Podcasts about enzephalopathien

Die Arbeit „Amplifikation von Prionen in vitro“ beruhte auf der Amplifikationsmethode die erstmals 2001 vorgestellt wurde (Saborio et al., 2001). Bei der PMCA wird erstmals PK-resistentes PrPres in ausreichender Menge in vitro hergestellt, welches molekularbiologisch dem Erreger spongiformer Enzephalopathien gleicht. Die PMCA erlaubt somit eine in vitro Untersuchung des pathologischen Umfaltungsprozess von PrPC zu PrPSc für diagnostische und therapeutische Studien. In dieser Arbeit wurden ausgiebig die Einzelschritte der PMCA Methode, insbesondere die Quantifikation der Western Blot Bande und die Auswirkungen der Sonifikationsleistung und der Inkubationszeit auf die Amplifikationseffizienz untersucht. Je nach Stärke der Sonifizierung ändert sich die Effizienz der PMCA Reaktion (Kap.‎3.1.2) . Eine Amplifikation ohne Sonifikation ist möglich, scheint aber nicht autokatalytisch aktives PrPres zu erzeugen und erfüllt somit nicht die Prion Hypothese ‎3.1.3 und ‎4.1). Neues PrPres kann als seed für weitere Amplifikationen dienen (Kap. ‎3.1.6). Parallelansätze zeigten die Reproduzierbarkeit der PMCA, so dass vergleichende Studien mit unterschiedlichen Reaktionsansätzen einen Vergleich der Amplifikationseffizienz ermöglichen (Kap ‎3.1.5). Die Intensitätsmessung von Western Blot Banden repräsentiert die Proteinmenge in vitro (Kap. ‎2.2.6). Es konnte gezeigt werden, dass PrPC und PrPSc essentiell für die Durchführung der Reaktion sind. Somit konnte gezeigt werden, dass die PMCA im Einklang mit der Prionhypothese steht, die besagt, dass ein pathogener PrPSc-Seed die Umfaltung von nativem PrPC initiiert. (Kap ‎3.1.4 und ‎3.2). Die molekulare Spezifität der PMCA Reaktion wurde hervorgehoben durch die Erkenntnis, dass rPrP die Amplifikation in vitro hemmt (Kap. ‎3.2, Bieschke et al., 2004). Prion Proteine binden Kupfer in vivo (Brown et al., 1997a) und in geringerer Affinität auch Ni, Mn und Zn (Jackson et al., 2001). Die Rolle von Metallen bei der Konversion von PrPC zu PrPSc ist noch nicht endgültig geklärt. In dieser Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass bei Zugabe von Mn, Ni und Zink in ca. 10fach physiologischen Konzentrationen von 50µM und unphysiologischen 500µM die PrPres Amplifikation gefördert wird, während Cu keinen Effekt zeigt (Kap. ‎3.3.1). Gleichzeitig verringern alle Metallionen die Stabilität von neu entstandenem PrPres gegenüber PK (Kap. ‎3.3.2). Man kann sich den destabilisierten Zustand als ein Metallgebundenes PrP-Zwischenprodukt in der Umfaltung von PrPC zu PrPSc vorstellen (Sarafoff et al., 2005). Die PMCA Reaktion wie von Saborio et al. beschrieben hat einige Nachteile. Man arbeitet mit infektiösem Material in einem offenen System und verursacht eine Kontaminaton der Sicherheitswerkbank. Es wurden zwei Systeme zur automatischen Amplifikation im geschlossenen System entwickelt. Der Wasserbadamplifikator sonifizierte zyklisch das temperierte Becken in dem die Proben in einem Schwimmer genau positioniert wurden (Kap. ‎3.4.1). Es zeigte sich eine maximale Amplifikation von 14fach in der Mitte des Bades wohingegen die Konversionseffizienz zum Rand des Beckens hin gleichmäßig absank (Kap ‎3.4.2). Aufgrund der inhomogenen Ergebnisse mit dem Wasserbad wurde mit einem Microplate Horn der Munich Prion Cycler entwickelt, wo der gesamte Boden des Beschallungsbeckens vom Abstrahlkopf der Ultraschallsonotrode besteht, so dass eine homogene Leistungsverteilung erwartet wurde. Die Proben befanden sich in einer mit Plastikfolie versiegelten Mikrotiterplatte, so dass Verluste und Kontaminationen ausgeschlossen werden konnten (Kap. ‎3.4.3). Es konnte eine gleichmäßigere Amplifikation von 3,0 ± 0,7 gezeigt werden, wobei kein Abfall der Faktoren am Rand der Platte festzustellen war (Kap. ‎3.4.4). Es konnte mit den beiden hier vorgestellten Systemen zum ersten Mal eine Amplifikation von PrPres mit indirekter Sonifikation von verschlossenen Proben und dem Einfluss der Ultraschallleistung auf die Amplifikation gezeigt werden (Sarafoff et al., 2005). Dies zeigte auch, dass die Metalloberfläche der Sonotrode bei der manuellen PMCA keine katalytische Funktion bei der Konversion des Kupferbindenden PrPC zu PrPres innehat. Der Munich Prion Cycler ermöglicht eine homogene Amplifikation von Parallelproben im Mikrotiterformat. Die Entwicklung der ELISA Technologie zur Quantifizierung von PrP in Homogenaten wird in Zukunft ein limitierender Schritt in der Automatisierung der PMCA Reaktion sein (Kap. ‎2.2.7 und ‎4.4).

Das Prion-Protein ist in seiner infektiösen Form für das Auftreten und die Übertragung von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien verantwortlich. Diese Erkrankungen können bei Mensch und Tier auftreten, wobei die bekannteste tierische Form der „Rinderwahn“ bzw. BSE ist. Die häufigste Prion-Krankheit beim Menschen ist die Creutzfeldt-Jacob-Krankheit, deren neue Variante im Zusammenhang mit dem Auftreten von BSE steht. Die pathologische Form des Prion-Proteins (PrPSc) wird durch posttranslationale Umwandlung aus der apathogenen physiologischen Isoform PrPC gebildet. Dieses Protein wird vor allem in neuronalem Gewebe exprimiert und ist in allen Säugetieren hoch konserviert. Die Funktion des zellulären, apathogenen Prion-Proteins ist noch immer nicht geklärt, da Mäuse ohne dieses Protein gesund sind und keinen pathologischen Phänotyp haben. Daher müssen alternative experimentelle Ansätze unternommen werden, um zur Klärung der physiologischen Funktion beizutragen. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb mittels eines „Yeast-Two-Hybrid“-Screens nach Interaktoren des zellulären Prion-Proteins der Maus gesucht, welche in murinem Gehirn exprimiert werden. Es konnten in Hefe erfolgreich mehrere Proteine identifiziert werden, die bislang noch nicht als mögliche Interaktoren des zellulären Prion-Proteins beschrieben worden waren. Drei dieser Isolate wurden ausgesucht, um deren physiologische Interaktion mit PrP näher zu charakterisieren: Pint1, Synapsin Ib und Grb2. Mittels Copräzipitation konnte bestätigt werden, dass auch in Säugetierzellen eine physiologische Wechselwirkung zwischen den identifizierten Interaktoren und PrP auftritt. Das Protein Pint1 wurde bislang noch nicht beschrieben und besitzt eine hoch konservierte Aminosäureregion, die in Proteinfragmenten vom Menschen bis zum Wurm C. elegans zu finden ist. Die beiden anderen untersuchten Proteine sind beide an verschiedenen Wegen der zellulären Signaltransduktion beteiligt. Synapsin Ib ist mit synaptischen Vesikeln assoziiert, womit eine mögliche Verbindung zwischen der zellulären Funktion von PrPC und extrazellulären bzw. endokrinen Signalwegen besteht. Grb2 ist ein Adaptorprotein mit vielfältigen Aufgaben, vor allem der Kopplung von Membranrezeptoren mit intrazellulären Signalkaskaden. Durch den Nachweis einer Interaktion dieser beiden Proteine mit dem zellulären Prion-Protein konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals ein physiologischer Zusammenhang zwischen PrPC und intrazellulären Signaltransduktionswegen gezeigt werden.

Die LQYLWUR Selektion ermöglicht es aus kombinatorischen Nukleinsäurebibliotheken Oligonukleotidsequenzen zu identifizieren, die verschiedenste Zielmoleküle mit hoher Affinität und Spezifität binden können. Dadurch haben sich Aptamere zu einer potenten Alternative zu den in der Diagnose, Therapie und als Forschungsreagentien etablierten Antikörper entwickelt. Mit Hilfe der SELEX-Technologie (6ystematic (volution of /igands by (;ponential Enrichment) ist es in dieser Arbeit gelungen, 2' amino-stabilisierte RNA-Aptamere gegen das Neuropeptid Y und ein ausgewähltes, funktionell relevantes Prionproteinepitop zu generieren. Die Anreicherung funktioneller Sequenzen erfolgte durch einen affinitätschromatographischen Prozess. Zudem sollten bereits vorliegende RNA-Aptamere, die gegen das rekombinante Prionprotein in früheren Arbeiten selektiert wurden, charakterisiert werden. Das Neuropeptid Y (NPY), bestehend aus 36 Aminosäuren, gehört zur Familie der pankreatischen Polypeptide und ist bei der Steuerung einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse von Bedeutung. Es wird angenommen, daß durch selektive Bindung unterschiedlicher NPY-Konformationen an die einzelnen GProtein gekoppelten NPY-Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 und Y6) unterschiedliche Signale vermittelt werden können. Dieses differentielle Bindungsverhalten von NPY an seine Rezeptorsubtypen ist bisher unvollständig verstanden. Die in dieser Arbeit generierten Anti-NPY-Aptamere binden ihr Zielmolekül -NPY- mit einer Affinität von 370 nM und sind durch eine hohe Spezifität innerhalb der pankreatischen Polypeptidfamilie charakterisiert. Die Bindungsregion des Aptamers an den C-Terminus des Neuropeptid Y wurde durch Kartierungs-Experimente mit NPY-Analoga LQ YLWUR bestimmt. Die NPY-Analoga stellen sowohl verschiedene Untereinheiten von NPY, als auch Modifikationen des Peptides, die zu Rezeptorsubtypspezifitäten führen, dar. Durch Punktmutationen im C-terminalem NPY-Bereich konnte u.a. gezeigt werden, daß die Aminosäure Arginin an Position 33 für die Komplexbildung von NPY und Aptamer essentiell ist. In den Bindungsstudien in Gegenwart selektiver Agonisten zeigte sich, daß die Bindungseigenschaften von NPY am Y2 Rezeptor weitgehend mit denen an das Aptamer übereinstimmen. Die Kompetition des Aptamers mit den Rezeptoren um 3H-NPY wurde an Zellen, die die Rezeptoren NPY-Y1, NPY-Y2, bzw. NPY-Y5 exprimieren, untersucht. Das Aptamer verdrängte NPY mit besonders hoher Affinität am Y2 Rezeptor im Vergleich zur Verdrängung am Y1- bzw. Y5-Rezeptor. Die Anti-NPY-Aptamere weisen ein Bindungsverhalten am NPY vergleichbar zum Y2-Rezeptor auf und stellen damit ein wertvolles Werkzeug zur selektiven Charakterisierung der Interaktion zwischen NPY und seinen Rezeptoren dar. Von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien ist die infektiöse Form des Prionproteins (PrPSc). Es wird angenommen, daß PrPC durch einen posttranslationalen Prozeß in PrPSc konvertiert werden kann. Trotz identischer Primärstruktur unterscheiden sich die beiden Prionproteinisoformen (PrPC und PrPSc) grundlegend in ihren biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften. Die in früheren Arbeiten selektierten Prionprotein-Aptamere sollten im Hinblick auf ihr diagnostisches Potential charakterisiert werden. Erste strukturelle Untersuchungen führten zu der Annahme, daß die RNA-Aptamere ein G-Quartett als stabilisierendes Sekundärstrukturmotiv ausbilden können. Sowohl Kartierungsstudien mit unterschiedlichen Prionproteinpetiden als auch Bindungsstudien mit N-terminal trunkiertem PrPSc zeigten, daß der N-Terminus für die Bindung der Aptamere essentiell ist. In Gelshiftexperimenten mit verschiedenen Hirnhomogenaten konnte die spezifische Bindung der Aptamere an authentisches PrP gezeigt werden. Aufgrund der fehlenden PrPSc-Isoformspezifität der untersuchten Aptamere ist eine diagnostische Anwendung kaum denkbar. Die Bindung der Aptamere in der pKsensitiven, N-terminalen Prionproteindomäne läßt eine Anwendung in Kombination mit Proteinase K-Verdau in Analogie zu den derzeit benutzten BSE-Testverfahren nicht zu. Im letzten Teil der Arbeit sollten RNA-Aptamere gegen einen für die Konversion wichtigen Bereich des Prionproteins (AS 90-129) generiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß die in einer vorgeschalteten Prionpeptidselektion (AS 90-129) identifizierten Aptamere in der Lage sind, ihr Zielmolekül im Gesamtkontext des Prionproteins zu erkennen. In funktionellen Studien in persistent Prion-infizierten Neuroblastomzellen wurde eine statistisch signifikante und spezifische Reduktion der Akkumulation von GHQRYR synthetisiertem PrPSc zu hochmolekularen Aggregaten in Gegenwart einer ausgewählten Aptamersequenz beobachtet. Im Verlauf der Pathogenese von spongiformen Enzephalopathien korreliert die PrPSc- Aggregatbildung mit Infektiosität und Neurodegeneration. Damit bieten die selektierten Aptamere möglicherweise eine Ausgangsbasis um Therapeutika zu entwickeln, die den Verlauf der Prionerkrankungen beeinflussen.