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Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

Der Aufbau des Zellkerns und die höheren Organisationsmuster von Chromosomen gehorchen Regeln, die bisher in menschlichen Zellen und Zellen einiger Primaten bestätigt werden konnten. In dieser Arbeit sollte an einem anderen Säuger, der Maus, untersucht werden, in wie weit sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse auch auf den molekularbiologisch intensiv studierten Modellorganismus der modernen Genomforschung übertragen lassen. Besonders interessant ist die Frage, weil der Karyotyp der Maus nur akrozentrische Chromosomen enthält und viel homogener in Bezug auf Chromosomengröße und Gendichte ist, als der Karyotyp des Menschen oder verschiedener Primaten. Die letzten gemeinsamen Vorfahren von Mäusen und Menschen lebten vor über 80 Mio. Jahren, in dieser Zeitspanne fanden die zahlreichen Veränderungen am Genom der Maus statt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob Gemeinsamkeiten in Bezug auf die Organisation des Chromatins nachzuweisen sind und ob evolutionär konservierte Organisationsmuster zu finden sind. Die quantitative Untersuchung der Topologie von Chromosomenterritorien und Zentromerregionen erfolgte mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf Zellkernen von vier Zelltypen der Maus. Auf Kerne von Lymphozyten, Fibroblasten, ES-Zellen und Makrophagen wurden die Territorien von sechs Chromosomen mittels Chromosomen-Paint-Sonden hybridisiert. Das ausgewählte Chromosomenset enthielt genreiche, genarme, große und kleine Chromosomen in verschiedenen Kombinationen. Bilddaten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen und einer digitalen quantitativen Bildanalyse unterzogen. In allen Mauszelltypen zeigten sich klare Korrelationen zwischen sowohl Gengehalt als auch Größe und radialer Verteilung von Chromosomenterritorien. Bei kugeligen Lymphozytenkernen korreliert die Gendichte stärker mit der radialen Verteilung als es die Chromosomengrößen tun. In Fibroblasten sind beide Korrelationen schwächer, aber nachweisbar, in ES-Zellen sind die Korrelationskoeffizienten wieder etwas höher und für beide Verteilungsmodelle gleich, in Makrophagen überwiegt die größenabhängige Verteilung der Chromosomenterritorien. Das genreichste Chromosom MMU 11 zeigt in den Lymphozyten die meisten Unterschiede zu anderen Chromosomenterritorien, während sich das genarme MMU X in den untersuchten männlichen ES Zellen durch seine extreme Randlage von den anderen unterscheidet. Innerhalb der Fibroblasten und Makrophagen gibt es vergleichsweise wenig signifikante Unterschiede zwischen den radialen Positionen der untersuchten Chromosomenterritorien. Zelltypspezifische Verlagerungen von Chromosomenterritorien zeigten sich auch nach einem Differenzierungsschritt von ES-Zellen zu Makrophagen. Die Lage der Chromozentren ist zelltypspezifisch. Im Gegensatz zu den untersuchten Chromosomenterritorien liegen die Chromozentren in Fibroblasten und Makrophagen in relativ zentralen Positionen. In Lymphozyten sind die Chromozentren am weitesten nach außen zum Zellkernrand gelangt, gefolgt von den ES-Zellen. Die Anzahl der Chromozentren ist ebenfalls zelltypspezifisch. Ausgehend von der Chromozentrenzahl in ES Zellen nimmt die Zahl der Chromozentren in differenzierteren Zellen zu (Lymphozyten, Fibroblasten) oder bleibt gleich (Makrophagen). Aufgrund der Ergebnisse lässt sich ausschließen, dass die äußere Form des Zellkerns alleine für die beobachteten Verteilungsunterschiede verantwortlich ist. Allerdings waren die beobachteten Unterschiede kleiner als bei vergleichbaren menschlichen Zelltypen. Mit ein Grund dafür ist sicher die geringere Variabilität der Chromosomengröße und Gendichte im Genom der Maus. Zellkernvolumina lagen zwischen 470 und 650 µm3. Lymphozyten besitzen im Durchschnitt die kleinsten Kerne der zyklierenden Zelltypen, ES-Zellen die größten. Makrophagen befanden sich in der G0-Phase, ihre Zellkerne waren am kleinsten und wiesen die geringste Standardabweichung auf. Die Analyse der Winkel und Abstände innerhalb der Chromosomenterritorien zeigte eine sehr flexible Positionierung innerhalb der Grenzen radialer Ordnungsprinzipien. Diese Resultate sind unvereinbar mit einem früher vorgeschlagenen Modell der Trennung des parentalen Genoms. Es gibt keine Hinweise für eine Abweichung von einer zufälligen Verteilung, von einer Häufung nahe beieinanderliegender MMU 1 Homologen in Makrophagen abgesehen. Zur Untersuchung der Struktur von Chromosomenterritorien wurden Programme angewandt, bei denen steigende Schwellwerte zu Zerfällen von Objekten führten, die analysiert wurden. Zwei unabgängige Methoden zur Berechnung von Objektzahlen in Bildstapeln führten zu gleichen Ergebnissen. Mit dem Programm OC-2 konnten Unterschiede in der Textur von Chromosomenterritorien bei der Maus innerhalb eines Zelltyps, als auch zwischen Zelltypen festgestellt werden. Dabei wurden die individuellen Chromosomengrößen mit berücksichtigt. Es konnte kein allgemeiner Zusammenhang zwischen den durchschnittlichen maximalen Objektzahlen und dem Gengehalt der entsprechenden Chromosomen festgestellt werden, vielmehr scheint die Textur des Chromatins von noch unbekannten, zelltypspezifischen Faktoren beeinflusst zu sein. Die Analyse der Chromatinstruktur in normalen menschlichen Zelltypen und in Tumorzelllinien mit dem Objektzählprogramm OC-2 ergab allgemein erhöhte Objektzahlen in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zelltypen. Davon unabhängig waren auch immer die genreichen HSA 19 durch höhere Objektzahlen charakterisiert als die etwas größeren genarmen HSA 18 in den selben Zell-typen. Vergleiche zwischen den Objektzahlen eines Chromosoms in normalen Zelltypen und Tumorzelllinien ergaben mehr Unterschiede, als Vergleiche nur innerhalb der normalen Zelltypen. Die hier untersuchten Tumorzelllinien weisen eine objektreichere Chromatinstruktur auf, als die ihnen gegenübergestellten normalen Zelltypen.