Podcasts about anlagerung

Die biologische und medizinische Forschung stellt immer mehr Informationen über die Funktion des Lebens bereit. Dem voraus geht eine hochpräzise und spezifische Diagnostik. Allerdings gibt es noch keine überzeugenden Lösungen für die Lebend-Überwachung von Substanzen, die möglicherweise an Demenzkrankheiten oder Alterserscheinungen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Grundlagenforschung zur Entwicklung eines Sensors, der in der Lage ist Änderungen des elektrischen Potentials, z.B. neuronale Aktivität, in biologisch relevanter Umgebung zu detektieren. In dem hier behandelten Ansatz wird eine Sensorfläche eingesetzt, welche vollständig aus organischen Materialien aufgebaut ist. Die effektive Schnittstelle zwischen dem Sensor und den Zellen ist eine künstliche Zellmembran, die mit einer Bindungseinheit ausgestattet ist, deren Aufbau dem Vorbild der Natur nachempfunden ist. Der Sensor selbst ist ein organischer Dünnschichttransistor, der seine Sensitivität aus den elektronischen Eigenschaften des organischen Halbleiters erhält. Zudem hat die aktive Schicht eine Dicke von nur 50nm. Entscheidend im Umgang mit organischen Molekülen ist die enge Beziehung zwischen Struktur und Funktion. Die starke Anisotropie der Struktur spiegelt sich in den elektronischen Eigenschaften wider. Die molekulare Anordnung wiederum hängt sensibel von den verwendeten Prozessparametern bei der Herstellung der Schichten ab. Wichtig sind z.B. die Rate, die Temperatur oder die physikalischen Eigenschaften der Oberfläche (polar, nicht-polar, rau etc.). Die so gewonnenen organischen Multischichtsysteme wurden mit Hilfe von Röntgen- und Neutronenstreuung an Großgeräten (Synchrotron, Reaktor) charakterisiert. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit ist das Auffinden und Beeinflussen der Struktur der verwendeten Materialien auf molekularer Ebene. Zunächst werden Konzepte und Aggregationsmechanismen von Molekülen auf Oberflächen vorgestellt. Der experimentelle Teil widmet sich der Herstellung der organischen Halbleiterschicht aus Pentacen (C22H14) auf unterschiedlichen Oberflächen. Durch chemische Modifikation von Diamantoberflächen konnten Pentacen-Filme kontrolliert in stehender oder liegender Phase gewachsen werden. Ferner wurde die Verkapselung organischer Filme mit verschiedensten Techniken und Materialien untersucht. Die Verwendung der Vakuumsublimations-Technik ermöglichte die Konservierung der "Dünnfilmphase" von Pentacen durch Verkapseln mit dem Alkan Tetratetracontan (TTC, C44H90). Somit konnte der stabile Betrieb eines organischen Transistors in ionischer wässeriger Umgebung ermöglicht werden, was den entscheidenden Schritt in Richtung Sensorik darstellt. Des Weiteren gelang der Aufbau einer vielseitig funktionalen Beschichtung, welche von Zellen als ihre natürliche Umgebung akzeptiert wird. Basierend auf substratgestützten Lipid-Doppelschichten wurde mit Hilfe der Biotinbindung ein synthetischer Peptid-Komplex über eine Protein-Zwischenschicht an die Oberfläche gebunden. Dieser Komplex enthält mehrfach die RGD Sequenz, eine Aminosäure-Sequenz, die für die Bindung von Proteinen an ihre Zellrezeptoren verantwortlich ist. Die Struktur der Beschichtung wurde mit Röntgen- und Neutronenbeugung mit einer Auflösung von 5Å bestimmt. Es zeigt sich eine mehrlagige Schichtung beginnend mit einer 36Å Lipidmembran, darüber eine stark hydrierte Zwischenschicht (26Å), gefolgt von einer 38Å dicken Streptavidinschicht und abschließend eine 30Å Schicht aus dicht gepackten, seitlich liegenden Bindungskomplexen. Neuronale Stammzellen wurden auf dieser Beschichtung kultiviert und zeigten rasche Anlagerung sowie eine Ausbreitung auf der angebotenen Oberfläche. Die Kompatibilität der Beschichtung mit dem verkapselten Transistor wurde durch das Ausbilden einer Lipidschicht auf der Sensoroberfläche bestätigt. In Zukunft sollen die Möglichkeiten erforscht werden, mit dieser Anordnung Änderungen des elektrischen Potentials zu messen. Dazu detektiert man zunächst Referenzsignale, die im Elektrolyten über eine Platin- oder eine Ag/AgCl-Elektrode angelegt werden. Aufgrund der vielfältigen Oberflächen, die sich mit Lipidmembranen beschichten lassen, ist diese Methode auch für die Gewebeentwicklung oder als Implantatsbeschichtung interessant.

Polyglutaminerkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen mit fatalem Verlauf, die sich durch selektive neuronale Degeneration und die Bildung intrazellulärer Aggregate auszeichnen. Verursacht werden sie durch eine Expansion einer Polyglutaminsequenz in einem für die Erkrankung spezifischen Protein, die Fehlfaltung und Aggregation des entsprechenden Proteins bewirkt. Die Aggregation wirkt dabei neurotoxisch, wobei Toxizität hauptsächlich durch lösliche Intermediate des Aggregationsprozesses vermittelt wird. Zur Untersuchung der frühen Aggregationsphase und der späteren Elongationsphase wurden in dieser Arbeit verschiedene fluoreszenzbasierte Methoden etabliert. Mit Hilfe dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass nach proteolytischer Spaltung von GST-Htt-Exon1 das Monomer eine Konformationsumlagerung durchmacht, die von einer Dimerisierung oder Oligomerisierung gefolgt wird. Dimere oder Oligomere bilden dabei eine kompakte Struktur aus. Wachstum der Fibrillen erfolgt durch Anlagerung von Monomeren oder einer anderen bisher nicht identifizierten Spezies. Durch Distanzmessungen innerhalb verschiedener Spezies konnte gezeigt werden, dass unlösliche Spezies eine kompakte Struktur aufweisen, die spezifisch für unlösliche Spezies ist. Lösliche Spezies liegen dagegen in einer expandierteren Konformation vor. Molekulare Chaperone üben oftmals eine protektive Funktion auf Neuronen in neurodegenerativen Erkrankungen aus. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit das eukaryontische Chaperonin TRiC, das in einem RNA-interference screen als potentieller Suppressor der Huntingtin-Aggregation identifiziert wurde, Aggregation modulieren kann. Gereinigtes TRiC hat keinen Einfluss auf die frühe Phase der Htt-Exon1-Aggregation, vielmehr inhibiert es die Elongation von fibrillären Strukturen, indem es mit Htt-Exon1-Oligomeren interagiert. Diese Interaktion ist transient und ATP-unabhängig. Im Gegensatz dazu interagiert TRiC in Kooperation mit dem Hsp70/40-System mit Htt-Exon1-Monomeren und verhindert die Nukleation der Aggregation. Stattdessen wird ein „gefaltetes“ Htt-Exon1-Produkt mit einer neuartigen Konformation gebildet, das löslich, nicht-fibrillär und nicht-toxisch ist und ~500 kDa-Oligomere ausbildet. Diese Interaktion ist kooperativ, sequentiell und benötigt ATP, ähnelt also der kooperativen Interaktion von TRiC und Hsp70/40 in der de novo-Proteinfaltung und stellt möglicherweise einen natürlichen Faltungsweg für Huntingtin dar.

Zum Nachweis von PrPc und PrPsc wurde eine Kapillarelektrophorese-Immunofluoreszenz-Methode (CE-LIF) etabliert und mit konventionellen Verfahren (ELISA, Westernblot, Dot-EIA) verglichen. Zur CE-LIF wurde der monoklonale Antikörper F89 und ein Fluoreszenz-markiertes Peptid (FITC-P3) eingesetzt. Die Nachweisgrenze für rekombinantes bovines PrPc liegt bei 1 pg/Test. Zur Anreicherung von PrPsc aus Hirn und Liquor wurden (Ultra-) Zentrifugations-, Extraktions- (HFIP) und Chromatographieverfahren (HPLC, Festphasenextraktion) einzeln oder in Kom-binationen geprüft; darüber hinaus wurden Anreicherungsversuche mit Affinität- bzw. Immu-nomagnetischer Separation vorgenommen. Die Überprüfung des PrPsc-Gehaltes ausgewählter Extrakte im Vergleich zum Ausgangsma-terial mittels ELISA ergab deutliche Substanzverluste. Eine selektive Bindung von PrPsc an Dynabeads® gekoppeltem Plasminogen konnte nicht nachgewiesen werden. Dagegen wurde eine Anlagerung an Antikörper-beschichteten Beads festgestellt. Allerdings war die Bin-dungskapazität der Beads bei Versuchen in mit in PBS gelöstem PrPc oder PrPsc höher als bei vergleichbaren Versuchen mit Liquor. Bei der kapillarelektrophoretischen Analyse erwiesen sich alle mittels einfacher Probenauf-bereitung hergestellten Extrakte als ungeeignet. Sie führten entweder zu technischen Prob-lemen (Verstopfung der Kapillare; Durchbrennen) oder zu Interferenzen im Elektrophe-rogramm, die eine Auswertung nicht ermöglichten. Die Aufbereitung mittels HPLC ergab zwar verwendbare Präparationen, allerdings variierte die Retentionszeit von PrPsc derart stark, dass dieses Verfahren nicht weiter eingesetzt wurde. Bezüglich der Verwertbarkeit von CE-LIF wurden die besten Resultate mit Hilfe einer Aufreinigung nach Bio-Rad® mit an-schließender Festphasenextraktion erzielt. Während der Nachweis von PrPsc mittels CE-LIF aus Hirngewebe eindeutig gelang, führte die Untersuchung des Liquors eines bekannt BSE-positiven Tieres zu keinem eindeutigen Ergebnis. Prinzipiell ist die CE-LIF zum Nachweis von PrPsc geeignet. Allerdings handelt es sich dabei um ein sehr störanfälliges Verfahren. Die Sensitivität kann deutlich erhöht werden, wenn die Konzentration von PrPsc in kleine Volumina noch besser gelingt.

Seit etwa 20 Jahren wird in den Industrienationen ein kontinuierlicher Rückgang der Kariesprävalenz beobachtet. Die aktuelle Erwachsenengeneration, die von diesem Trend noch nicht profitieren konnte, weist dagegen umfangreiche zahnärztliche Restaurationen auf, die in der Regel eine begrenzte Lebensdauer haben. Dies dürfte eine Hauptursache dafür sein, daß zwischen 50 – 70 % der restaurativ-zahnärztlichen Tätigkeit dem Ersatz alter Füllungen dient. Beim Austausch einer Füllung vergrößert sich die Ausdehnung der Restauration. Größere Restaurationen haben im Vergleich zu kleineren Füllungen reduzierte Lebensdauer.Im Rahmen des Forschungsprojektes Forbiomat wurden an den Universitäten Regensburg und München grundlegende Erkenntnisse über die energetischen Oberflächeneigenschaften dentaler Füllungsmaterialien in vivo und in vitro gesammelt und deren Einfluß auf die Anlagerung von Plaque systematisch überprüft. Dazu wurden die experimentellen Materialien von der Firma 3M Espe mit verschiedene Zusaztsälze untersucht. Als Vergleich wurden auch die kommerziellen Materialien getestet. In beiden Gruppen wurde Empress Keramik als Referenzmaterial benutzt. Die Versuche zur Plaqueanlagerung wurden an einer Gruppe von Studenten der Universität München (Zahnerhaltung und Parodon-tologie) durchgeführt. Die Plaquemenge wurde planimetrisch bestimmt.

Yersinien sind auf Grund ihres spezifischen Typ III-Proteinsekretionssystems (TTSS) in der Lage, nach Anlagerung an Zellen bakterielle Virulenzproteine in das Innere der Wirtszelle zu translozieren. Dies führt zu einer Zellparalyse und bei Makrophagen zum Zelltod. Eines der translozierten Virulenzproteine ist YopP/J, das die Signalwege der mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) sowie des Transkriptionsfaktors NF-kB in der Wirtszelle inhibiert. Es wird angenommen, dass YopP/J zur Familie der Cystein-Proteasen zählt. Es zeigt Homologien zu AvrRXV/AvrBst von Xanthomonas campestris, welches eine dem apoptotischen Zelltod vergleichbare sogenannte „Hypersensitive Reaktion (HR)“ bei Pflanzen auslösen kann. Die Bakterien der enteropathogenen Spezies Yersinia enterocolitica, welche nach oraler Aufnahme im terminalen Ileum durch M-Zellen in die Lymphfollikel der Peyerschen Plagues wandern, werden anhand ihrer Oberflächen-(O)- und Geißel-(H)-Antigene in verschiedene Serotypen unterteilt. Unsere Studien haben gezeigt, dass sich einzelne Y. enterocolitica-Serotypen in der Apoptoseinduktion bei Makrophagen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde den Mechanismen der Apoptoseinduktion durch die verschiedenen Y. enterocolitica-Serotypen nachgegangen. Zunächst konnte YopP für die unterschiedlichen Apoptose-Effekte verantwortlich gemacht werden. Durch DNA-Austausch und der anschließenden Modifikation einzelner Aminosäuren zwischen YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O8 und Y. enterocolitica-Serotyp O9 konnte Arginin (R) an Position 143 als essentielle AS der Effektordomäne von YopPO8 definiert werden. YopP von Y. enterocolitica-Serotyp O9 und Y. enterocolitica-Serotyp O3 besitzt an dieser AS-Position Serin (S). YopPO8 vermittelt deutlich stärker Apoptose als YopPO9 und YopPO3. Der erhöhten Apoptoseinduktion durch YopPO8 geht eine effiziente Unterdrückung der NF-kB-Aktivierung vorraus. Die Inhibition des antiapoptotischen NF-kB-Signalwegs durch YopP scheint Voraussetzung für die Apoptoseinduktion durch Yersinia zu sein. Des weiteren wurde in dieser Arbeit mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems nach neuen unbekannten intrazellulären YopP-Interaktionspartner gesucht. Aus einer Maus-Milz-cDNA-Genbank konnten 22 potentielle YopP-Interaktionspartner isoliert werden. In in vitro-Bindungsstudien konnte bis zum jetzigen Zeitpunkt eine Interaktion von YopP mit vier Proteinen (PP2Ac, FWD2, eEf1bb, Smad1) bestätigt werden. Weiterführende Bindungs- und Funktionsanalysen werden noch durchgeführt. Die möglichen Auswirkungen dieser Interaktionen werden diskutiert. Die durchgeführten Studien erbrachten zudem Hinweise auf eine Modifikation von YopP in der Wirtszelle. Darüberhinaus konnte mit Hilfe des Hefe-2-Hybrid-Systems der Interaktionsbereich von YopP mit seinem Zielprotein IKKb eingeschränkt werden. Die durchgeführten Bindungsanalysen mit IKKb-Deletionsmutationen weisen auf eine Bindung von YopP an den IKKb-N-Terminus hin. Das Ergebniss wurde durch in vitro-Bindungsstudien bestätigt. Unter anderem scheint Alanin an IKKb-Position 120 die Interaktion mit YopP zu bestimmen. So konnten im Rahmen dieser Doktorarbeit unterschiedliche Aspekte der Wechselwirkung von Y. enterocolitica YopP mit der Wirtszelle und Wirtszellproteinen analysiert werden. Diese Studien tragen zum besseren Verständnis der Immunmodulation durch pathogene Bakterien bei.

Die Differentialdiagnose entzündlicher Hauterkrankungen setzt seitens des Dermatologen ein hohes Maß an klinischer Erfahrung voraus. Labortechnische und histologische Untersuchungsverfahren sind dabei nur eingeschränkt hilfreich. Ausgehend von der Annahme, dass erstens das atopische Ekzem ein krankheitsspezifisches Mikromilieu in der Epidermis und Dermis aufweist und dass sich zweitens dieses spezifische Mikromilieu im Phänotyp der immunkompetenten CD1a positiven epidermalen dendritischen Zellpopulation widerspiegelt, wurde seit 1995 ein Verfahren zur Immunphänotypisierung von Langerhans Zellen und IDEC entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass das atopische Ekzem durch eine hohe Expression des hochaffinen IgE-Rezeptors (FceRI) bei niedriger Expression des IgG-Rezeptors FcgRII auf den dentritischen Zellen der Epidermis hoch sensitiv und spezifisch von anderen Dermatosen abgegrenzt werden kann. Ziel der vorgelegten Arbeit war es, die standardisierte Phänotypisierung CD1a positiver epidermaler Zellen so zu erweitern, dass neben dem atopischen Ekzem auch die Diagnose anderer entzündlicher Hauterkrankungen möglich wird. Es wurden 296 Patienten mittels standardisierter Phänotypisierung epidermaler dendritischer Zellen untersucht. Bei 192 Patienten konnte nach Abschluss aller klinisch diagnostischen Untersuchungen eine eindeutige Diagnose gestellt werden, so dass die an diesen Patienten erhobenen Phänotypisierungsdaten für die Analyse krankheitsspezifischer Veränderungen im Oberflächenmarkerprofil von Langerhans Zellen und IDEC herangezogen wurden. Die Patienten verteilten sich auf 8 Gruppen: Normale Haut (n=31); Atopisches Ekzem (n=59); Psoriasis (n=41); Allergisches Kontaktekzem (n=23); Kontaktekzem bei atopischer Diathese (n=14); Lichen ruber (n=6); Mycosis fungoides (n=10) und Nummuläres Ekzem (n=8). Es konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil epidermaler dendritischer Zellen in Abhängigkeit von der Diagnose variiert und dass die bei allen entzündlichen Dermatosen nachweisbare Vermehrung epidermaler dendritischer Zellen vorrangig auf eine de novo Einwanderung von IDEC in die Epidermis zurückzuführen ist. Das wesentliche Ergebnis der vorgelegten Arbeit ist die Erweiterung der diagnostischen Phänotypisierung auf die Psoriasis und das allergische Kontaktekzem. So konnte die Psoriasis durch eine Ratio von CD64/CD11b auf IDEC sinnvoll abgegrenzt werden. Das Kontaktekzem war mittels einer Ratio aus E-Cadherin/CD86 auf Langerhans Zellen zu identifizieren. Die Gruppe der Patienten mit Kontaktekzem bei atopischer Diathese wurde durch die Ratio E-Cadherin/CD80 auf IDEC erkannt. Die bereits für das atopische Ekzem publizierte Ratio FcRI/CD32 auf allen CD1a positiven Zellen wurde mit der gleichen Ratio, ermittelt nur für IDEC, verglichen. Eine Verbesserung der Sensitivität und Spezifität für die Diagnosestellung des atopischen Ekzems konnte hierdurch nicht erreicht werden. Die starke Expression von FceRI auf LC und IDEC kennzeichnet das atopische Ekzem. Typisch für das atopische Ekzem ist weiterhin die Expression von CD36 auf LC und IDEC. Die Psoriasis ist durch eine besonders starke Expression der Fcg-Rezeptoren auf IDEC gekennzeichnet. Darüber hinaus findet sich eine erhöhte passive Anlagerung von sCD23 an IDEC bei Psoriasis. Gegenüber anderen Diagnosen ist die Expression von CD11b und CD11c auf IDEC vermindert. Für das Kontaktekzem ist die im Vergleich mit anderen entzündlichen Dermatosen niedrige CD49d Expression auf LC kennzeichnend. Die Einführung neuer diagnostischer Algorithmen in die Phänotypisierung epidermaler dendritischer Zellen konnte das diagnostische Spektrum dieser Methode deutlich erweitern. Neben atopischem Ekzem und normaler Haut wurden auch Algorithmen für die Psoriasis und das allergische Kontaktekzem beschrieben. Die systematische Analyse weiterer Dermatosen mit epidermaler Beteiligung dürfte auch für diese Erkrankungen diagnostische Algorithmen aufzeigen, die das Mikromilieu der entsprechenden Krankheiten widerspiegeln. Die Phänotypisierung epidermaler dendritischer Zellen dürfte insbesondere im Rahmen klinisch-therapeutischer Studien vermehrt zur Anwendung kommen, da mit dieser Methode eine objektive, quantitative Untersuchung einzelner behandelter oder unbehandelter Hautareale im zeitlichen Verlauf möglich ist.

Ziel der Arbeit war es, flexible kationische Lipidvesikel zu entwickeln, die für den transdermalen Transport von DNS geeignet ist. Um positiv geladene Lipidvesikel herzustellen, wurde in einem Ansatz SPC und CTAB verwendet, in einem anderen SPC, Polysorbat und DC-Chol. Nach der Herstellung dieser beiden Formulierungen fand eine in vitro und eine in vivo Untersuchung der beiden Trägersysteme sowie deren Wechselwirkung mit DNS statt. Dabei ergab sich, daß die DNS-Adsorption an die polysorbat-freien Vesikel grundlegend anders erfolgt als an die polysorbat-haltigen Vesikel. Die Flexibilität der beiden Formulierungen nahm durch die Beladung mit DNS deutlich ab, der Durchmesser der DNS-haltigen Vesikel im Vergleich zu den DNS-freien For-mulie-rungen zu. Beide Eigenschaften änderten sich bei den gewählten Formulierungen jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Grundsätzlich waren die polysorbathaltigen Formulierungen in der sich anschließenden in vitro Charakterisierung fähig, Zellen zu transfizieren, wenn auch nicht sehr effizient. Zur Überprüfung des in vivo Verhaltens der mit DNS beladenen Polysorbat-DC-Chol – Vesikel wurden die Vesikel schließlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, die DNS mit einem weiteren Farbstoff; die verwendete DNS codierte ebenfalls für einen Fluoreszenzfarbstoff. Die so markierten Formulierungen wurden NMRI – Mäusen intra- bzw. epicutan appliziert; einige Zeit später wurden Biopsien der behandelten Hautareale entnommen und mittels CLSM untersucht. Dabei waren DNS und kationische Vesikel bis in eine gewisse Hauttiefe nachweisbar, wobei sich unbeladene und mit DNS beladene Vesikel nicht signifikant in der Penetrationstiefe unterschieden. Eine Transfektion der Hautzellen wurde bislang jedoch nicht beobachtet. Zusammenfassend ist zu sagen, daß die Anwesenheit von Polysorbat in der Membran nicht nur für die Flexibilität der Vesikel zwingend notwendig ist, sondern v.a. für die Stabilität der Vesikel nach der Anlagerung von DNS. Da die Flexibilität des Trägersystems durch Anlagerung der DNS deutlich abnimmt, ist es für weitere Ansätze wohl notwendig, den unbeladenen Vesikel eine extrem hohe Flexibilität zu verleihen, um selbst nach der Bindung der DNS an diese Träger noch eine ausreichende Flexibilität für die Permeation durch die Haut zu erhalten.

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen Transkriptionsrepressor, welcher stabil an das TATA-Box bindende Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung von NC2 an TBP inhibiert die weitere Anlagerung der generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes. NC2 besteht aus zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den Histonen H2A bzw. H2B aufweisen. Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro erhalten wurden. Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als Modellorganismus wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog zum menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative Wachstum von Hefe. Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden Hefestämme konstruiert, bei denen die chromosomalen Gene für NC2a und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid ersetzt wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in Anwesenheit von 5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene als episomale Kopien in Hefe stabil einzubringen. So zeigte sich unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten, sowohl einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als auch gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig waren, die physiologische Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu übernehmen. Das gleiche System wurde auch eingesetzt, um Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es wurde festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen, welche für die in vivo-Funktion notwendig sind, die vom Mensch zur Hefe konservierten Regionen enthalten. Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer limitierenden NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine Punktmutation in der großen Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA, welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von Valin zu Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation in Toa1 (mt- Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp auf und sind trotz fehlender NC2-Gene lebensfähig. Die biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der Suppressor-Mutante wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und in vitro Transkriptionsexperimente untersucht. Das Protein mt-Toa1 war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der kleinen Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die TATA-Box auf dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist. Hinweise darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall von mtyTFIIA in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden Bedingungen. Das mt-yTFIIA verlor zugleich seine Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der Suppressor-Mutante von NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß die Genregulation in vivo eine präzise Balance zwischen positiv und negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen sie die in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht zwischen TFIIA und NC2 in der Kompetition um das TATA-bindende Protein TBP. Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo und in vitro. Innerhalb des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der Hefezelle vollständig verloren haben. Es konnten Mutanten identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit dem Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung dieser Mutanten lieferte erste Hinweise auf funktionelle Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung (NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind. Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die NC2-Funktion in der Zelle und erweitert unser Verständnis über den molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation während der Initiation der Klasse II-Transkription.