Podcasts about zelltodes

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Organtemperatur während der Ischämie auf den mikrovaskulären Ischämie-Reperfusionsschaden systematisch zu analysieren. Um dies zu ermöglichen wurde im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit ein geeignetes Tiermodell etabliert. Das entwickelte Modell ermöglichte eine reversible in situ Ischämie mit anschliessender Reperfusion des linken Leberlappens der Maus. Während der Ischämie konnte der ischämische Leberlappen genau auf die gewünschte Temperatur eingestellt und konstant gehalten werden. Abgesehen von der unterschiedlich eingestellten Organtemperatur, herrschten bei allen Versuchsgruppen gleiche Bedingungen. Weder bei der Körperkerntemperatur noch bei dem mittleren arteriellen Blutdruck gab es signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Nach darauffolgender Reperfusion ermöglichte das Modell eine intravitalmikroskopische Analyse der Mikrozirkulation und anschliessende ex vivo Messungen vieler Schadensparameter. Damit ist es gelungen, ein geeignetes Tiermodell zur systematischen in vivo Analyse des singulären Einflusses verschiedener Organtemperaturen auf den hepatischen Ischämie-Reperfusionsschaden der Maus, zu etablieren. Die Ergebnisse wiesen, in Übereinstimmung mit der Literatur, einen ausgeprägten Ischämie-Reperfusionsschaden nach normothermer Ischämie auf. Dabei war die sinusoidale Perfusionsrate signifikant reduziert, es trat eine deutliche Zunahme der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion auf und es folgte eine massive Freisetzung der Leberenzyme AST/GOT und ALT/GPT. Erstaunlicherweise konnten bereits durch eine milde Hypothermie von 26°C sämtliche Schadensparameter auf das Niveau der Shamgruppe reduziert werden. Entgegen der Erwartung scheint es keinen linearen Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß des mikrovaskulären Schadens zu geben. Vergleichbar mit den Ergebnissen der Mikrozirkulation war nach normothermer Ischämie auch eine Vielzahl apoptotischer Zellen zu verzeichnen. Nahezu 17% der Hepatozyten waren TUNEL-positiv und die Aktivität der apoptose-spezifischen Caspase-3 nahm um etwa das vierfache zu. Auch hier bewirkte bereits ein mildes Abkühlen des ischämischen Leberlappens auf 31,5°C eine vollständige Protektion der Leberzellen vor Apoptose. Es zeigte sich damit auch hier kein linearer Zusammenhang zwischen Organtemperatur und Ausmaß einer Apoptoseinduktion. Der Verdacht auf eine durch Kälte induzierte Apoptose konnte sich in diesem Versuchsaufbau nicht erhärten. Nach 90-minütiger Ischämie bei 4°C waren, wie auch in der Shamgruppe, weniger als 1% TUNEL-positive Zellen zu verzeichnen und ein Anstieg der Caspase-3-Aktivität blieb vollständig aus. Bei der Betrachtung, ob es sich bei der Zellschädigung um nekrotischen oder um apoptotischen Zelltod handelt, ergaben die verwendeten Messmethoden deutliche Hinweise für beide Arten des Zelltodes.

Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern. So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt. Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing"). Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden. Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.

Den überwiegend in den Mitochondrien lokalisierten Membranproteinen der Bcl-2-Familie wird eine besonders kritische Bedeutung beim Schutz der Zelle gegen den apoptotischen Zelltod beigemessen. Der genaue Wirkungsmechanismus dieser Proteine ist bis dato unbekannt. Sie sind aber in der Lage, in der mitochondrialen Membran Kanäle zu bilden und dadurch den funktionellen Veränderungen in den Mitochondrien im Verlauf der Apoptose sowie ihrer Schwellung entgegenzuwirken. Eine Störung des mitochondrialen Elektronentransports und die Öffnung der sogenannten „permeability transition“-Pore sind als frühe Ereignisse im Verlauf des apoptotischen Zelltodes bekannt. Der Entkoppler mitochondrialer Atmung und Phosphorylierung, FCCP, verursacht durch eine Erhöhung der Permeabilität der inneren mitochondrialen Membran für Protonen ähnliche Störungen der mitochondrialen Funktion. Ziel dieser Arbeit war es, den Effekt des mitochondrialen Entkopplers FCCP alleine oder in Kombination mit bekannten Apoptoseinduktoren, wie dem Proteinkinase C-Inhibitor Che und dem Serin/Threonin-Proteinkinasehemmer Sts zu untersuchen. Desweiteren sollten biochemische Mechanismen aufgeklärt werden, die der Modulation der Apoptose durch FCCP in Leukämiezellinien des lymphatischen (CCRF-CEM) und myeloischen (HL-60) Ursprungs zugrunde liegen. Der Effekt mitochondrialer Entkoppler auf die durch Che und Sts induzierte Apoptose sollte ausserdem mit der Wirkung bekannter Modulatoren des programmierten Zelltodes wie Caspasehemmer zVAD und Ca2+Mg2+-Endonuklease-Inhibitor ATA in gleichem Modellsystem verglichen werden, um weitere Hinweise über die Stärke und Dauer der apoptosemodulierenden Wirkung von FCCP zu erhalten. Die durchgeführten in vitro Zellkulturuntersuchungen zeigten, dass eine Inkubation der CCRF-CEM- und HL-60-Zellen mit FCCP dosisabhängig den verzögerten Zelltod in beiden Leukämiezellinien induzierte. Im FCS-haltigen Zellkulturmedium wurde in beiden Zellinien eine Apoptose nach 18-stündiger Behandlung mit 4 µM FCCP in 25% der Population beobachtet. 50% der HL-60-Zellen und 85% der CCRF-CEM-Zellen waren apoptotisch oder tot, wenn 20 µM FCCP über einen Zeitraum von 18 Stunden eingesetzt wurden. Ein FCS-Entzug resultierte in der Sensibilisierung der CCRF-CEM- und HL-60-Zellinien gegenüber FCCP: mehr als die Hälfte der Population in beiden Leukämiezellinien waren bereits 12 Studen nach Behandlungsbeginn mit FCCP apoptotisch bzw. tot. Die im Westernblot demonstrierte Caspase-3-abhängige proteolytische Spaltung von PARP, sowie die Reduktion des intrazellulären CPP-32-Spiegels (Procaspase-3) zeigte sich bereits 6 Stunden nach Behandlungsbeginn mit FCCP, statt, verglichen mit 24 Stunden unter normalen Inkubationsbedingungen. Im Verlauf der durch FCCP induzierten Apoptose konnten wir mittels konventioneller DNA-Agarose-Gelelektrophorese keine oligonukleosomale DNA-Fragmentierung (180-200 bp) nachweisen, mit Hilfe der pulsed field-Gelelektrophorese wurden lediglich große DNA-Fragmente (15-40 kbp) aufgezeigt. Nach zweistündiger Inkubation mit 10 µM Che bzw. achtstündiger Behandlung mit 300 nM Sts starben 90% CCRF-CEM-Zellen, während 60% der HL-60-Zellen nach zweistündiger Einwirkung von Che apoptotisch bzw. tot waren. Überraschenderweise war die proteolytische Spaltung von PARP nach Behandlung beider Zellinien mit einer niedrigeren Konzentration von Che (10 µM) ausgeprägter als mit der höheren Konzentration des Proteinkinase C-Hemmers (20 µM), obwohl die Anzahl der toten Zellen direkt proportional zur eingesetzten Che-Konzentration war. Die Zugabe von FCCP bzw. von Caspasen-Inhibitor zVAD verzögerten den durch Che und Sts induzierten apoptotischen Zelltod: 20-40% mehr Zellen überlebten innerhalb der ersten sechs Stunden der Inkubation, wenn 4-20 µM FCCP zum Inkubationsmedium zugegeben wurden, während nur 15-20% mehr Zellen bei Zugabe von 50 µM zVAD am Leben blieben. Der protektive Effekt von zVAD und ATA war jedoch nur vorübergehend: sechs Stunden nach Behandlungsbeginn mit Che oder Sts gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied im Überleben der Zellen. Die Vorbehandlung mit ATA verhinderte komplett eine Apoptose in beiden Zellinien, so daß diese mindestens einige Tage nach Behandlungsbeginn mit Serin/Threonin-Proteinkinase-Hemmern intakt blieben. Alle eingesetzten Modulatoren hemmten das Auftreten der durch Che bzw. Sts ausgelösten biochemischen Zeichen der Apoptose, wie oligonukleosomale DNA-Degradation, Abfall der PARP-Aktivität und Aktivierung der Caspase-3. Eine 3-stündige Inkubation der CCRF-CEM- und HL-60-Zellen mit 10 µM Che führte in beiden Zellinien zu einem deutlichen Abfall der intrazellulären NAD+-, NADH-, NADPH- und ATP-Konzentrationen. Insbesondere in der CCRF-CEM-Zellinie stand die Senkung des intrazellulären Gehaltes an Pyridinnukleotiden im Vordergrund, in den myeloischen HL-60-Zellen war die ATP-Depletion ausgeprägter. Während FCCP oder zVAD den Abfall der Energie- und Redoxäquivalente lediglich partiell verhinderten, war ATA in der Lage, die Depletion von NAD+, NADH, NADPH und ATP komplett zu inhibieren. Da FCCP und zVAD lediglich die mit der Apoptose assoziierten biochemischen Phänomene, wie die Aktivierung der Caspase-3 oder der Ca2+-Mg2+-Endonuklease und nicht die Depletion der Energie- und Redoxäquivalente in Leukämiezellen aufhoben, waren die durch die Einwirkung von Che aufgetretenen Störungen des Energiestoffwechsels ein möglicher Grund, weshalb die protektive Wirkung von FCCP und zVAD nur vorübergehend war.

Der Neurotrophinrezeptor p75 wurde als erstes Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie kloniert. Da die trophischen Eigenschaften der Neurotrophine durch eine zweite Klasse von Rezeptoren, die Trk-Rezeptor-Tyrosinkinasen, vermittelt werden, wurde p75 lange als deren „Corezeptor“ angesehen. Inzwischen gibt es viele Beweise für eine eigen-ständige Signaltransduktion durch p75, die beispielsweise zur Aktivierung von NF-κ B oder zu programmiertem Zelltod führen kann. Zu Beginn dieser Arbeit war weitgehend unbekannt, wie der Neurotrophinrezeptor p75 apoptotische Signale im Inneren der Zelle weiterleitet. Unter Verwendung des Hefe-„Two-Hybrid“- Systems war im Vorfeld das Zinkfingerprotein NRIF1 („Neurotrophin Receptor Interacting Factor“) als potentieller p75-Interaktionspartner identifiziert worden. Die wichtige Rolle dieses Proteins als Vermittler von apoptotischen Signalen konnte später durch gezielte Deletion des nrif1-Gens in der Maus bestätigt werden: In nrif1-Nullmutanten wurde eine Reduktion des embryonalen Zelltodes von Nervenzellen der Netzhaut nachgewiesen, deren Ausmaß dem einer p75- oder ngf („Nerve Growth Factor“)-Deletion entsprach (Casademunt et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde ein zweites nrif-Gen (nrif2) kloniert, das zu über 90% mit nrif1 identisch ist. Beide Proteine besitzen typische Strukturmerkmale negativ regulatorisch wirkender Transkriptionsfaktoren. Der carboxyterminale Abschnitt enthält fünf Zinkfinger des Cys2-His2-Typs, die eine Bindung an DNA vermitteln könnten, während der aminoterminale Bereich zwei KRAB-Domänen enthält, die Transkriptionsrepressor-Module darstellen. Das nrif2-Gen wird im 5’-untranslatierten Bereich differentiell gespleißt. Durch Experimente mit rekombinanten Proteinen aus E. coli und Fibroblasten-Zellinien wurde die vermutete Interaktion von NRIF und p75 biochemisch nachgewiesen. Die Ver-wendung unterschiedlicher Deletionskonstrukte zeigte, daß für die Wechselwirkung nur die Juxtamembran-Domäne des Rezeptors und ein carboxyterminaler Abschnitt von NRIF (stromaufwärts der Zinkfinger) nötig sind. NRIF-Proteine können unter Bildung von Homo- und Heterodimeren mit sich selbst interagieren. Die Colokalisierung von NRIF1 und NRIF2 bzw. NRIF und p75 nach transienter Transfektion von Fibroblasten-Zellinien bestätigte die biochemisch nachgewiesenen Interaktionen auch in vivo. Die Expression von NRIF in Zellinien neuronalen Ursprungs offenbarte eine mögliche Funktion als Auslöser von Apoptose, welche unabhängig von p75 allein durch Über-expression dieser Zinkfingerproteine verursacht wurde. Außerdem war in NRIF-überexprimierenden Zellen der Einbau von BrdU, einem Thymidin-Analogon, das Zellen in der S-Phase des Zellzyklus markiert, stark eingeschränkt. Diese Funktionen von NRIF sindbesonders interessant, da in den letzten zwei Jahren weitere Adaptermoleküle des Neuro-trophinrezeptors p75 identifiziert wurden, die einen Einfluß auf Apoptose und/oder den Ablauf des Zellzyklus besitzen. p75 spielt insbesondere während des programmierten Zelltodes in der Entwicklung des Nervensystems eine wichtige Rolle und wird im Embryonalstadium am stärksten exprimiert. Die Analyse der mRNA-Expression von nrif bestätigte, daß auch nrif1 und nrif2 während der Embryonalentwicklung deutlich höher exprimiert sind als in adulten Mäusen. Nrif-mRNA wurde jedoch im Gegensatz zu p75-mRNA ubiquitär in allen untersuchten embryonalen Geweben nachgewiesen. In weiterführenden Experimenten wurden transgene Mäusen untersucht, in denen das nrif1-Gen durch homologe Rekombination entfernt worden war. Diese Mäuse sind in einem kongenen Sv129- oder einem gemischten Sv129/BL6-Hintergrund lebensfähig und fertil, sterben jedoch im BL6-Hintergrund ungefähr am zwölften Embryonaltag. Die Hypothese, daß die nrif2-mRNA-Menge in überlebenden Tieren erhöht sein könnte, wurde zuerst in neugebo-renen Sv129-Mäusen durch semiquantitative RT-PCR-Analysen bestätigt. Eine vergleichen-de Untersuchung 10,5 Tage alter Embryonen aus verschiedenen Stämmen deutete auf die Möglichkeit einer funktionellen Kompensation hin: Während in Nullmutanten des Sv129- Stammes die nrif2-mRNA-Konzentration ungefähr doppelt so hoch war wie in Wildtyp-Tieren, konnten BL6-Nullmutanten die nrif2-Menge nicht differentiell regulieren. Das Fehlen von NRIF1 und die gleichzeitige Unfähigkeit einer ausgleichenden Hochregulation von NRIF2 könnten ein wichtiger Grund für die embryonale Letalität der nrif1 (-/-)-Embryonen im BL6- Stamm sein. Eine genau ausgewogene Menge der Zinkfingerproteine NRIF1 und NRIF2 scheint demnach essentiell zu sein, damit wichtige Prozesse wie Zellzyklus und Apoptose ungestört ablaufen können.