campylobacter spp., Salmonella spp., enteropathogenen Yersinia spp., STEC sowie L. monocytogenes untersucht. Dabei handelte es sich jeweils um 50 adulte und 50 juvenile Tiere verschiedener landestypischer Rassen. Ein Teil der adulten Tiere war zum Zeitpunkt der Schlachtung trächtig. Im Rahmen der Fleischuntersuchung wurden bei einigen Tieren verschiedene pathologische Veränderungen festgestellt. Zunächst wurde eine direkte kulturelle Untersuchung aller ausgewählten Bakterien unter Verwendung von Selektivnährböden durchgeführt. Die anschließende Screeninguntersuchung auf das Vorkommen thermotoleranter Campylobacter spp., Salmonella spp. und L. monocytogenes erfolgte mittels VIDAS®, der Nachweis enteropathogener Yersinia spp. und STEC mittels Real-Time PCR. Positive Proben der Screeninguntersuchungen wurden dann mit Selektivnährböden kulturell untersucht. Weitergehend erfolgte eine Identifizierung präsumtiv gewachsener Einzelkolonien. Für thermotolerante Campylobacter spp., Salmonella spp. und L. monocytogenes wurde eine biochemische Identifizierung gewählt. Zur Identifizierung von STEC und enteropathogenen Yersinia spp. wurde anhand präsumtiver Einzelkolonien eine zweite Real-Time PCR durchgeführt. Abschließend wurden die Ergebnisse hinsichtlich des Alters der Tiere, des Trächtigkeitsstatus, des Vorkommens pathologischer Veränderungen sowie der Zugehörigkeit zu verschiedenen Rassen ausgewertet. In der Screeninguntersuchung mittels VIDAS® fiel die Nachweisrate für Salmonella spp. sowohl bei den Schafen (Tonsillen 100 %, Kot 95 %) als auch bei den Ziegen (Tonsillen 70 %, Kot 50 %) sehr hoch aus. Auffallend war dabei der hohe Anteil positiver Tonsillenproben. Auch thermotolerante Campylobacter spp. wurden häufig, jedoch nur in den Kotproben der Tiere (Schafe 75 %, Ziegen 85 %), nachgewiesen. Der Nachweis von L. monocytogenes fiel niedriger aus (Schafe 5 %, Ziegen 25 %), und war ebenfalls nur in den Kotproben möglich. In der Screeninguntersuchung auf enteropathogene Yersinia spp. waren lediglich 2 % der Schafe positiv für pathogene Y. enterocolitica (Tonsillen 1 %, Kot 1 %). STEC konnten bei 6 % der Schafe (Tonsillen 2 %, Kot 4 %) und 21 % der Ziegen (Tonsillen 9 %, Kot 12 %) nachgewiesen werden. Eine kulturelle Isolierung der in der Screeninguntersuchung positiven Ergebnisse war nur bei einem geringen Anteil der Proben möglich. Die biochemische Identifizierung erbrachte bei 9 Tonsillenproben von Schafen den Nachweis von Salmonella spp. Aus 5 Schafkotproben, 1 Ziegentonsille und 44 Ziegenkotproben konnten verschiedene apathogene Listeria spp. isoliert und identifiziert werden, jedoch aus keiner Probe L. monocytogenes. Alle STEC-positiven Tonsillenproben von Schafen, sowie 2 von 9 Ziegentonsillenproben ließen sich in der zweiten Real-Time PCR bestätigen. Die Auswertung des kulturellen Direktnachweises gab keinen Hinweis auf ein zum Zeitpunkt der Schlachtung akut infiziertes Tier. Insgesamt fiel die Nachweisrate pathogener Bakterien bei juvenilen Tieren höher aus als bei adulten Tieren. Der Vergleich der Ergebnisse erbrachte sowohl im Hinblick auf eine Trächtigkeit der Tiere als auch hinsichtlich des Vorkommens pathologischer Veränderungen bei keinen der untersuchten Bakterien eine statistische Signifikanz. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Nachweisrate und der Zugehörigkeit zu einer Rasse war lediglich bei der Identifizierung von Salmonella spp. erkennbar. Die Studie zeigt, dass Schafen und Ziegen eine wesentliche Bedeutung als Reservoir lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger zukommt. Die Untersuchungen ergaben, dass die Tonsillen insbesondere eine Infektionsquelle für Salmonella spp. und in geringerem Maße auch für STEC darstellen. Der Kot spielt v.a. bei der Übertragung von thermotoleranten Campylobacter spp. und Salmonella spp., aber auch von STEC und L. monocytogenes eine wichtige Rolle. Im Rahmen der Schlachtung kann es daher, sowohl ausgehend von einer fäkalen Verunreinigung, als auch durch das Entfernen der Tonsillen während der Fleischuntersuchung, zu einer Kontamination und einem Eintrag der Zoonoseerreger in die Lebensmittelkette kommen. Enteropathogene Yersinia spp. konnten insgesamt nur in sehr geringem Umfang nachgewiesen werden, so dass hier den kleinen Wiederkäuern als asymptomatische Trägertiere keine wesentliche Bedeutung beigemessen werden kann.

Yersinia (Y.) enterocolitica ist ein bedeutender Lebensmittelkeim, der vorwiegend in Schweinefleisch vorkommt. Kulturell ist er sehr schwer nachzuweisen, da er auf Selektivagar sehr schnell von anderen Keimen überwuchert wird. Zudem sind die kulturellen Isolierungsmethoden sehr zeitaufwendig und eine Aussage über pathogene oder apathogene Stämme kann aufgrund der Ergebnisse ohne weitere Diagnostik nicht getroffen werden. Aus diesen Gründen wird in der Diagnostik von Y. enterocolitica aus Lebensmitteln vermehrt der PCR-Nachweis eingesetzt, welcher innerhalb von Stunden, bei vorheriger Anreicherung nach einem Tag, ein zuverlässiges Ergebnis liefert. Abhängig von der Wahl des Zielgenes werden nur pathogene Keime detektiert. Die Sensitivität einer PCR ist in großem Maße von der Aufreinigung abhängig, deshalb sollte ein PCR-Protokoll immer einschließlich Probenvorbereitung etabliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time PCR-basiertes Nachweisverfahren, zusammen mit der Probenvorbereitung, für Y. enterocolitica in Lebensmitteln entwickelt. Nachgewiesen wurde das chromosomale ail-Gen, sowie das auf dem Plasmid lokalisierte virF-Gen. In Vorversuchen erfolgte die Optimierung von verschiedenen Bedingungen für eine PCR, wie die Mastermix-Konzentration, Primer-Konzentration und Annealing-Temperatur. Anschließend erfolgte die Untersuchung von gezielt kontaminierten Rinderhackfleischproben. Diese Proben wurden nach Anreicherung mit sechs verschiedenen Extraktionsverfahren aufgereinigt und anschließend mit drei PCR-Methoden, davon eine Real-Time PCR mit SYBR Green und eine TaqMan Real-Time PCR sowie eine konventionelle Multiplex-PCR mit Gelelektrophorese, auf Y. enterocolitica untersucht. Parallel dazu wurde der klassische kulturelle Nachweis mit Anreicherung in TSB und ITC und Ausstrich auf CIN-Agar durchgeführt. Abschließend erfolgte die Untersuchung von 150 Schweinefleischproben aus dem Handel. Diese wurden ebenfalls mittels der drei PCR-Methoden und kulturell untersucht. Die Aufreinigung der Proben erfolgte nach Anreicherung mit drei Extraktionsmethoden, welche in den Versuchen mit den beimpften Proben die besten Ergebnisse lieferten. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden. Mit allen drei PCR-Methoden konnten ail-positive Y. enterocolitica ab einer Impfmenge von 10 KbE/10 g Hackfleisch und nachfolgende Anreicherung nachgewiesen werden. Der Nachweis des virF-Genes gelang nur mit der konventionellen PCR, bei der SYBR Green Real-Time PCR konnte das virF-Gen nur selten und nur bei sehr hohen Keimzahlen detektiert werden. Bei der SYBR Green Real-Time PCR (ail) lagen die Ct-Werte bei der niedrigsten Impfmenge von 10 KbE/10 g, je nach Aufreinigungsmethode, im Bereich von 28,5 bis 34,8, bei der höchsten Impfmenge von 105 KbE/10 g konnten Werte ab 19,6 Zyklen erzielt werden. Die besten Ergebnisse konnten mit der Aufreinigung der InstaGene™ Matrix (Biorad), dem Biorad Genomic Tissue Kit und dem Qiagen DNeasy Tissue Kit erzielt werden. Mit diesen Methoden erfolgt auch die Aufreinigung der Schweinefleischproben aus dam Handel. Insgesamt konnte in 43 Proben (29 %) ail-positive Y. enterocolitica detektiert werden. Die höchste Nachweisrate mit 42 positiven Proben (28 %) wurde mit der SYBR Green Real-Time PCR erzielt, wogegen mit der TaqMan Real-Time PCR in 23 Proben (15 %) und mit der konventionellen PCR nur in 20 Proben (13 %) pathogene Y. enterocolitica detektiert werden konnten. Am höchsten war die Nachweisrate nach Aufreinigung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit, welcher schon in den Vorversuchen die beste DNA-Ausbeute lieferte. Kulturell konnte in keiner Probe Y. enterocolitica nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Real-Time PCR eine sensitive und schnelle Methode zum Nachweis von pathogenen Y. enterocolitica in Lebensmitteln darstellt. Die Probenaufbereitung mit dem Biorad Genomic Tissue Kit liefert eine hohe DNA-Ausbeute, ist aber zeitaufwendig, wogegen die InstaGene Matrix zwar weniger sensitiv, dafür aber wesentlich schneller ist. Die Real-Time PCR mit SYBR Green eignet sich vor allem als kostengunstiges Screening, positive Ergebnisse sollten noch mit der sequenzspezifischen TaqMan Real-Time PCR bestätigt werden.

ZUSAMMENFASSUNG Yersinia enterocolitica 4/O:3 und Y. enterocolitica 2/O:9 sind die in unseren Breitengraden am meist verbreiteten humanpathogenen Bioserotypen, wobei Y. enterocolitica 4/O:3 am haeufigsten aus Lebensmitteln isoliert wird. Ein grosses Problem besteht in der relativ geringen Nachweisrate fuer pathogene Y. enterocolitica Staemme aus Lebensmittelproben mit den derzeit verfuegbaren Nachweismethoden. Verschiedene Selektivnaehrboeden wurden fuer die Isolierung von Y. enterocolitica entwickelt, sie werden aber haeufig von anderen Bakterien ueberwachsen. Y. enterocolitica Staemme koennen von den meisten anderen enteropathogenen gramnegativen Keimen anhand eines positiven Harnstoffabbaus unterschieden werden. Ziel dieser Studie sollte daher die Entwicklung eines selektiven Naehrbodens sein, der geeignet ist, Y. enterocolitica Bioserotyp 4/O:3 und 2/O:9 aus Fleischproben nachzuweisen. Es wurden verschiedene Peptone, Zucker, Harnstoff- und Agarkonzentrationen fuer die Grundlage des Urea-Agars getestet. Des Weiteren wurden verschiedene selektive Faktoren zugegeben, wie Gallensalze, Hefe, Natrium-Oxalat, Kaliumchlorat, Irgasan und Antibiotika (Cefsulodin, Novobiocin, Ticarcillin). Der neu entwickelte Naehrboden wurde anhand verschiedener gramnegativer und grampositiver Keime getestet (Y. enterocolitica 4/O:3, Y. enterocolitica 2/O:9, Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, S. aureus, S. typhimurium, E. coli, P. aeruginosa, P. fluorescens, M. morganii, A. hydrophila, S. liquefaciens, E. faecalis und E. faecium). Ausserdem fand eine Untersuchung des Naehrbodens mit kuenstlich kontaminiertem Hackfleisch sowie unbeimpften Nativproben (Tonsillen- und Kotproben von 34 Schlachtschweinen sowie 15 unbehandelten Hackfleischproben) statt. Die angewandeten Verfahren bestanden aus einem Direktausstrich, einer Uebernachtanreicherung, einer Voranreicherung in ITC-Bouillon sowie eine Kaeltevoranreicherung mit nachfolgender Anreicherung in ITC-Bouillon. Die Proben wurden jeweils zum Vergleich auf CIN-Agar nach Schiemann ausgestrichen. Zusammensetzung des Agars (g/l): Pepton aus Fleisch (1,0), Glucose (1,0), Natriumchlorid (5,0), Dinatriumhydrogenphosphat (1,2), Kaliumhydrogenphosphat (0,8), Gallensalze (5,0), Phenolrot (0,012), Agar (18,0), Urea (5,0), Irgasan (0,001), Ticarcillin (0,001), Kaliumchlorat (1,0); pH 6,76±0,2. Urea-positive Bakterien wuchsen auf diesem Urea-Selektivagar rosa, waehrend hingegen Urea-negative Bakterien gelb wuchsen. Y. enterocolitica 4/O:3 zeigte ein gutes Wachstum auf diesem Agar nach einer 24-stuendigen Inkubation bei +30°C. Y. enterocolitica 2/O:9 wuchs im Vergleich zu Y. enterocolitica 4/O:3 kleiner und geringer in ihrer Zahl, zeigte jedoch auch die typische Morphologie nach 48 h. Y. intermedia und Y. frederiksenii wuchsen kleiner. Durch die enthaltenen Selektivfaktoren konnte ein Wachstum von Y. kristensenii, grampositiven Spezies, S. typhimurium und E. coli unterbunden werden. Pseudomonaden und Aeromonaden wuchsen transparent und konnten leicht von den Yersinien abgegrenzt werden. Die groessten Probleme hinsichtlich der Differenzierung bereiteten M. morganii und S. liquefaciens, da diese eine aehnliche Morphologie aufwiesen wie Y. enterocolitica 4/O:3. Y. enterocolitica 4/O:3 konnte erfolgreich isoliert werden aus kuenstlich kontaminiertem Hackfleisch und nativen Tonsillen, wenn eine selektive Anreicherung in ITC Bouillon dem Ausstreichen vorausging. Der neu entwickelte Urea Selektivagar ist zusammen mit CIN-Agar ein geeigneter selektiver Naehrboden fuer die Isolierung von Bioserotyp 4/O:3 aus Fleisch. Eine Selektivanreicherung in ITC Bouillon sollte bei der Untersuchung von Fleischproben vor dem Ausstreichen auf dem festen Agar immer stattfinden.

Plazentablut kann unter anderem zur autologen Transfusion von Frühgeborenen verwendet werden. Dabei ist die Kontamination von Plazentablut ein wichtiger limitierender Faktor für die klinische Verwendung. In dieser Studie wurde die Kontaminationsrate von Plazentablutentnahmen untersucht, wobei die Kontamination sowohl für vaginale Geburten als auch für Sectio-caesarea-Geburten getrennt bestimmt wurde. Weiterhin sollte herausgefunden werden, ob es eine Blutfraktion gibt, die für den Kontaminationsnachweis am sensitivsten ist und ob alle Kontaminationen durch eine mikrobiologische Untersuchung an Tag 1 erfaßt werden. Dazu wurde bei 117 Geburten (89 vaginale Geburten, 28 Sectiones caesareae) das Plazentablut nach Durchtrennung der Nabelschnur mit der Plazenta noch in utero durch Punktion der Nabelschnurvene gewonnen. Hierzu wurde das Cord Blood Set MXT 2206DC der Firma Maco Pharma International GmbH verwendet. Das Vollblut wurde nach Zentrifugation mit dem Müller-Krüssel-System in die Komponenten Erythrozytenkonzentrat, Buffy coat und Plasma aufgetrennt. Diese drei Fraktionen wurden an drei Tagen (1, 3, 35) auf aerobe und anaerobe bakterielle Kontamination untersucht, wobei an Tag 1 zusätzlich auch noch das Vollblut überprüft wurde. Dafür wurden Kulturflaschen mit je 3 ml der entsprechenden Fraktion beimpft und mit dem Bactec-Gerät sieben Tage bei 35°C überwacht. Es wurde eine Gesamtkontamination von 28,2% (33/117) festgestellt, wobei vaginale Geburten zu 33,7% und Sectiones caesareae zu 10,7% kontaminiert waren. Am ersten Untersuchungstag konnten 28 Kontaminationen erfaßt werden. Die restlichen fünf Kontaminationen wurden erst an Kontrolltag 3 nachgewiesen. Das Buffy coat unterscheidet sich beim Kontaminationsnachweis signifikant von den anderen Fraktionen. In ihm konnten 63,6% der Gesamtkontamination erfaßt werden. Die nachgewiesenen Bakterien waren Keime der normalen Hautflora und der Vaginal- bzw. Perinealregion, wobei am häufigsten Koagulase negative Staphylokokken auftraten. Außerdem konnte beim Vergleich der Kontaminationshäufigkeiten der einzelnen Klassen in dieser Studie ein Einübungseffekt festgestellt werden. Die zum Teil erhobenen Entzündungsparameter ließen keine sicheren Rückschlüsse auf eine eventuelle Kontamination der Plazentablutproben zu. Das durchschnittlich entnommene Plazentablutvolumen betrug ca. 60 ml. Die Gesamtkontamination von 28,8% ist im Vergleich zu anderen Studien hoch. Das kann zum Teil dadurch erklärt werden, daß in dieser Studie die Nachweismöglichkeiten durch mehrere Untersuchungen (Tag 1, 3, 35) und durch die einzeln untersuchten Blutfraktionen besser ausgeschöpft wurden. Wie diese Studie zeigt, konnten unter Verwendung des Bactec-Systems bei nur einer Untersuchung nicht alle Kontaminationen erfaßt werden. Weiterhin zeigen die vorliegenden Ergebnisse, daß im Buffy coat die höchste Nachweisrate erzielt wurde. Somit sollte am besten immer das angewendete Endprodukt auf eine bakterielle Kontamination untersucht werden und zusätzlich wenn möglich immer noch das Buffy coat mituntersucht werden. Bei einer Plazentablutentnahme sollte also immer mindestens das Erythrozytenkonzentrat untersucht werden. Überdies ist es anzuraten ein speziell trainiertes Entnahmeteam für die Gewinnung von Plazentablut einzusetzen, um die Kontaminationsrate auf ein Minimum zu senken.