Podcasts about zinkfinger

Die Myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) gehört, zusammen mit der Myotonen Dystrophie Typ 1 (DM1), zu den häufigsten erblichen Muskelerkrankungen des Erwachsenenalters. Sie wird autosomal dominant vererbt, ihre Inzidenz liegt bei 1:10.000 - 1:20.000. Die genetische Ursache der Myotonen Dystrophie Typ 2 ist ein abnorm expandiertes Tetranukleotid-CCTG-Repeat im Intron 1 des Zinkfinger-9-Gens (ZNF-9) auf Chromosom 3q21.3. Das kleinste, bisher in der Literatur beschriebene, Krankheitsallel zeigte eine Expansion von 75 CCTGs. Im Regelfall haben DM2-Patienten ein expandiertes Allel mit mehr als 5000 CCTG-Repeats. Die CCTG-Repeats akkumulieren in sog. ribonukleären Foci im Zellkern und im Zytoplasma. Dadurch kommt es zu Störungen in RNA-Prozessierungs- und Metabolisierungsvorgängen, wie dem alternativen Spleißen oder der Proteintranslation. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal eine Phänotyp-Genotyp-Analyse von DM2-Patienten mit einem Repeat, kürzer als 75 CCTGs, sowie die Evaluation der Pathogenität dieser kurzen Repeats. Die Evaluation der Pathogenität geschah mithilfe verschiedener Nachweismethoden in Mus-kelbioptaten und in der genomischen DNA. Der Repeat-Nachweis im Muskelbioptat wurde einerseits immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern gegen das CUG Bindungspro-tein 1 (CUGBP1) und gegen die Muscleblind-like Proteine 1-3 (MBNL1-3) geführt, anderer-seits mittels der Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechnik unter Verwendung einer DNA-Sonde. Zur spezifischeren Detektion, der für die DM2-Erkankung typischen Repeat-Expansion, wurde eine PCR und eine Triplet-Repeat-Primed PCR angeschlossen. Des Weite-ren fand eine Sequenzierung der Blutproben der Patienten statt, zur möglichst genauen Analy-se der Repeat-Größe. In der vorliegenden Arbeit konnte der Repeat-Nachweis in den Muskelbioptaten mit den be-schriebenen Methoden bei allen untersuchten Patienten erfolgreich geführt werden. In den PCRs waren erhöhte Produkte nachweisbar. Die angeschlossene TP-PCR zeigte eindeutige Prämutationsmuster und die Sequenzierung der genomischen DNA ergab eine reproduzierbare Repeatlänge zwischen 32 und 36 CCTGs. In der Zusammenschau mit dem erhobenen Phä-notyp sind somit bereits CCTG-Repeat-Expansionen unter 75 CCTGs pathogen. Zur funktio-nellen Absicherung der Pathogenität wurde ergänzend eine Repeat-Untersuchung im Muskel durchgeführt und das für den Pathogenitätsnachweis etablierte CLCN1 splicing assay. Auch hier bestätigte sich die funktionale Relevanz dieser Mini-Repeat-Expansionen. Somit kann aufgrund der Untersuchungen dieser Arbeit die untere Grenze der als pathogen anzusehenden Repeat-Expansion bei der Myotonen Dystrophie Typ 2 auf eine Repeat-Anzahl von 35 CCTGs festgesetzt werden, die sich mit der von Normalallelen nahezu überlappt. Daraus ergeben sich bedeutende diagnostische und klinische Konsequenzen für Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen und dem Verdacht auf eine Myotone Dystrophie Typ 2.

[NiFe]-Hydrogenasen besitzen in ihrem aktiven Zentrum neben den namengebenden Metallen Nickel und Eisen die Nicht-Protein-Liganden CO und CN. Die Synthese und der Einbau dieses NiFe(CN)2CO Zentrums ist ein komplexer Prozess mit neuartigen bioanorganischen Fragestellungen, an dem eine Reihe von Hilfsproteinen beteiligt sind. Im Fall von Escherichia coli handelt es sich hierbei um die sieben Reifungsenzyme HypA, HypB, HypC, HypD, HypE und HypF. Zusätzlich bedarf es einer spezifischen Endopeptidase sowie ATP, GTP und Carbamoylphosphat als niedermolekulare Substrate. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Ablauf der Hydrogenasereifung und der Charakterisierung der am Metalleinbau beteiligten, akzessorischen Proteinen. Im Einzelnen wurden folgende Resultate erzielt: 1. Die Funktion von HypA/HybF in vivo wurde als die eines Metallochaperons bestimmt, was einhergeht mit der Forderung nach Nickelbindung. Diese konnte experimentell nachgewiesen werden. Das Auffinden von stöchiometrischen Mengen an Zink sowie ein konserviertes Cysteinmotiv deuten auf einen “Zinkfinger“ hin, der von struktureller Bedeutung für das HybF-Protein ist. Ein Reifungsnetzwerk zwischen den drei Hydrogenasen von E. coli wurde erstellt, welches eine Regulation epistatisch zur Expression der Gene darstellt. 2. Die Charakterisierung des HypD Proteins durch Mössbauer-Spektroskopie ergab, dass es ein EPR-stilles [4Fe-4S]2+ Cluster enthält, welches ihm die gelbliche Farbe und das typische UV-VIS Spektrum verleiht. Die Bestimmung der Eisen- und Schwefelmenge im Wildtyp-Protein und in HypD-Varianten verstärkten diesen Befund. Austausche der konservierten Aminosäuren von HypD ergaben, dass ein C-terminales Cysteinmotiv zur Stabilität des Proteins beiträgt, weshalb die Cysteinreste als Liganden des FeS-Clusters vorgeschlagen wurden. 3. Da Carbamoylphosphat (CP) für die Synthese der Cyanidliganden notwendig ist, wurde ein CP-negativer E. coli Stamm näher untersucht. Dabei wurde ein Proteinkomplex aus zwei Hilfsproteinen (HypC und HypD) entdeckt, der ein Reifungsintermediat darstellt. 4. Die am HypE-Protein synthetisierte Cyanidgruppe wird auf den HypC-HypD Komplex übertragen. Dieser in vitro Befund führte zur Aufstellung eines neues Reifungsmodels als Zusammenfassung dieser Arbeit, wobei ein Gerüstkomplex zur Ligandensynthese postuliert wird.

Der Neurotrophinrezeptor p75 wurde als erstes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie kloniert. Da die trophischen Eigenschaften der Neurotrophine durch eine zweite Klasse von Rezeptoren, die Trk-Rezeptor-Tyrosinkinasen, vermittelt werden, wurde p75 lange als deren „Corezeptor“ angesehen. Inzwischen gibt es viele Beweise für eine eigen-ständige Signaltransduktion durch p75, die beispielsweise zur Aktivierung von NF-κ B oder zu programmiertem Zelltod führen kann. Zu Beginn dieser Arbeit war weitgehend unbekannt, wie der Neurotrophinrezeptor p75 apoptotische Signale im Inneren der Zelle weiterleitet. Unter Verwendung des Hefe-„Two-Hybrid“- Systems war im Vorfeld das Zinkfingerprotein NRIF1 („Neurotrophin Receptor Interacting Factor“) als potentieller p75-Interaktionspartner identifiziert worden. Die wichtige Rolle dieses Proteins als Vermittler von apoptotischen Signalen konnte später durch gezielte Deletion des nrif1-Gens in der Maus bestätigt werden: In nrif1-Nullmutanten wurde eine Reduktion des embryonalen Zelltodes von Nervenzellen der Netzhaut nachgewiesen, deren Ausmaß dem einer p75- oder ngf („Nerve Growth Factor“)-Deletion entsprach (Casademunt et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde ein zweites nrif-Gen (nrif2) kloniert, das zu über 90% mit nrif1 identisch ist. Beide Proteine besitzen typische Strukturmerkmale negativ regulatorisch wirkender Transkriptionsfaktoren. Der carboxyterminale Abschnitt enthält fünf Zinkfinger des Cys2-His2-Typs, die eine Bindung an DNA vermitteln könnten, während der aminoterminale Bereich zwei KRAB-Domänen enthält, die Transkriptionsrepressor-Module darstellen. Das nrif2-Gen wird im 5’-untranslatierten Bereich differentiell gespleißt. Durch Experimente mit rekombinanten Proteinen aus E. coli und Fibroblasten-Zellinien wurde die vermutete Interaktion von NRIF und p75 biochemisch nachgewiesen. Die Ver-wendung unterschiedlicher Deletionskonstrukte zeigte, daß für die Wechselwirkung nur die Juxtamembran-Domäne des Rezeptors und ein carboxyterminaler Abschnitt von NRIF (stromaufwärts der Zinkfinger) nötig sind. NRIF-Proteine können unter Bildung von Homo- und Heterodimeren mit sich selbst interagieren. Die Colokalisierung von NRIF1 und NRIF2 bzw. NRIF und p75 nach transienter Transfektion von Fibroblasten-Zellinien bestätigte die biochemisch nachgewiesenen Interaktionen auch in vivo. Die Expression von NRIF in Zellinien neuronalen Ursprungs offenbarte eine mögliche Funktion als Auslöser von Apoptose, welche unabhängig von p75 allein durch Über-expression dieser Zinkfingerproteine verursacht wurde. Außerdem war in NRIF-überexprimierenden Zellen der Einbau von BrdU, einem Thymidin-Analogon, das Zellen in der S-Phase des Zellzyklus markiert, stark eingeschränkt. Diese Funktionen von NRIF sindbesonders interessant, da in den letzten zwei Jahren weitere Adaptermoleküle des Neuro-trophinrezeptors p75 identifiziert wurden, die einen Einfluß auf Apoptose und/oder den Ablauf des Zellzyklus besitzen. p75 spielt insbesondere während des programmierten Zelltodes in der Entwicklung des Nervensystems eine wichtige Rolle und wird im Embryonalstadium am stärksten exprimiert. Die Analyse der mRNA-Expression von nrif bestätigte, daß auch nrif1 und nrif2 während der Embryonalentwicklung deutlich höher exprimiert sind als in adulten Mäusen. Nrif-mRNA wurde jedoch im Gegensatz zu p75-mRNA ubiquitär in allen untersuchten embryonalen Geweben nachgewiesen. In weiterführenden Experimenten wurden transgene Mäusen untersucht, in denen das nrif1-Gen durch homologe Rekombination entfernt worden war. Diese Mäuse sind in einem kongenen Sv129- oder einem gemischten Sv129/BL6-Hintergrund lebensfähig und fertil, sterben jedoch im BL6-Hintergrund ungefähr am zwölften Embryonaltag. Die Hypothese, daß die nrif2-mRNA-Menge in überlebenden Tieren erhöht sein könnte, wurde zuerst in neugebo-renen Sv129-Mäusen durch semiquantitative RT-PCR-Analysen bestätigt. Eine vergleichen-de Untersuchung 10,5 Tage alter Embryonen aus verschiedenen Stämmen deutete auf die Möglichkeit einer funktionellen Kompensation hin: Während in Nullmutanten des Sv129- Stammes die nrif2-mRNA-Konzentration ungefähr doppelt so hoch war wie in Wildtyp-Tieren, konnten BL6-Nullmutanten die nrif2-Menge nicht differentiell regulieren. Das Fehlen von NRIF1 und die gleichzeitige Unfähigkeit einer ausgleichenden Hochregulation von NRIF2 könnten ein wichtiger Grund für die embryonale Letalität der nrif1 (-/-)-Embryonen im BL6- Stamm sein. Eine genau ausgewogene Menge der Zinkfingerproteine NRIF1 und NRIF2 scheint demnach essentiell zu sein, damit wichtige Prozesse wie Zellzyklus und Apoptose ungestört ablaufen können.