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Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

Maligne Tumorzellen besitzen die Fähigkeit, sich vom Primärtumor zu lösen und Metastasen zu bilden. Ein Verlust oder Mutationen im Kalzium-abhängigen, homophilen Zell-Adhäsionsmolekül E-Cadherin korrelieren häufig mit der Metastasierung epithelialer Tumore. Vorarbeiten haben gezeigt, dass in humanen E-Cadherin negativen MDA-MB-435S Zellen die Transfektion von bestimmten mutierten E-Cadherin Genen zu einer reduzierten Adhäsion, erhöhten Motilität und veränderten Zellmorphologie führt. Basierend auf diesen Vorarbeiten war das Ziel dieser Arbeit zu untersuchen, welchen Einfluß mutierte E-Cadherine und der Zellkontakt auf das Genexpressionsprofil haben. Das Genexpressionsprofil wurde mittels eines im Rahmen dieser Arbeit etablierten 1259 Sonden (~899 Gene) umfassenden cDNA Mikroarrays bestimmt. Es konnten 88 Prozent der mittels des cDNA Mikroarrays gefundenen Genexpressionsunterschiede durch die Validierung mit Northern Blot Analyse und 94 Prozent durch quantitative realtime RT PCR im Bezug auf die Richtung der Genexpressionsveränderung bestätigt werden. Mit Hilfe des cDNA Mikroarrays wurde der Einfluß von E-Cadherin auf den WNT-Signalweg untersucht. Die in dieser Arbeit durchgeführten Gen- und Proteinexpressionsuntersuchungen zeigten, dass der E-Cadherin Status die Expression der im WNT-Signalweg involvierten Gene DKK1, SFRP1, SFRP3, CTNNAL1 und FZD7 so beeinflusst, dass die beta-Catenin Menge in der Zelle stabil gehalten wird. Diese Ergebnisse wurden bereits in Laboratory Investigation (Laux et al., 2004) publiziert. Die Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen den Zell-zu-Zellkontakt verloren haben, zeigten eine differentielle Expression von Genen, die in der Angiogenese, Proliferation, Matrix Degradierung und Motilität involviert sind. Viele dieser Gene spielen in der Metastasierung als auch in der Wundheilung eine wichtige Rolle. Die Zelllinie mit WT E-Cadherin Status hat einen engen Zell-zu-Zellkontakt und zeigte eine erhöhte Expression von E-Cadherin Repressoren im Vergleich zu den E-Cadherin negativen oder mutierten Zelllinien. Bei einer hohen Zelldichte konnte ebenfalls eine erhöhte Genexpression der E-Cadherin Repressoren detektiert werden. Die Zelllinien erkennen sensitiv den Zell-zu-Zellkontakt Status und regulieren daraufhin autokrin den E-Cadherin Status über eine veränderte Expression der E-Cadherin Repressoren. Eine Regulation des E-Cadherin Status war bei den hier verwendeten Zelllinien aber aufgrund eines artfremden beta-Aktin Promotors vor den E-Cadherin Konstrukten nicht möglich. Um festzustellen, inwieweit der Zell-zu-Zellkontakt für die E-Cadherin abhängige differentielle Expressionen verantwortlich ist, wurde dessen Einfluß auf das Genexpressionsprofil mittels Zelldichteversuche untersucht. Bei einer geringen Zelldichte, bei der die Zellen wenig Kontakt zueinander haben, korrelieren die Genexpressionsver-änderungen mit denen der Zelllinien, die aufgrund von E-Cadherin Mutationen keinen Zell-zu-Zellkontakt haben. Die vorliegende Arbeit hat zur Identifikation von Genen, welche eine wichtige Rolle in der durch mutiertes E-Cadherin vermittelten Invasion spielen (z.B. MMP1, MMP3, VEGFC, SPARC, ITGA3, CYR61, TIMP3, PRKCD, MXI1, PRLR, PLAUR und LASP1), beigetragen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass der Zellkontakt maßgeblich an der differentiellen Expression deren Gene beteiligt ist. Weiterführende Studien können nun die gefundenen Kandidatengene bezüglich Diagnose und Therapie von malignen Tumoren mit E-Cadherin Mutationen genauer charakterisieren. Die Inhibition einiger dieser Proteine stellt einen viel versprechenden Therapieansatz zur Behandlung dieser Tumoren dar.

Pseudomonas aeruginosa ist ein bedeutender Erreger nosokomialer Infektionen. Besondere Bedeutung erlangt es im Krankheitsverlauf der Cystischen Fibrose. Hier und bei anderen Erkrankungen kann die Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu schweren Verläufen führen. Ein Typ-III-Sekretions-positiver Phänotyp, das heißt der Besitz des ExoS-Regulons, ist dabei von prognostischem Wert hinsichtlich Gewebszerstörung, Krankheitsverlauf und Überleben. Bisher ist jedoch wenig über die Regulation des ExoS-Regulon bekannt. Sinnvoll erscheint eine gegensätzliche Expression mit dem Typ-II-Sekretionssytem, da hier zahlreiche degradierende Enzyme sezerniert werden, die auch den Typ-III-Sekretionsapparat beschädigen könnten, und mit der Biofilmbildung, da für Typ-III-Sekretion ein direkter Zellkontakt zur Wirtszelle notwendig ist. Bekannte Regulatoren von Biofilmbildung und Typ-II-Sekretion sind Quorum Sensing, der Sigmafaktor der Stationären Phase (RpoS) und der AlgU-Antisigmafaktor MucA für die Alginatsynthese. In der vorliegenden Arbeit wurden daher ihre Auswirkungen auf die Typ-III-Sekretion untersucht. Hierbei zeigt sich unter Stimulationsbedingungen für Typ-III-Sekretion in vitro und durch Kokulturversuche mit humanen Zellen, daß P. aeruginosa in einem Biofilm nahezu kein ExoS exprimiert. Im Gegensatz dazu werden im Überstand dieser Kokultur größere Mengen an Exotoxin S durch planktonisch wachsende Bakterien erzeugt. Es ließ sich zeigen, daß das rhl-Quorum-Sensing-System von P. aeruginosa die Expression von ExoS und ExoU hemmen kann. Ebenso vermindert der Sigmafaktor der Stationären Phase RpoS die Expression von exoS ebenfalls stark. Die Mutation des AlgU-Antisigmafaktors MucA führt zu einem Anstieg von ExoS in der stationären Phase. Ein möglicher Regulationsweg durch Quorum Sensing besteht in der Aktivierung von ExsD, einem negativen Regulator des ExoS-Regulons. exsD besitzt in der Promotorregion eine Sequenz, die einer lux-Box, das heißt einer Bindungsstelle für die Regulatorproteine (RhlR, LasR) des Quorum Sensing, entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Typ-III-sezernierten Exotoxine durch die oben genannten Faktoren reguliert werden können. Dadurch könnte die Expression des ExoS-Regulons im wesentlichen auf die exponentielle Phase beschränkt und in der stationären Phase und im Biofilm gehemmt werden. Zum anderen kann die verstärkte Expression von Typ-III-sezernierten Exotoxinen bei Mutation des mucA-Genes zur erhöhten Virulenz von mucoiden Isolaten von P. aeruginosa in vivo beitragen.

CpG-Oligonukleotide (CpG-ODN) werden in Vertebraten von Zellen des angeborenen Immunsystems als molekulares Muster eines mikrobiellen Erregers erkannt und lösen als Konsequenz eine Immunreaktion aus. Natürliche Killer T(NKT)-Zellen sind voraktivierte Memory-T-Zellen mit angeborener Spezifität für das CD1d-restringierte Glykolipid-Antigen α-Galaktosylceramid (α-GalCer). CpG-ODN und α-GalCer haben jeweils in tierexperimentellen Vakzinierungsstudien potente Adjuvanseigenschaften gezeigt. Vorbereitend für eine kombinierte Anwendung der beiden Adjuvantien CpG-ODN und α-GalCer zur Verstärkung der spezifischen zellulären Immunität wurde in Teil I dieser Arbeit die Wirkung der gleichzeitigen Gabe beider Adjuvantien anhand der Aktivierung humaner NKT-Zellen untersucht. In Teil II der Arbeit wurde die Wirkung von CpG-ODN auf Rhesusaffen-Immunzellen in vitro untersucht sowie eine Impfstudie mit CpG-ODN als Adjuvans in vivo in Rhesusaffen durchgeführt. Kostimulation mit CpG-ODN plus α-GalCer verstärkte synergistisch die Effektorfunktion von NKT-Zellen und ihre Differenzierung in Richtung Th1. Experimente zur Klärung des Mechanismus, der dem Synergismus zwischen CpG-ODN und α-GalCer zu Grunde liegt, ergaben, dass plasmazytoide DC (PDC) die CpG-vermittelte Aktivierung auf NKT-Zellen übertragen. PDC aktivierten NKT-Zellen über die Ausschüttung von Typ-I-Interferon und einen Zellkontakt-abhängigen Mechanismus. Dieser direkte Zellkontakt zwischen PDC und NKT-Zelle erfolgte Antigen-unabhängig, da PDC aufgrund fehlender CD1d-Expression das Antigen für NKT-Zellen nicht präsentieren können. In Teil II dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die zwei verschiedenen CpG-Typen A und B in vitro auf Rhesusaffen-Immunzellen vergleichbar immunstimulatorisch wirken wie auf humane Immunzellen. Beide CpG-Typen A und B verstärkten als Adjuvantien im Rhesusaffen in vivo die spezifische humorale Immunantwort auf eine Alum-haltige Hepatitis B-Vakzine. Die spezifische T-Zellantwort gegen Hepatitis B-Virus wurde durch CpG-ODN nicht verstärkt. Teil I dieser Arbeit bildet die rationale Basis für den kombinierten Einsatz von CpG-ODN und α-GalCer zur Verstärkung einer Th1-gerichteten Immunantwort. Darüber hinaus trägt dieser Teil der Arbeit zu einem neuen Verständnis der plasmazytoiden DC als speziellem DC-Subtyp bei, der innerhalb des Immunsystems die Aktivierung von Memory-T-Zellen Antigen-unabhängig regulieren kann. Teil II dieser Arbeit bestätigt anhand von in vitro- und in vivo-Untersuchungen, dass der Rhesusaffe ein ideales Primatenmodell für präklinische Studien mit CpG-ODN ist. Im Rahmen einer Vakzinierungsstudie im Rhesusaffen wurde nachgewiesen, dass CpG-ODN eine spezifische Immunisierung im Primaten maßgeblich verstärken können. Basierend auf diesen Ergebnissen sollte nun in nachfolgenden Studien untersucht werden, ob die kombinierte Anwendung von CpG-ODN und α-GalCer eine spezifische T-Zellantwort in vivo im Primaten verstärken kann.