Podcasts about hmsc

Hey Listener, it's been a minute, but What Ya Into? Is back...at least for this week. Dave F'n Powell and Caitlin McWethy return to the show to talk about Home Movie Survival Camp, their weekly horror movie series at The Overlook Lodge in Pleasant Ridge (Cincinnati, Ohio). Topics this week include: Mystery Science Michael Winslow. Running far and crushing chocolate milk. The original story of HMSC. Playing the parts of Chad Baker and Little Sally. Watching horror movies for the first time in a room with other people. Rewriting Rubber. Alien. Never Forget Beetlejuice. Getting on the Train to Busan. Who can you trust in The Thing? The realness of the Exorcist. The science of Tremors. It Follows Forever. That time Tom Hanks played a teenager. The Terminator an unrelenting force from the future. The Shining is not a comforting movie. Come out and win stuff.

Welcome to HMSC Connects! where we go behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. For this week's episode host Jennifer Berglund is speaking with Caroline Fernald, HMSC's new Executive Director. 

Welcome to HMSC Connects! where we go behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. For this week's episode host Jennifer Berglund is speaking with Elizabeth Solinga, the new Administrative Director of the Harvard Museums of Science and Culture.

Welcome to HMSC Connects! where we go behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. For this week's episode host, Jennifer Berglund is speaking with Shoyo Sato, an Invertebrate Biologist who just finished his Ph.D. at Harvard. Shoyo is an old friend to HMSC. He's been volunteering at the Museum of Natural History since he was 12. We wanted to talk to him about that experience, what it has been like to grow up in the museum, how he and the museum have changed, and what it's like to look back at the museum as he steps into a new era of his life.

Welcome to HMSC Connects! where we go behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. For this week's episode host, Jennifer Berglund is speaking with Abbie Sandoval-Focil, a bilingual museum educator at the Peabody Museum of Archaeology & Ethnology, as well as Mia Hortado, a teen student in HMSC's "Hear Me Out" program. The Hear Me out program was created to reach out to the Latino community across Massachusetts and engage them in the goings on at the HMSC museums.

Welcome to HMSC Connects! where we go behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. HMSC is celebrating its 10th anniversary this year! A lot has changed over 10 years. It's been quite the journey, but we've been guided with grace by two Executive Directors. First, Jane Pickering, who is now the William and Muriel Seabury Howells Director of the Peabody Museum of Archaeology and Ethnology, one of our partner museums at Harvard. And now, Brenda Tindal, who recently took on a new role as Chief Campus Curator for Harvard's Faculty of Arts and Sciences. Today, Jennifer is reflecting with them on HMSC's first decade, and imagining how we grow from here.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.04.22.537784v1?rss=1 Authors: Majumder, A., Joshi, R., Mukherjee, S., Suryawanshi, T., Shukla, S. Abstract: Human mesenchymal stem cells (hMSCs) are multipotent cells that can differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. Due to their differentiation potential, hMSCs are among the most frequently used cells for therapeutic applications in tissue engineering and regenerative medicine. However, the number of cells obtained through isolation alone is insufficient for hMSC-based therapies and basic research, necessitating their in-vitro expansion. Conventionally, this is often carried out on rigid surfaces such as tissue culture petriplates (TCPs). However, during in-vitro expansion, hMSCs lose their proliferative ability and multilineage differentiation potential, making them unsuitable for clinical use. Although multiple approaches have been tried to maintain hMSC stemness over prolonged expansion, finding a suitable culture system to achieve this remains an unmet need. Recently, few research groups including ours have shown that hMSCs maintain their stemness over long passages when cultured on soft substrate. In addition, it has been shown that hMSCs cultured on soft substrates have more condensed chromatin and lower levels of histone acetylation compared to those cultured on stiff substrates. It has also been shown that condensing/decondensing chromatin by deacetylation/acetylation can delay/hasten replicative senescence in hMSCs during long-term expansion on TCPs. However, how chromatin condensation/decondensation influences nuclear morphology and DNA damage - which are strongly related to the onset of senescence and cancer - is still not known. To answer this question, here we cultured hMSCs for long duration (P4-P11) in presence of epigenetic modifiers histone acetyltransferase inhibitor (HATi) which promotes chromatin condensation by preventing histone acetylation and histone deacetylase inhibitor (HDACi) which promotes chromatin decondensation and investigated their effect on various nuclear markers related to senescence and cancer. We have found that consistent acetylation causes severe nuclear abnormalities whereas chromatin condensation by deacetylation helps in safeguarding nucleus from damages caused by in-vitro expansion. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.03.30.534618v1?rss=1 Authors: Govindaraj, K., Kannan, S., Karperien, M., Post, J. N. Abstract: The multi-lineage differentiation capacity of human mesenchymal stem cells (hMSCs) enables its potential for tissue engineering and regenerative medicine. Master transcription factors play a key role during development, differentiation, homeostasis and disease pathology. RUNX2 is the master transcription factor for bone development, and it regulates several important signaling pathways during chondrogenic and osteogenic differentiation of hMSCs. However, modulation of RUNX2 activity during hMSC differentiation into various lineages is not yet fully described. We differentiated hMSCs into chondro-, osteo-, and adipogenic lineages and studied RUNX2 protein dynamics using Transcription Factor - Fluorescence Recovery After Photobleaching (TF-FRAP) at different time points. The TF-FRAP method can capture the dynamic changes of RUNX2 protein mobility at the single cell level resolution, and cluster analysis shows how RUNX2 dynamics change at subpopulation level in proliferating and differentiating hMSCs. Our data show that although whole hMSC population is exposed to differentiation stimuli, some subpopulations in hMSCs do not respond to environmental cues. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Welcome to HMSC Connects! where we go behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. For this week's very special episode HMSC's Executive Director, Brenda Tindal, interviews none other than our usual host, Jennifer Berglund, HMSC exhibit and content developer. They discuss her career at HMSC including the genesis of this podcast series, as well as insight into her fascinating journey as a documentarian, biology enthusiast, National Geographic Explorer, and purveyor of science communication.

Thanks for tuning in to the Cultured Meat and Future Food Podcast. On this episode we are exciting to have Tim Olsen of Merck KGaA, Darmstadt, Germany. Tim joined Merck KGaA, Darmstadt, Germany in 2020 as Head of Commercial for the Cultured Meat program. His goal is to commercialize technologies that enable large scale cost effective and sustainable production of cultured meat and seafood products. Previously, Tim directed laboratory operations and led the development of bioinks at Allevi, a 3D bioprinting company. Tim then held the Senior Scientist position on the Process and Product Development team at RoosterBio, a regenerative medicine company focused on fueling the rapid commercialization of scalable human mesenchymal stem cell (hMSC) and exosome manufacturing technologies. His skillsets include stem cell culture optimization, media development, and scaling manufacturing in bioreactor systems. Tim then transitioned into commercial operations at RoosterBio as the Northeast USA and Europe Account Manager to leverage his technical skillset to focus on bringing solutions to the customers who were working on bringing regenerative medicine products to the clinic and the market. Tim received a Ph.D. in Bioengineering from Clemson University (2015) and sits on the External Advisory Board for the Department of Biomedical Engineering at The College of New Jersey, his undergraduate alma mater. --- Support this podcast: https://anchor.fm/futurefoodshow/support

For the first HMSC Connects! podcast of 2022, host Jennifer Berglund speaks with the Harvard Museums of Science & Culture's new Executive Director, Brenda Tindal, reflecting on Brenda's first six months, the current state of the museums, and the significance of the upcoming 10th anniversary of HMSC. 

Welcome to HMSC Connects! where Jennifer Berglund goes behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. This week Jennifer Berglund is speaking with Julia Szejnblum, the former coordinator of the Escúchame/Hear Me Out project at the Harvard Museums of Science & Culture. The project is for teenagers from the Somerville and Chelsea, Mass. communities who identify as Latinos, Latinas, LatinX, or Hispanics to create media projects designed to make the museums more engaging and accessible to their communities.

Welcome to HMSC Connects! where Jennifer Berglund goes behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. This week, Jennifer Berglund is speaking with Jan Sacco, the  Director of Exhibitions at HMSC. Jan is retiring at the end of June. Not only is Jan an exhibit developer for our wonderful exhibitions, but she's also been an inspiring force within the HMSC organization.

Welcome to HMSC Connects! where Jennifer Berglund goes behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. This week Jennifer Berglund is speaking with Brenda Tindal, the incoming Executive Director of HMSC. Brenda is a museum practitioner, educator, researcher and scholar who uses the platform of museums to connect with a diversity of audiences.

Welcome to HMSC Connects! where Jennifer Berglund goes behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. Today, Jennifer is speaking with Diana Xochitl Munn, the Director of Public Programs at the Harvard Museums of Science & Culture. 

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.01.321067v1?rss=1 Authors: Saha, S., Wang, Z., Rajasekaran, S. Abstract: Widespread availability of next-generation sequencing (NGS) technologies has prompted a recent surge in interest in the microbiome. As a consequence, metagenomics is a fast-growing field in bioinformatics and computational biology. An important problem in analyzing metagenomic sequenced data is to identify the microbes present in the sample and figure out their relative abundances. In this article we propose a highly efficient algorithm dubbed as Hybrid Metagenomic Sequence Classifier (HMSC) to accurately detect microbes and their relative abundances in a metagenomic sample. The algorithmic approach is fundamentally different from other state-of-the-art algorithms currently existing in this domain. HMSC judiciously exploits both alignment-free and alignment-based approaches to accurately characterize metagenomic sequenced data. To demonstrate the effectiveness of HMSC we used 8 metagenomic sequencing datasets (2 mock and 6 in silico bacterial communities) produced by 3 different sequencing technologies (e.g., HiSeq, MiSeq, and NovaSeq) with realistic error models and abundance distribution. Rigorous experimental evaluations show that HMSC is indeed an effective, scalable, and efficient algorithm compared to the other state-of-the-art methods in terms of accuracy, memory, and runtime. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Welcome to HMSC Connects! where Jennifer Berglund goes behind the scenes of four Harvard museums to explore the connections between us, our big, beautiful world, and even what lies beyond. For the final installment of the HMSC Connects! Ocean Month, Jennifer is speaking with Dr. Albert Jose Jones. He is a marine biologist by trade, a retired professor of Marine Science at the University of the District of Columbia. But the common thread throughout his extraordinary life is scuba diving. This fall, he's giving a virtual talk for HMSC about his work with Diving With A Purpose, a group he helped form of Black scuba divers who locate and document sunken slave ships around the world.   

On this episode, Katie is joined by Sarah Vojnovich, a Master's student in the Department of Biomedical Sciences at Oregon State Unviersity. Sarah carries out infection studies with a bacterium, called Vibrio coralliilyticus, that infects corals and causes tissue necrosis by the release of a toxin. Current studies are typically done on coral fragments taken from the natural environment, but in order to help reduce wild coral takes, Sarah's research looks at the use of using anemones, Aiptasia pallida, as an alternative surrogate host species for future bacterial infection experiments with Vibrio coralliilyticus. Sarah also works as an Assistant for Academic Programs at the Hatfield Marine Science Center and helps coordinate undergraduate classes and internships. Segment 1: Researching Corals [00:00-11:40] In this first segment, Sarah shares about her research on corals. In this segment, the following resources are mentioned: Hatfield Marine Science Center (HMSC) in Newport, Oregon Segment 2: Marine Science Outreach Education [11:41-21:43] In segment two, Sarah discusses her position at the Hatfield Marine Science Center. In this segment, the following resources are mentioned: Hatfield Marine Science Center (HMSC) in Newport, Oregon HMSC Academic Programs Opportunities: Internships Classes HMSC Experiential Learning: Free-Choice Learning Free-Choice Learning Lab Segment 3: Sarah's Trip on a Research Vessel [21:44-33:25] In segment three, Sarah shares about her upcoming trip on an OSU research vessel. In this segment, the following resources are mentioned: National Oceanic and Atmospheric Association (NOAA) NOAA Ship Bell M. Shimada Research Expedition Social Media Platforms: Newportal Blog Hatfield Facebook Hatfield Instagram To share feedback about this podcast episode, ask questions that could be featured in a future episode, or to share research-related resources, contact the “Research in Action” podcast: Twitter: @RIA_podcast or #RIA_podcast Email: riapodcast@oregonstate.edu Voicemail: 541-737-1111 If you listen to the podcast via iTunes, please consider leaving us a review. The views expressed by guests on the Research in Action podcast do not necessarily represent the views of Oregon State University Ecampus or Oregon State University.

Commentary by Dr. Valentin Fuster

Background: Tissue engineering approaches for reconstruction of large bone defects are still technically immature, especially in regard to sufficient blood supply. Therefore, the aim of the present study was to investigate the influence of osteogenic stimulation and treatment with VEGF on new bone formation and neovascularization in hMSC-loaded cancellous bone scaffolds in vivo. Methods: Cubic scaffolds were seeded with hMSC and either cultured in stem cell medium or osteogenic stimulation medium. One osteogenically stimulated group was additionally treated with 0.8 mu g VEGF prior to subcutaneous implantation in athymic mice. After 2 and 12 weeks in vivo, constructs and selected organs were harvested for histological and molecular analysis. Results: Histological analysis revealed similar vascularization of the constructs with and without VEGF treatment and absence of new bone formation in any group. Human DNA was detected in all inoculated scaffolds, but a significant decrease in cells was observed after 2 weeks with no further decrease after 12 weeks in vivo. Conclusion: Under the chosen conditions, osteogenic stimulation and treatment with VEGF does not have any influence on the new bone formation and neovascularization in hMSC-seeded cancellous bone scaffolds.

Mit der intensiven Erforschung von Stammzellen soll zukünftig die Möglichkeit eröffnet werden durch Manipulation von Stammzellpopulationen das regenerative Potential des Organismus zu verstehen und zu nutzen. Darüber hinaus soll mittels genetisch modifizierter Stammzellpopulationen die Grundlagen dafür geschaffen werden schwere Gen- und Immundefekte zu therapieren. Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) versprechen hierbei großes Potential, da sie bereits für systemische Therapieansätze eingesetzt werden. Allerdings sind die theoretischen Grundlagen der Stammzelleigenschaften der hMSC wie Proliferation, Invasion bzw. Migration und die Differenzierungskapazität nur rudimentär verstanden. Aufbauend auf den Ergebnissen von Dr. Marisa Karow und Dr. Thomas Kolben, die eine Beteiligung des Wnt/β-Catenin-Signalweges an der Steuerung dieser Stammzelleigenschaften in ihren Arbeiten nachweisen konnten (Karow 2008; Kolben et al. 2012), sollten in der vorliegenden Arbeit die Rezeption des spezifischen Wnt-Signals und die dabei beteiligten Frizzled (Fzd)-Rezeptoren näher untersucht werden. Da aus den vorigen Arbeiten schon hervorging, dass alle 10 Fzd-Rezeptoren in den hMSC exprimiert werden, sollte über eine qualitative PCR die Expression potentieller Wnt-Liganden sowie der beiden Inhibitoren des Wnt-Weges sFRP1 und WIF1 geprüft werden. Dabei zeigte sich, dass 8 der 19 Wnts sowie der Inhibitor sFRP1 exprimiert werden. Das Wnt-Expressionsmuster der Krebszelllinie HT1080 unterschied sich dagegen nur in der Expression zweier Wnts, was wahrscheinlich auf den mesodermalen Ursprung dieser Krebszelllinie zurückzuführen ist. Im Gegensatz hierzu zeigte sich eine umfangreichere Wnt-Expression in der immortalisierten Zelllinie HEK293, in der 13 der 19 Wnts sowie auch die beiden Inhibitoren sFRP1 und WIF1 nachgewiesen wurden. Für eine detailliertere Aufschlüsselung der Beteiligung einzelner Fzds an der Rezeption eines Wnt-Signals sowie an der basalen Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges in hMSC wurde ein TCF/LEF-Reporter-Vektorsystem in die hMSC eingebracht. Als Reportergen kam die sekretierte Form einer Luciferase aus dem Tiefsee-Cephalopoden Gaussia princeps zum Einsatz. Vorteil dieser Luciferase ist, dass die Sekretion in den Überstand eine Evaluierung der Wnt/β-Catenin-Aktivität über die Zeit hinweg erlaubt, ohne die Zellen zerstören zu müssen. Hierbei wurden transient und stabil-transfizierte TCF/LEF-(T-cell-specific transcription factor/lymphoid enhancer-binding factor)-Reporter-hMSC generiert und die Zellkulturbedingungen für nachfolgende Experimente optimiert. Die Evaluierung unterschiedlicher Aktivatoren des Wnt/β-Catenin-Signalweges ergab die stärkste Aktivierung nach Knockdown des Tumorsuppressorgens APC, während ein Knockdown des β-Catenins, dem zentralen Mediator des Wnt-Weges, zu einer signifikanten Reduktion der Gaussia-Luciferase-Aktivität führte. Bei Knockdown-Studien mit den verschiedenen Fzds mittels RNA-Interferenz (RNAi) in den TCF/LEF-Reporter-hMSC zeigte sich, dass Fzd5 und Fzd7 an der Weiterleitung eines Wnt-Signals sowohl unter unstimulierten Bedingungen als auch nach Applikation von Wnt3a beteiligt sind. Weiter zeigte nur noch der Knockdown von Fzd1, dass dieser Rezeptor an der Weiterleitung eines Wnt3a-Signals partizipiert. Um diese Ergebnisse über einen reversen Ansatz in Form einer Überexpression der Fzds zu untersuchen, wurde ein flexibles Klonierungssystem entwickelt, das einen einfachen Austausch von Protein-tags ermöglichen sollte. Nach Bestätigung der Überexpression der Fzds auf mRNA-Ebene und Proteinebene wurde die Wirkung der Überexpression in den TCF/LEF-Reporter-hMSC ohne und mit Wnt3a-Aplikation untersucht. Hier zeigte sich, dass neben der Überexpression von Fzd5 auch Fzd3 und Fzd6 eine Erhöhung der Gaussia-Luciferase-Aktivität und damit eine gesteigerte Aktivität des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowohl unter unstimulierten als auch unter stimulierten Bedingungen nach sich zogen. Bei vergleichender Überexpression von Wnt3 oder Wnt3a konnte gezeigt werden, dass Wnt3 – welches hMSC auch endogen exprimieren – sehr viel stärker den Wnt-Weg aktivieren kann als Wnt3a. Um die Auswirkung des kanonischen Wnt-Rezeptors Fzd5 auf die Stammzelleigen-schaften der hMSC zu prüfen, wurde die Expression des Wnt-Zielgens Cyclin D1 und die Proliferation nach Knockdown sowie transienter Überexpression von Fzd5 quantitativ erfasst. Hierbei zeigte sich nach Knockdown von Fzd5 eine signifikante Abnahme der Proliferation, die auch auf Ebene der Wnt-Zielgene mit einer Abnahme der Cyclin D1-Expression einherging. Umgekehrt konnten stabil Fzd5-transfizierte hMSC-Populationen generiert werden, die eine signifikante Steigerung der Cyclin D1-Expression aufwiesen. Zusammenfassend konnte im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die verschiedenen Fzds in unterschiedlichem Maße an der Weiterleitung eines Wnt-Signals beteiligt sind. Besonders scheinen hier Fzd5 und Fzd7 eine wichtige Rolle in hMSC zu spielen, da sie auch an der Vermittlung eines endogenen Wnt-Signals innerhalb der Stammzellpopulation beteiligt sind. Weiter wurde im Fall von Fzd5 auch die maßgebliche Beteiligung dieses Rezeptors am Erhalt der Proliferationskapazität der hMSC-Population nachgewiesen.

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) haben in den vergangenen Jahren auf-grund ihres potenziellen Einsatzes in der regenerativen Medizin sowie in der Prävention und Behandlung diverser Krankheiten ein großes wissenschaftliches Interesse geweckt. Einen wichtigen Aspekt stellt in diesem Zusammenhang die Regulation von Stammzell-funktionen durch Signalwege wie beispielsweise den Wnt/β-Catenin-Signaltransduk-tionsweg dar. Während am Signalweg beteiligte Komponenten und Teilfunktionen bereits beschrieben sind, existieren bezüglich der Initiation der Signaltransduktion an der Zelloberfläche auf Rezeptorebene lediglich rudimentäre Kenntnisse. Vor diesem Hintergrund wurde in dieser Arbeit die molekulare Funktion der Wnt-Ko-rezeptoren LRP5 und LRP6 (low-density lipoprotein receptor-related protein) im Wnt/β-Catenin-Signalweg von hMSC genauer untersucht. Für die spezifische Quantifizierung β-Catenin-abhängiger Transkriptionsprozesse wurde zunächst ein TCF/LEF-Reportergen-System in hMSC etabliert. In diesem System erfolgt die Expression des Reporterproteins erst nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern und dessen Assoziation mit Transkriptionsfaktoren der TCF/LEF-Familie. Im Vergleich mit dem konventionellen TOP/FOP-Flash-Reportergen-System zeigte das TCF/LEF-Reportergen-System eine deutlich höhere Sensitivität. Mittels vergleichender Studien zur molekularen Funktion von LRP5 und LRP6, die neben der RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Technologie auch Überexpressionsstudien und Rescue-Experimente beinhalteten, konnte eindeutig gezeigt werden, dass LRP6 eine entscheidende Rolle in der β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion von hMSC übernimmt. Nach Applikation von Wnt-3a führte RNAi gegen LRP6 zu einer starken Ab-nahme der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion, wohingegen der Knockdown von LRP5 keine Veränderung zeigte. In einem umgekehrten Ansatz resultierte die Überexpression von LRP6 in einer starken Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Weges, während die Über-expression von LRP5 keinen nachhaltigen Einfluss zeigte. Darüber hinaus führte in LRP6 -Knockdown-hMSC die Überexpression von LRP6 – jedoch nicht die von LRP5 – zur Rekonstitution der Wnt-3a-induzierten, β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion. Diese Daten weisen LRP6 als den Hauptrezeptor für die Wnt-3a/β-Catenin-vermittelte Signaltransduktion in hMSC aus, wobei diese Funktion nicht durch LRP5 ersetzt werden kann. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg eng mit Differenzierungsprozessen assoziiert ist, wurde in diesem Kontext die Bedeutung der Wnt-Korezeptoren in hMSC evaluiert. Nach Knockdown von LRP6 war eine Differenzierung in die adipogene Richtung zu beobachten, die mit der Bildung fettähnlicher Vakuolen und einer erhöhten Expression des Transkriptionsfaktors PPAR-γ (Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor-γ) assoziiert war. Unter dem Einsatz adipogener Zusätze konnte die Differenzierung von LRP6-Knockdown-hMSC in fettähnliche Zellen weiter verstärkt werden, was mit einer deutlich gesteigerten Akkumulation von Fettvakuolen sowie einer weiteren Erhöhung der PPAR-γ Expression einherging. Interessanterweise resultierte die Überexpression von LRP6 in diesen fettähnlichen Zellen in einer Zunahme der Wnt/β-Catenin-Signaltransduktion mit einer gleichzeitigen Abnahme der Expression von PPAR-γ. Zusammenfassend zeigen diese Erkenntnisse, dass LRP6 nicht nur in der Wnt-3a-induzierten, β-Catenin-vermittelten Signaltransduktion von hMSC eine tragende Rolle spielt, sondern auch für die Suppression der Differenzierung von hMSC in die adipogene Linie und damit für die Aufrechterhaltung des Stammzellcharakters entscheidend ist. Somit stellt der Wnt-Korezeptor LRP6 ein vielversprechendes Ziel zur therapeutischen Manipulation von hMSC in zukünftigen klinischen Anwendungen, wie z.B. der regenerativen und präventiven Medizin, dar.

Eine zunehmende Zahl von Daten aus der Fachliteratur weist immer deutlicher darauf hin, dass Tumor- und Stammzellen trotz aller funktionellen Unterschiede, wie beispielsweise der Destruktion von gesundem Gewebe bzw. Regeneration von zerstörtem Gewebe, offensichtlich wesentliche Gemeinsamkeiten aufzeigen, insbesondere hinsichtlich der molekularen Mechanismen, die z.B. den zellulären Prozessen Differenzierung/Transformation, Zellalterung, Apoptose und Migration/Invasion zugrunde liegen. Im Gegensatz zur Situation bei Tumorzellen ist die Rolle lysosomaler Cysteinproteasen in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) bei diesen Prozessen jedoch noch weitgehend unbekannt und sollte daher im Rahmen dieser Arbeit genauer definiert werden. So konnten wir erstmals nachweisen, dass lysosomale Cysteinproteasen sowohl in hMSC exprimiert als auch während deren Kultivierung sezerniert werden. Von den elf bekannten humanen lysosomalen Cystein¬proteasen (Cathepsine) wurden vor allem Cathepsin B und Cathepsin K durch extrazelluläre Matrix (EZM)-Proteine, insbesondere durch Vitronektin, in ihrer Expression beeinflusst und zeigten eine kontinuierliche Erhöhung der Expression im Verlauf von 21 Tagen. Eine vermehrte Sekretion nach Vitronektinstimulation wurde proteinche-misch bei Cathepsin B und X nachgewiesen. Im Gegensatz dazu hatten Stimulationen mit Kollagen I und Laminin keinen signifikanten Einfluss auf die Expression bzw. Freisetzung dieser Proteasen. Weitere Untersuchungen ergaben, dass das Adhäsions-/Migrationsverhalten der hMSC durch EZM-Proteine vor allem über deren Wechselwirkung mit Adhäsionsmolekülen (Integrinen) beeinflusst wird. Zudem kann auch Procathepsin X in Abhängigkeit von Integrin αvβ3 an hMSC binden. Durch die Interaktionen der hMSC mit EZM-Proteinen sowie mit Procathepsin X wird eine Reihe von Signaltransduktionswegen, darunter der ERK-Signalweg, aktiviert. In Transmigrationsversuchen mit Cathepsin X-defizienten hMSC wurde zudem nachgewiesen, dass Procathepsin X – im Gegensatz zur Konstellation bei Tumorzellen – keine bedeutende Rolle bei der Migration der hMSC spielt. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass gegen dieses Enzym gerichtete Tumortherapiestrategien nur geringe (oder gar keine) Auswirkungen auf Stammzell-Mobilisation/Migration haben. Die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen in vitro-Daten zeigen somit neue Erkenntnisse bezüglich der Regulation lysosomaler Cysteinproteasen durch extrazelluläre Matrixproteine in hMSC und stellen daher eine gute Basis für weitere in vitro- bzw. auch in vivo-Evaluierungen dar.

Introduction: Human mesenchymal stem cells (hMSC) are easily obtainable from bone mar-row and possess the ability to differentiate into osteoblasts. Therefore, they have been sug-gested as a suitable source for bone regeneration. HMSC are equipped with a variety of in-tegrins that mediate essential cell-matrix interactions. Collagen I represent approximately 90% of the bone protein content. Cell attachment to collagen I is mediated by three members of the integrin receptor family named a1b1, a2b1 and a11b1 integrins. The main aim of this doctoral thesis was to investigate the basal expression of those integrins in hMSC and to func-tionally analyze the knockdown effect of a single collagen I-binding integrin on hMSC behav-ior in vitro. Materials and methods: HMSC were cultured on collagen I-coated surface. A lentiviral trans-fer of a1-, a2- and a11-specific shRNA was applied for downregulation of the corresponding integrin mRNA. Quantitative PCR and western blot analysis were used to assess the basal ex-pression, knockdown efficiency and integrin compensation. Colorimetric adhesion assay was used for estimation of the extent of cells attachment. HMSC spreading and migration was ob-served by time lapse experiments. JC-1 staining was used for investigation of the initiation of apoptosis. Results: Quantitative PCR were used to assess the basal expression of collagen I-binding integrins in three hMSC donors. We found that these integrins are differently expressed as integrin a11 had the highest and integrin a2 the lowest expression. Next, we applied lentiviral delivery of target-specific short hairpin RNA (shRNA) in order to knockdown each of the collagen I-binding integrins and compared them to the hMSC transduced with a sequence against a non-human gene abbreviated as shRNA control. We achieved significant downregulation (> 80%) of the collagen I-binding integrin mRNA and protein. Subsequently to the transduction, we did not noticed pronounce morphological cell changes, however, a clear decrease of a2- and a11-knockdown hMSC numbers was observed during cultivation. Using a quantitative adhesion assay, we estimated that 120 min after plating only 30% of integrin a11-deficent cells were able to attach to collagen I. In contrast, at the same time point, 70% of integrin a2-knockdown hMSC were attached while integrin a1- and shRNA control hMSC have already reached 100% cell adhesion. Furthermore, a time lapse-based investigation showed that integrin a1- and shRNA control hMSC need approximately 35 min to fully spread on collagen I. In contrast, integrin a2- and a11-knockdown hMSC took approximately double more time for spreading in comparison to shRNA control hMSC. Additionally, we analyzed the migration capability of the four different hMSC lines. The average path which integrin a1- and shRNA control hMSC passed was approximately 170 µm with mean speed of 11.5 µm/h. In parallel integrin a2 and a11-deficient hMSC migrated to a distance of approximately 70 µm with a velocity of 5 µm/h. Since it was observed a lost of a2- and a11-deficient hMSC, next we performed JC-1 staining that visualizes mitochondrial leakage, a hallmark of apoptosis. The majority of integrin a2- and a11-knockdown hMSC exhibited mitochondrial leakage whereas integrin a1- and shRNA control hMSC showed intact mitochondria. Finally, we used quantitative PCR to investigate whether there were compensatory effects between the three integrin receptors. We detect that knockdown of integrin a1 led to upregulation of a2 and a11. Similarly, when integrin a2 was downregulated, integrin a1 and a11 expression increased. Interestingly, knockdown of integrin a11 caused only a slight increase in integrin a1 but not in a2 expression. We also observed that upon osteogenic stimulation, integrin a2 and a11-deficient hMSC further reduced in number and did not mineralize the matrix even on a single cell level. Moreover, our preliminary investigation in hMSC-derived from osteoporosis suffering patients showed a tremendous downregulation of integrin a2. Conclusions: Our results strongly suggested that integrins a2b1 and a11b1 mediate an indis-pensible signaling for hMSC. Once these receptors were ablated from cell surface, hMSC re-duced their spreading, adhesion, migration and survival rates. Our integrin knockdown mod-els can be used for further investigations and understanding of the integrins a2b1 and a11b1 importance and signaling in hMSC and hOB since we observed a strong downregulation of integrin a2 expression in osteoporosis.

Osteogenic differentiation of hMSC into osteoblasts is a prerequisite for subsequent bone formation. Numerous studies have explored osteogenic differentiation under standard tissue culture conditions, which usually employ 21% of oxygen. However, bone precursor cells such as hMSC reside in stem cell niches of low oxygen atmospheres. Furthermore, they are subjected to low oxygen concentrations when cultured on three dimensional scaffolds in vitro for bone tissue engineering purposes, and even more so after transplantation when vascularisation has yet to be established. Similarly, hMSC are exposed to low oxygen in the fracture microenvironment following bony injury. Recent studies revealed that hypoxic preconditioning improves cellular engraftment and survival in low oxygen atmospheres. In the present study we therefore investigated the osteogenic differentiation potential of hMSC under 2% O2 (hypoxia) in comparison to a standard tissue culture oxygen atmosphere of 21% (normoxia). The success of differentiation was validated through Alizarin red staining and RT-PCR analysis of osteoblast markers ALP and OPN. We assessed osteogenic differentiation of hMSC following hypoxic preconditioning to address whether this pretreatment is beneficial for subsequent differentiation under low oxygen tension. To validate our findings we carefully characterised the extent of hypoxia exerted on cells with respect to cell survival (WST assay) and proliferation (growth curve). Furthermore we also tried to elucidate the role of HIF-1 alpha with respect to osteogenic differentiation under hypoxia via silencing RNA and DFO, a pharmacological agent. Finally we tested whether an immortalized hMSC-line (SCP-1) would serve as a model system for hMSC. We found that hMSC proliferate better if cultured under 2% of oxygen. We confirmed that osteogenic differentiation of hMSC is indeed inhibited under hypoxia. We showed for the first time that hypoxic preconditioning of hMSC prior to osteogenic induction restores osteogenic differentiation of hMSC under hypoxia. HIF-1 alpha seemed not to play a significant role in osteogenic differentiation under hypoxia, as transiently knocking down of HIF-1 alpha in preconditioned samples did not show any differences in their osteogenic differentiation. Moreover stabilising Hif-1 alpha in hypoxic samples did not yield any osteogenic differentiation either substantiating the notion that HIF-1 alpha does not have a direct role in the osteogenic differentiation of hMSC under hypoxia. Together our data suggest that hypoxia favours stemness over differentiation by upregulating embryonic stem cell markers like OCT-4 and NANOG. Hypoxic preconditioning may help to restore the otherwise reduced osteogenic potential of hMSC, either within a hypoxic fracture environment or at the site of implantation of tissue engineered bone constructs. We therefore believe that hypoxic preconditioning is a helpful tool for successful regenerative cell-based therapies in bone tissue engineering. SCP-1 cells might be used as a model system for hMSC as they are easy to handle, can be cultured to a desired cell number within a very short period of time, are relatively inexpensive and above all do not go into senescence as seen with hMSC after approximately 20 passages. Apart from their distinct advantages SCP-1 cells still maintain the specific CD markers characteristic for hMSC and are able to differentiate into adipogenic, osteogenic and chondrogenic lineages. However for in vivo experiments in animals a constant monitoring of neoplastic transformation is mandatory

Das Glioblastoma multiforme ist ein maligner hirneigener Tumor mit einer bislang infausten Prognose. Humane mesenchymale Progenitorzellen des Knochenmarks (hMSC) zeigen in-vitro und in-vivo einen ausgeprägten glioblastom¬induzierten Tropismus. Sie sind einfach in der Handhabung, weil sie leicht zu gewinnen, in Kultur zu vervielfältigen und anschließend autolog zu transplantieren sind. Diese Eigenschaften machen hMSC zu vielversprechenden Kandidaten für eine zellbasierte Gentherapie des Glioblastoms. Die molekularen Mechanismen, welche zu der gerichteten Migration der hMSC hin zu den Glioblastomzellen führen und die biologischen Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Tumorzellen sind bisher kaum verstanden. Um erste Einblicke in diese Wechselwirkungen zu erlangen, wurden im Rahmen des vorliegenden Promotionsvorhabens in-vitro Untersuchungen zu den Grundlagen des glioblastominduzierten Tropismus von hMSC durchgeführt. Die Fragestellung befasste sich insbesondere damit, welche Chemokine an der Vermittlung der glioblastomgerichteten Migration von hMSC beteiligt sind. Hierzu wurden Migrationsversuche mit einer modifizierten Boyden Kammer durchgeführt, wobei zunächst einige bekannte glioblastomassoziierte Chemokin-kandidaten (IL-8, NT-3, TGF-ß1, EGF, CNTF, GDNF, PDGF und BDNF) getestet wurden. Eine signifikante chemotaktische Eigenschaft auf hMSC wurde hierbei für IL-8, TGF-ß1 und NT-3 beobachtet. Die promigratorische Wirkung dieser drei Chemokine erwies sich hierbei als konzentrationsabhängig. Im Weiteren wurde nachgewiesen, dass die bekannte chemotaktische Wirkung von glioblastom-konditioniertem Medium auf hMSC durch die Zugabe von IL-8, TGF-ß, beziehungs¬weise NT-3 neutralisierenden Antikörpern signifikant reduziert wird. Somit konnte funktionell nachgewiesen werden, dass diese Chemokine tatsächlich eine Rolle beim glioblastominduziertem Tropismus der hMSC spielen. Ergänzend wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung die Expression der entsprechenden Chemokin¬rezeptoren auf den hMSC nachgewiesen und die Sekretion der Chemokine durch die Glioblastomzellen mittels ELISA quantifiziert. Aus Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe ist bekannt, dass auch VEGF-A eine chemotaktische Wirkung auf hMSC besitzt. Wie VEGF-A werden auch IL-8, TGF-ß1 und NT-3 von Glioblastomen überexprimiert. Zudem wird über diese Chemokine die Neoangiogenese jener Tumore vermittelt. Dies führt zu der Hypo-these, dass Glioblastome die Migration der hMSC aus dem peripheren Blut in das Tumorgebiet über angiogenetische Signalwege vermitteln. Damit könnten hMSC an dem Prozess der Angiogenese des Glioblastoms beteiligt sein. Ein genaues Verständnis des möglichen Beitrages von hMSC zum Glioblastomwachstum ist eine unabdingbare Voraussetzung für ihre mögliche klinische Anwendung als gentherapeutische Vektoren beim Menschen. Deshalb müssen zukünftig neben weiteren in-vitro vor allem in-vivo Studien mit Langzeit-beobachtungen im Tiermodell durchgeführt werden. In diesen Studien sollten die Auswirkungen einer Transplantation nativer hMSC einerseits und genetisch modifizierter therapeutischer hMSC andererseits auf das Glioblastomwachstum untersucht werden. Die vielversprechenden Ergebnisse der bisher vorliegenden Arbeiten lassen hoffen, dass in nicht allzu ferner Zukunft eine bessere Therapie für Patienten mit Glioblastom gefunden werden kann.

In verschiedenen tierexperimentellen Studien wurde die Knochenneubildung aus be-siedelten Biomaterialien sowohl im heterotopen als auch orthotopen Lager unter-sucht. Die erzielten Ergebnisse waren dabei maßgeblich von den verwendeten Zel-len, der Leitschienenart und den Kultivierungsbedingungen in vitro abhängig. Ziel dieser Studie war es daher, den Einfluss der in vitro Kultivierung von Zell-Matrix Kon-strukten auf deren Integration und die Knochenneubildung in vivo zu untersuchen. Klinisch zugelassene Leitschienen (Tutubone, h=3mm, d=9mm) wurden mit huma-nen mesenchymalen Stammzellen besiedelt und danach statisch (12 Stunden oder 14 Tage) oder dynamisch (14 Tage) unter kontinuierlichem Medienfluss kultiviert. Die Kontrollleitschienen blieben unbesiedelt und wurden analog den 12 Stunden statisch kultivierten Leitschienen behandelt. Danach wurden die Konstrukte in athyme Nacktmäuse subkutan paravertebral implantiert. Nach 2 und 12 Wochen in vivo er-folgte die histologische bzw. immunohistochemische Auswertung der Konstrukte. Unabhängig von der Kultivierungsart und -dauer konnte bereits nach 2 Wochen ein Einwachsen des umliegenden Gewebes in die Konstrukte mit einer begleitenden Entzündungsreaktion beobachtet werden. In der weiteren Untersuchungsperiode wurden die signifikante Abnahme der Entzündungsreaktion sowie eine Zunahme von Blutgefäßen und multinuklearen Riesenzellen festgestellt. Zusätzlich konnten Fettzel-len überwiegend in den statisch besiedelten Konstrukten nachgewiesen werden. Die Knochenneubildung in den implantierten Konstrukten wurde nicht beobachtet. Immu-nohistochemisch konnten die hMSC mit Hilfe von HLA-1-Antikörpern nur in besiedel-ten Leitschienen nach 2 und 12 Wochen Implantationsdauer detektiert werden. Es konnte eine gute Integration der Leitschienen in das umliegende Gewebe sowie ein Überleben der implantierten Zellen über einen Untersuchungszeitraum von 12 Wochen nachgewiesen werden, wobei keine signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Kultivierungsformen beobachtet wurden. Das Auftreten von Fettzellen ist möglicherweise auf eine adipogene Differenzierung der implantierten Zellen zurück-zuführen.

Zielsetzung und Fragestellung: Die Regenerative Medizin weckt mit der Entwicklung vitalisierter Ersatzmaterialien große Hoffnung für künftige Behandlungsmethoden ausgedehnter Knochendefekte. Im Vorfeld der Übertragung auf die Klinik gilt es jedoch, Materialien eingehend zu testen, um das Risikoprofil neuartiger Implantate besser abschätzen zu können. Dies besitzt für die Human- und Veterinärmedizin gleichermaßen Gültigkeit. Vor diesem Hintergrund war es Gegenstand der hier vorgestellten Arbeit, ein Defektmodell in der Ratte für die orthotope Testung zellbesiedelter Gewebekonstrukte zu etablieren. Selbstentworfene Leitschienen für den Knochenersatz wurden zunächst in vitro getestet und optimiert, um im Anschluss in einer Pilotstudie in vivo auf ihr heilungsförderndes Potential getestet zu werden. Material und Methoden: Die Studie wurde in konsekutive Abschnitte gegliedert. Die Implantatentwicklung umfasste die Strukturgenerierung dreidimensional mittels Rapid-Prototyping-Verfahren hergestellter Hydroxylapatitkeramiken. In vitro wurde das Verhalten humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC) auf diesen Leitschienen hinsichtlich Zellverteilung, -vitalität und Differenzierbarkeit überprüft. Für die Etablierung des orthotopen Defektmodells wurden Osteosynthesesysteme entworfen und auf ihre mechanische Belastbarkeit sowie auf ihre Anwendbarkeit am Tier getestet. In einer dritten Stufe wurde der Einfluss der entwickelten Knochenersatzmaterialien auf die Knochenheilung sowohl in Kombination mit hMSC als auch ohne Zellen im präklinischen Tiermodell getestet. Die Auswertung erfolgte mit radiologischen und histologischen Techniken über zwei beziehungsweise zwölf Wochen. Ergebnisse: Keramikleitschienen aus Hydroxylapatit konnten mit Rapid-Prototyping-Verfahren in einer an die Defektgröße angepassten Dimension (3 x 6 mm) hergestellt werden. Die allgemeinen Anforderungen für Knochenersatzmaterialien hinsichtlich Stegbreiten, Porengrößen und Interkonnektivität des Porensystems wurden gänzlich erfüllt. Anhand von Zellkulturversuchen wurde die am besten geeignete Teststruktur für die In-vivo-Versuche ausgewählt. Kriterien waren ein gleichmäßiges Verteilungsmuster, hohe Vitalität sowie Differenzierbarkeit humaner mesenchymaler Stammzellen auf den Materialien. Für die Etablierung eines Defektmodells am Rattenfemur wurde zunächst ein geeignetes Fixationssystem für die Osteosynthese ausgewählt. Ein externer Fixateur wurde eigens entworfen und nach einem Stereolithographieverfahren aus leichten Polymerkunststoffen gebaut. In der mechanischen Testung verschiedener Osteosynthesesyteme (zwei externe Fixateure, eine Titanplatte für die interne Fixation) zeigte sich eine ausreichende Stabilität aller ausgewählten Testobjekte. Aufgrund der besten intraoperativen Anwendbarkeit und dem höchsten Tragekomfort für das Tier wurde die Platte für die Anwendung in vivo ausgewählt. In einem 6 mm großen Vollschaftdefekt der Femurdiaphyse wurden die zuvor entwickelten Implantate getestet. Als Kontrollen dienten biologische Keramiken. Weder die radiologischen noch die histologischen Ergebnisse ließen substanzielle Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen erkennen. Eine knöcherne Konsolidierung der Defektzone wurde auch nach einer zwölfwöchigen Nachbeobachtungszeit nicht nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten sich weitgehend unabhängig von der Art der Leitschienenbehandlungen (ohne, beziehungsweise mit Zellbesiedelung). Jedoch wurden Tendenzen ersichtlich, dass eine Zellbehandlung der Implantate die Knochenneubildung begünstigt. Schlussfolgerungen: 1. Rapid-Prototyping-Verfahren stellen eine gut geeignete Methode für die Herstellung feinstrukturierter biokompatibler Knochenersatzmaterialien dar. 2. Reine Hydroxylapatitkeramiken können die Knochenregeneration eines Vollschaftdefektes nicht ausreichend unterstützen. Eine Vitalisierung der Implantate resultiert nicht in einer vollständigen Heilung nach einem Nachbeobachtungszeitraum von 12 Wochen, eine Tendenz zu einer weiter reichenden Knochenneubildung liegt jedoch vor. 3. Auch biologische Keramiken (zellfreie bovine Knochenmatrix) können keine Defektheilung bewirken. Dies gilt ebenso für unbesiedelte Implantate wie für Zellträger. 4. Ein 6 mm Vollschaftdefekt der Femurdiaphyse stellt einen Defekt kritischer Größe dar. Dabei bleibt das Regenerationspotential grundsätzlich unberührt. Der Einfluss unterschiedlicher Implantate auf den Heilungsprozess kann somit bewertet werden. Mit histologischen und radiologischen Methoden kann der Effekt verschiedener Implantate auf die Knochenheilung adäquat abgebildet werden. Ausblick: In dem hier vorgestellten Projekt wurden Ergebnisse generiert, die einige Schwächen der bisher verwendeten Implantate aufdecken konnten. Zum einen scheint das osteogenetische Potential der transplantierten Zellen für eine Defektüberbrückung nicht ausreichend zu sein und zum anderen steht deren Vitalität nach erfolgter Übertragung in Frage. Um zu einem besseren funktionellen Ergebnis zu gelangen werden derzeit zwei Studienansätze verfolgt. So sollen mit Methoden des lentiviralen Gentransfers humane mesenchymale Stammzellen modifiziert werden. Durch stabile Überexpression von BMP-2 können diese Zellen die Therapie ausgedehnter Knochendefekte ermöglichen. Ein weiterer Ansatz versucht, die Probleme des mangelhaften Zellüberlebens zu lösen. Dies soll in vivo durch eine axiale Perfusion der Zellträger, die eine Gefäßneubildung innerhalb der Konstrukte bewirkt, erreicht werden. Nachfolgend wird eine Testung der modifizierten Zellen beziehungsweise der prävaskularisierten Leitschienen im Hinblick auf deren Potential, die Geweberegeneration zu unterstützen, in dem hier etablierten orthotopen Femurdefektmodell an der Ratte erfolgen.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen aufgrund ihres Differenzierungspotentials einen großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin dar. Entsprechend zahlreicher zell- und tierexperi-menteller Untersuchungen scheint die klinische Anwendung dieser adulten Stammzellpopulation im Rahmen einer Zelltherapie in greifbare Nähe zu rücken, wobei MSC als Basis für einen Patien-ten-spezifischen Zell- und Gewebeersatz dienen könnten. In welcher Weise die regenerative Kapazität der MSC durch spezielle Signaltransduktionsmechanismen gesteuert wird, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Wnt/β-Catenin-Signaltrans-duktionsweg sowohl in humanen (hMSC) als auch in murinen (mMSC) mesenchymalen Stamm-zellen untersucht. Diesem komparativen Ansatz lag das Ziel zugrunde, Gemeinsamkeiten und Unterschiede in diesen beiden Zellentitäten zu evaluieren, um damit langfristig den Grundstein für die Übertragbarkeit von Daten aus nachfolgend geplanten murinen in vivo-Modellen auf die klinische Situation legen zu können. Hierzu wurden zunächst die Basis-Komponenten des Wnt/β-Catenin-Signalweges vergleichend analysiert. Eine Aktivierung des Wnt-Signalweges wurde über Stimulation mit Wnt3a bzw. LiCl in beiden Zellspezies sowie in einem RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Ansatz durch Knockdown der für den β-Catenin-Abbaukomplex essentiellen Proteine APC und Axin2 in hMSC erreicht, während eine Inhibtion durch die Transfektion von small interfering RNAs (siRNAs) gegen das transkrip-tionsaktivierende Protein β-Catenin bzw. den Wnt-Korezeptor LRP5 induziert wurde. Dabei zeigten sich neben zahlreichen Gemeinsamkeiten unter anderem hinsichtlich der Proliferation auch klare Unterschiede zwischen hMSC und mMSC. Dies betraf insbesondere die Steuerung von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-mediierten Invasionsprozessen, die im Falle von hMSC eine deutliche Wnt-Abhängigkeit aufwiesen, während die Invasionsfähigkeit von mMSC nicht durch den Wnt-Signalweg reguliert wurde. Diese Unterschiede in den zellulären Phänotypen spiegelten sich vorwiegend in einer Spezies-divergenten Regulation der Matrix-Metalloproteinase MT1-MMP wider, da nur in hMSC die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade mit einer vermehrten MT1-MMP-Expression einherging. Darüber hinaus konnte das Tcf/Lef-Reporter-System in mMSC etabliert werden, das die Quanti-fizierung β-Catenin-abhängiger Expression ermöglicht. Dies erfolgt mit Hilfe eines Reporter-proteins, dessen Expression nur nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern induziert wird. Mit diesem System konnte unter anderem auch der Nachweis der funktionellen Plasmid-kodierten Wnt3a-Expression erbracht werden. Derartig generierte Reporter-mMSC könnten vor allen Dingen hinsichtlich einer Anwendung im in vivo-Mausmodell von großem Vorteil sein, da Wnt-aktive MSC mittels eines in vivo-Imaging-Systems visualisiert werden können, um ihre Rolle bei Geweberegenerationsprozessen aufzuklären. In einem weiteren Teilprojekt wurde die Wirkung von Dkk-1, einem Inhibitor des kanonischen Wnt-Signalweges, in hMSC eingehend untersucht. Dabei stand die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Dkk-1 und seinem Rezeptor LRP6 im Vordergrund. Versuche zum LRP6-Knockdown brachten ein komplexes Regulationssystem zutage, das eine feinjustierte Balance zwischen akti-vierenden und inhibierenden Signalen impliziert. Die Ergebnisse zusätzlicher RNAi-basierter Experimente wiesen außerdem auf eine funktionelle Divergenz von LRP5 und LRP6 hin. So vermittelt der Wnt-Korezeptor LRP5 vornehmlich aktivierende Signale, wie sie z.B. durch Wnt3a ausgelöst werden, während LRP6 hauptsächlich eine repressive Funktion beispielsweise durch Bindung von Dkk-1 zuzuordnen ist. Da neben den LRP-Rezeptoren auch Frizzled-Rezeptoren (Fzd) eine wesentliche Rolle bei der Wnt-Signalerfassung spielen, wurde zunächst das Fzd-Expressionsprofil in hMSC und mMSC mittels semiquantitativer RT-PCR-Analysen näher untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle bisher bekannten 10 Fzds auch in MSC exprimiert werden, dieses jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Zudem ergaben Wnt3a-Stimulationsexperimente in hMSC, dass die Expression von Fzd8 negativ durch Wnt3a beeinflusst wird. Um die Bedeutung von Fzd8 näher zu evaluieren, wurden daher Fzd8-Knockdown-Experimente durchgeführt. Diese ließen erkennen, dass die hMSC-Proliferation maß-geblich von der Fzd8-Expression abhängt, wobei allerdings Fzd8 keinen direkten Rezeptor für Wnt3a darstellt. Zusammenfassend spiegeln die in der vorliegenden Promotionsarbeit erhobenen Daten zum Teil eindeutige Unterschiede zwischen basalen Wnt-regulierten Prozessen in hMSC und mMSC wider, denen insbesondere bei der präklinischen Validierung von therapeutischen Strategien in Maus-modellen eine tragende Rolle zukommt. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg maßgeblich an der Steuerung des invasiven Verhaltens von hMSC beteiligt ist, wie dies in ähnlicher Weise von anderen Forschergruppen auch für die Metastasierung von Tumorzellen nachgewiesen werden konnte, erscheint es zukünftig von vorrangigem Interesse, die hier erhobenen in vitro-Daten in einem in vivo-Mausmodell zu evaluieren. In diesem Kontext kann allerdings nur durch einen komparativen Ansatz, wie er dieser Arbeit zugrunde liegt, die Basis für ein Spezies-relevantes drug design bezüglich des Wnt-Signalweges entwickelt werden, um schließlich aussagekräftige Stamm-zelltherapien bzw. Anti-Tumorstrategien entwickeln zu können.

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Unsere Untersuchungen zeigen erstmalig eine Vierfach-Immunfluoreszenz auf humanen mesenchymalen Stammzellen. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren und die Lokalisation der nachgewiesenen Antigene zu untersuchen. Die markierten Proteine Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV und CD 44 gehören dabei zum typischen Expressionsmuster von mesenchymalen Stammzellen. Durch die Kombination von Filtersets und dem Einsatz des spektralen Bildanalyseprogramms SpectraView (ASI, Israel) gelang es selbst Wellenlängen, die näher als 20nm beieinander lagen, voneinander zu unterscheiden. Bei der Auswertung bestätigte sich, dass hMSC aus einem heterogenen Zellpool bestehen. Dies zeigte sich unter anderem in der unterschiedlichen Expression des Markers Kollagen IV. Erweitert man nun das Färbeprofil um zusätzlichen Marker, so können diese Zellen auf Einzelzellebene eingehender untersucht und von anderen Zellarten und Vorläuferstufen abgegrenzt werden. Die in dieser Arbeit neu für diese Applikation etablierte Methode stellt einen erfolgsversprechenden Ansatz zur Identifikation und Charakterisierung von humanen mesenchymalen Stammzellen dar.

Ein Ziel der Arbeit war es herauszufinden, ob hMSC Telomeraseaktivität besitzen, über welche sie als Stammzellen identifiziert werden können. Im Rahmen des Tissue Engineering von Knochen sollte zudem ermittelt werden, wie sich die Telomeraseaktivität und die Telomerlängen der hMSC während ihrer osteogenen Differenzierung verändern.

Mit zunehmendem Wissen über die Komplexität der Osteogenese wurde die Aussagekraft einzelner osteoblasten-assoziierter Marker in den letzten Jahren immer mehr in Frage gestellt. Denn der Nachweis einzelner Marker erlaubt weder eine eindeutige Identifikation undifferenzierter hMSC noch eine Abgrenzung von hMSC zu anderen Reifungsstufen der osteoblastären Kaskade. Das Ziel dieser Untersuchung war es daher, über die Erstellung eines immunzytochemischen Färbeprofils mehrerer Marker gleichzeitig, undifferenzierte hMSC eindeutig zu identifizieren und sie gegenüber hOB und evtl. weiteren Differenzierungsstufen der osteoblastären Kaskade abzugrenzen. Durch die Erstellung eines immunzytochemischen Färbeprofils ist es möglich, heterogene Zellpopulationen auf Einzelzellniveau zu charakterisieren und sie voneinander zu unterscheiden. Diese Untersuchung stellt einen sehr erfolgversprechenden Ansatz dar, undifferenzierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) zu identifizieren und sie von Zellen der osteoblastären Differenzierungskaskade sowie anderen Zelltypen abgrenzen zu können. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass humane MSC und humane Osteoblasten jeweils spezifische Färbeprofile aufweisen, die eine eindeutige Diskriminierung der beiden Zellpopulationen erlauben. Für eine spezifische Unterscheidung auf Einzelzellnineau ist eine intensive Suche nach spezifischen Markern oder die Kombination mehrerer Marker notwendig. Von den in dieser Arbeit ausgewählten Proteinen ergaben Bone Sialoprotein, Osteocalcin, Decorin sowie Kollagen-IV und Kollagen-X unterschiedliche Färbemuster. Kollagen-IV und –X waren besonders in hMSC positiv, weswegen sie sich für eine Erkennung unreifer osteoblastärer Zellen anbieten. Bone Sialoprotein, Osteocalcin und Decorin eignen sich dagegen für einen Nachweis reifer osteoblastärer Zellen, denn sie waren nur in hOB positiv. Osteocalcin und Decorin erlaubten außerdem eine Abgrenzung differenzierter hOB. Die Proteine Versican und Matrixmetalloproteinase-2 erscheinen darüber hinaus für eine Unterscheidung von osteoblastären und fibroblastären Zellen nützlich zu sein. Die klassischen osteoblastären Marker alkalische Phosphatase, Kollagen-I, Osteopontin oder Osteonectin waren für eine Unterscheidung von hMSC und hOB nicht geeignet, da sie in beiden Zellpopulationen gleiche Ergebnisse lieferten. Insbesondere der Wert der alkalische Phosphatase als immunzytochemischer Marker der osteoblastären Kaskade wird in dieser Untersuchung in Frage gestellt. Eine osteogene Stimulation von hMSC mit Dexamethason, b-Glyzerophosphat und Askorbinsäure bewirkte eine deutliche Veränderung der Morphologie, der Wachstumseigenschaften und des Färbeprofils. Allerdings konnte durch eine osteogene Stimulation kein immunzytochemischer Phänotyp von hMSC induziert werden, welcher identisch mit dem der hOB war. Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine Stimulation in vitro mit den oben aufgeführten Zusätzen die komplizierten Verhältnisse der Osteogenese in vivo nachahmen kann.