Podcasts about prionerkrankungen

Prionerkrankungen gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen und können sowohl genetisch übertragen als auch erworben werden. Sie verlaufen bisher ausschließlich letal. Verursacht werden sie durch das PrPsc, die pathologische Isoform des physiologisch vorkommenden PrPc. Ein – teilweise noch kontroverser – Einfluss von Kupfer auf die Pathologie wurde mehrfach dargestellt. Bisherige Arbeiten haben diesen Einfluss jedoch insbesondere anhand der Bindung an die Oktarepeatregion untersucht; zunehmend wächst allerdings das Interesse an den Kupferbindungsstellen außerhalb dieser Region: unter anderem insbesondere am Histidin 95 (His95). Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig der Einfluss der Kupferbindung an der murinen Aminosäure Histidin 95 des Prionproteins (PrP) in vivo nach Infektion untersucht. Da die Erreger von Scrapie und CJD eine ähnlich Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur besitzen [51, 168], sind wahrscheinlich die Ergebnisse aus Tiermodellen - zumindest teilweise - auf das menschliche Prionprotein übertragbar. Zur Untersuchung wurden transgene Mäuse verwendet, die ein mutiertes PrP mit einem Aminosäure-Austausch von Histidin zu Glycin an der Position 95 des Prionproteins explizieren. Zur Abgrenzung des Einflusses der Mutation nach Infektion wurde vorab eine Charakterisierung der nicht infizierten Mäuse durchgeführt: Die Mäuse nach Mutation (H95G-Mäuse) sowie das mutierte Prionprotein (H95G- PrP) wurden vor Infektion ausführlich untersucht und mit Wildtypkontrollen verglichen. Immunhistochemisch, histologisch und klinisch zeigte sich vor Infektion kein Unterschied zwischen H95G-Mäusen und Wildtypmäusen. Anschließend erfolgten diese Untersuchungen bei RML-infizierten H95G- und Wildtypmäusen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal anhand von homozygoten HG95+/+-Mäusen mit Prnp-/- Hintergrund und Prnp+/+-129/Sv- C57/Bl6-Kontrollmäusen ein signifikanter Einfluss der Kupferbindungsstelle am Histidin 95 auf die Pathologie und das Überleben nach Prioninfektion gezeigt werden. Die Ergebnisse wurden bei den Mäusen nach Infektion zweiter Passage geprüft. Hierdurch konnte eine stabile, signifikant verkürzte Inkubationszeit bei den H95G- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden. Nach Infektion konnte weiterhin gezeigt werden, dass die H95G-Mäuse in fast allen beurteilten Hirnregionen reproduzierbar signifikant mehr plaqueartige PrPsc-Ablagerungen sowie reproduzierbar signifikant geringere spongiforme Veränderungen aufwiesen. Im Bereich des Kleinhirns zeigten sich signifikant deutlicher ausgeprägte, in den untersuchten Cortexbereichen signifikant geringer ausgeprägte synaptische PrPsc- Ablagerungen nach RML-Infektion, die teilweise reproduzierbar waren. Wahrscheinlich werden diese Ergebnisse beeinflusst durch den hier gezeigten veränderten Abbau des H95G- PrPsc, das im Gegensatz zum Wildtyp-PrPsc hauptsächlich über den a-Abbaumechanismus abgebaut wird, sowie den möglichen höheren Konzentrationen von H95G-PrPc.

Die höhere Lebenserwartung der Menschen in Industrieländern geht mit einem Anstieg altersbedingter Krankheiten einher. Hierbei spielen neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Frontotemporale Demenz, Chorea Huntington und Prionerkrankungen eine große Rolle. Dies hat sowohl wirtschaftliche als auch soziale Folgen für die Gesellschaft und ist schon jetzt eine große Belastung für die Gesundheitssysteme. Im Forschungsschwerpunkt "Dementia in Society" sollen die Erkenntnisse der Grundlagen- und klinischen Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen mit sozial- und geisteswissenschaftlichen Analysen einer zunehmend alternden Gesellschaft vermittelt werden. An den Schnittstellen üblicherweise separierter fachwissenschaftlicher Debatten sollen interdisziplinäre Gespräche geführt werden und so nicht nur der Austausch zwischen den Natur- bzw. Sozial- und Geisteswissenschaften, sondern auch der Austausch zwischen Grundlagen-forschung und angewandter Medizin in diesem Feld gefördert und gestärkt werden. | Center for Advanced Studies: 04.07.2011 | Referenten: Prof. Christian Haass, Prof. Hans Förstl, Prof. Monika Reichert | Moderation: Dr. Jeanne Rubner

Mon, 18 Oct 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12224/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12224/1/Wagner_Jens.pdf Wagner, Jens

Unmethylierte bakterielle DNA, die reich an CG Sequenzen ist stimuliert das angeborene Immunsystem. Die Vermittlung dieser Wirkung erfolgt über den Toll-like Rezeptor 9. Reine CG Sequenzen sind im Organismus nicht stabil, da sie sehr rasch von den körpereigenen Nukleasen abgebaut werden. Mit synthetisch hergestellten Oligodeoxyribonukleotiden, sogenannten CpG-ODNs, kann eine Nukleaseresistenz erzielt werden und der immunstimulatorische Effekt nachgeahmt werden. Weiterhin wirken sich CpG-ODNs positiv auf den Verlauf von bakteriellen Infektionen, Tumoren und Prioninfektionen aus. Man weiß, dass eine Aktivierung des Immunsystems durch einmalige Gabe von CpG-ODNs nur über einen kurzen Zeitraum stattfindet. Die CpG-ODNs führen im Organismus innerhalb von Minuten zu einem mRNA Anstieg und innerhalb von Stunden zu einer kurzfristigen Zytokinsekretion und IgM Produktion, werden dann aber rasch abgebaut, so dass der immunstimulatorische Effekt in der Regel nur kurz anhält. Um CpG-ODN als Therapeutikum besser nutzen zu können liegt der Wunsch nahe, die Wirkung von CpG-ODN zu verlängern. Eine mögliche Strategie ist hierbei eine repetitive Applikation. Ziel dieser Arbeit war, den immunstimulatorischen Effekt von repetitiver CpG-ODN-Gabe besser zu verstehen und mit der Repetition die Wirkung zu verlängern. Damit könnte CpG-ODN als Therapeutikum bei bakteriellen Infektionen, Tumoren und bei Prionerkrankungen wirkungsvoll eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden jeweils 12 Gruppen zu je 5 Mäusen gebildet, wobei die jeweiligen Gruppen an 5, 7 oder 21 aufeinanderfolgenden Tagen jeweils eine CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN Applikation i.p. erhielten. Die Mäuse wurden anschließend an Tag 7 oder 28 während bzw. nach der Behandlung getötet. So erhielt man folgende Gruppen: 5x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 7 getötete Mäuse 5x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 28 getötete Mäuse 7x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 7 getötete Mäuse 21x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 28 getötete Mäuse Im Verlauf der Arbeit, die die immunmodulatorische Wirkung auf das Gehirn und die Leber der Maus untersucht, konnten zusammenfassend folgende Ergebnisse herausgearbeitet werden, die mittels Real time PCR und Immunhistologie gewonnen wurden. Im Gehirn führt CpG-ODN zu einer mindestens einwöchigen Hochregulierung der mRNA von TNFα. Des Weiteren kommt es zu einer mindestens zweitägigen C1q und IFNg Hochregulierung. Eine IL-12p40 Hochregulierung findet nur ca. 18 Stunden statt, während eine STAT3 Hochregulierung nicht nachweisbar ist. In der histologischen Betrachtung finden sich in der HE Färbung keine pathologischen Veränderungen der Hirnarchitektur und in einer immunhistologischen Färbung mit CD 11b und GFAP bindenden Antikörpern keine Unterschiede zwischen den CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelten Tieren. In der Leber findet sich eine signifikante Hochregulierung von IL-12p40 über mindestens drei Wochen und eine C1q, TNFα und IFNg Hochregulierung von mindestens einer Woche. Histologisch finden sich in der HE Färbung massive Leukozyteninfiltrate über mindestens zwei Tage. In der Immunhistologie sieht man an den Infiltraten beteiligte aktivierte Makrophagen, T und B-Lymphozyten, jeweils dargestellt mit CD 11b, CD 8 und B220 bindenden Antikörpern. Es zeigte sich, dass eine repetitive CpG-ODN-Gabe eine verlängerte stimulatorische Wirkung auf das Immunsystem ausübt, was Voraussetzung für den Einsatz als Therapeutikum ist. Besonders bemerkenswert ist die Tatsache, dass man durch periphere Gabe von CpG-ODN im Gehirn eine Immunstimulierung erreichen kann. Diese könnte im Rahmen einer Therapie von Prionerkrankungen, anderen Gehirninfektionen, Morbus Alzheimer oder Gehirntumoren Anwendung finden. Allerdings sind noch weitere Studien nötig, um Risiken wie Hepatotoxizität oder Autoimmunität besser abschätzen zu können und den Mechanismus zu erforschen, wie durch periphere Gabe von CpG-ODN eine immunologische Gehirnaktivierung erreichen wird. Eine wichtige Frage für die Zukunft ist hierbei, ob die Wirkung von CpG-ODN direkt auf die Gehirnzellen wirkt oder ob es einen second messenger gibt, der die Blut-Hirn-Schranke überwindet.

Thu, 6 Dec 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7785/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7785/1/Levin_Johannes.pdf Levin, Johannes ddc:600, ddc:610, Medizinische Fakultät 0

Die LQYLWUR Selektion ermöglicht es aus kombinatorischen Nukleinsäurebibliotheken Oligonukleotidsequenzen zu identifizieren, die verschiedenste Zielmoleküle mit hoher Affinität und Spezifität binden können. Dadurch haben sich Aptamere zu einer potenten Alternative zu den in der Diagnose, Therapie und als Forschungsreagentien etablierten Antikörper entwickelt. Mit Hilfe der SELEX-Technologie (6ystematic (volution of /igands by (;ponential Enrichment) ist es in dieser Arbeit gelungen, 2' amino-stabilisierte RNA-Aptamere gegen das Neuropeptid Y und ein ausgewähltes, funktionell relevantes Prionproteinepitop zu generieren. Die Anreicherung funktioneller Sequenzen erfolgte durch einen affinitätschromatographischen Prozess. Zudem sollten bereits vorliegende RNA-Aptamere, die gegen das rekombinante Prionprotein in früheren Arbeiten selektiert wurden, charakterisiert werden. Das Neuropeptid Y (NPY), bestehend aus 36 Aminosäuren, gehört zur Familie der pankreatischen Polypeptide und ist bei der Steuerung einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse von Bedeutung. Es wird angenommen, daß durch selektive Bindung unterschiedlicher NPY-Konformationen an die einzelnen GProtein gekoppelten NPY-Rezeptorsubtypen (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 und Y6) unterschiedliche Signale vermittelt werden können. Dieses differentielle Bindungsverhalten von NPY an seine Rezeptorsubtypen ist bisher unvollständig verstanden. Die in dieser Arbeit generierten Anti-NPY-Aptamere binden ihr Zielmolekül -NPY- mit einer Affinität von 370 nM und sind durch eine hohe Spezifität innerhalb der pankreatischen Polypeptidfamilie charakterisiert. Die Bindungsregion des Aptamers an den C-Terminus des Neuropeptid Y wurde durch Kartierungs-Experimente mit NPY-Analoga LQ YLWUR bestimmt. Die NPY-Analoga stellen sowohl verschiedene Untereinheiten von NPY, als auch Modifikationen des Peptides, die zu Rezeptorsubtypspezifitäten führen, dar. Durch Punktmutationen im C-terminalem NPY-Bereich konnte u.a. gezeigt werden, daß die Aminosäure Arginin an Position 33 für die Komplexbildung von NPY und Aptamer essentiell ist. In den Bindungsstudien in Gegenwart selektiver Agonisten zeigte sich, daß die Bindungseigenschaften von NPY am Y2 Rezeptor weitgehend mit denen an das Aptamer übereinstimmen. Die Kompetition des Aptamers mit den Rezeptoren um 3H-NPY wurde an Zellen, die die Rezeptoren NPY-Y1, NPY-Y2, bzw. NPY-Y5 exprimieren, untersucht. Das Aptamer verdrängte NPY mit besonders hoher Affinität am Y2 Rezeptor im Vergleich zur Verdrängung am Y1- bzw. Y5-Rezeptor. Die Anti-NPY-Aptamere weisen ein Bindungsverhalten am NPY vergleichbar zum Y2-Rezeptor auf und stellen damit ein wertvolles Werkzeug zur selektiven Charakterisierung der Interaktion zwischen NPY und seinen Rezeptoren dar. Von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese der übertragbaren spongiformen Enzephalopathien ist die infektiöse Form des Prionproteins (PrPSc). Es wird angenommen, daß PrPC durch einen posttranslationalen Prozeß in PrPSc konvertiert werden kann. Trotz identischer Primärstruktur unterscheiden sich die beiden Prionproteinisoformen (PrPC und PrPSc) grundlegend in ihren biochemischen und biophysikalischen Eigenschaften. Die in früheren Arbeiten selektierten Prionprotein-Aptamere sollten im Hinblick auf ihr diagnostisches Potential charakterisiert werden. Erste strukturelle Untersuchungen führten zu der Annahme, daß die RNA-Aptamere ein G-Quartett als stabilisierendes Sekundärstrukturmotiv ausbilden können. Sowohl Kartierungsstudien mit unterschiedlichen Prionproteinpetiden als auch Bindungsstudien mit N-terminal trunkiertem PrPSc zeigten, daß der N-Terminus für die Bindung der Aptamere essentiell ist. In Gelshiftexperimenten mit verschiedenen Hirnhomogenaten konnte die spezifische Bindung der Aptamere an authentisches PrP gezeigt werden. Aufgrund der fehlenden PrPSc-Isoformspezifität der untersuchten Aptamere ist eine diagnostische Anwendung kaum denkbar. Die Bindung der Aptamere in der pKsensitiven, N-terminalen Prionproteindomäne läßt eine Anwendung in Kombination mit Proteinase K-Verdau in Analogie zu den derzeit benutzten BSE-Testverfahren nicht zu. Im letzten Teil der Arbeit sollten RNA-Aptamere gegen einen für die Konversion wichtigen Bereich des Prionproteins (AS 90-129) generiert werden. Es konnte gezeigt werden, daß die in einer vorgeschalteten Prionpeptidselektion (AS 90-129) identifizierten Aptamere in der Lage sind, ihr Zielmolekül im Gesamtkontext des Prionproteins zu erkennen. In funktionellen Studien in persistent Prion-infizierten Neuroblastomzellen wurde eine statistisch signifikante und spezifische Reduktion der Akkumulation von GHQRYR synthetisiertem PrPSc zu hochmolekularen Aggregaten in Gegenwart einer ausgewählten Aptamersequenz beobachtet. Im Verlauf der Pathogenese von spongiformen Enzephalopathien korreliert die PrPSc- Aggregatbildung mit Infektiosität und Neurodegeneration. Damit bieten die selektierten Aptamere möglicherweise eine Ausgangsbasis um Therapeutika zu entwickeln, die den Verlauf der Prionerkrankungen beeinflussen.