Podcasts about gapdh

BUFFALO, NY — February 26, 2025 — A new #research paper was #published in Aging (Aging-US) on January 27, 2025, in Volume 17, Issue 1, titled “Age-invariant genes: multi-tissue identification and characterization of murine reference genes.” Aging is a process driven by changes in gene activity, but researchers from Yale University School of Medicine and Altos Labs, led by first author John T. González and corresponding author Albert T. Higgins-Chen, have identified a set of genes that remain unchanged throughout the aging process. This discovery could improve the accuracy of aging research and provide insights into why some genes stay unchanged while others decline. “Reference genes have mostly been identified and validated in young organisms, and no systematic investigation has been done across the lifespan.” The study looked at gene activity in 17 different tissues in mice, from 1 month old to over 21 months old. Scientists used advanced bioinformatic analysis methods to analyze RNA sequencing data. They found nine genes that stayed the same across all tissues, as well as other genes that remained stable in specific tissues. These genes are usually shorter and have special DNA regions called CpG islands, which may help cells stay healthy and resist aging. Their stability throughout aging was confirmed by analyzing different datasets and using RT-qPCR. One of the most significant findings is that these stable genes are linked to essential cellular functions, such as mitochondrial activity and protein maintenance. This challenges the common belief that all aspects of aging involve gene dysregulation. Instead, the findings suggest that some cellular processes may naturally resist aging, leading the way for new research on longevity and potential anti-aging therapies. “Biological processes that change with age and those that resist age-related dysregulation are two sides of the same coin, and both will need to be investigated to fully understand aging.” Another key finding is that commonly used reference genes, such as GAPDH and ACTB, fluctuate with age, making them unreliable for aging studies. No single classical reference gene was found to be stable across all tissues. Researchers often use these reference genes as a control to measure gene activity, but if their expression changes over time, it can lead to inaccurate results. By identifying new, stable reference genes, this study provides scientists with better tools for studying aging-related diseases, regenerative medicine, and longevity science. Understanding how certain genes remain unchanged throughout life suggests that they may play a protective role in aging and could potentially be used to develop treatments that slow down age-related decline. While further research is needed, this discovery sets a new standard for measuring gene activity in aging studies and could have a significant impact on aging research and medicine. DOI - https://doi.org/10.18632/aging.206192 Corresponding author - Albert T. Higgins-Chen - a.higginschen@yale.edu About Aging-US The mission of the journal is to understand the mechanisms surrounding aging and age-related diseases, including cancer as the main cause of death in the modern aged population. The journal aims to promote 1) treatment of age-related diseases by slowing down aging, 2) validation of anti-aging drugs by treating age-related diseases, and 3) prevention of cancer by inhibiting aging. (Cancer and COVID-19 are age-related diseases.) Please visit our website at https://www.Aging-US.com​​ and connect with us: Facebook - https://www.facebook.com/AgingUS/ X - https://twitter.com/AgingJrnl Instagram - https://www.instagram.com/agingjrnl/ YouTube - https://www.youtube.com/@AgingJournal LinkedIn - https://www.linkedin.com/company/aging/ Pinterest - https://www.pinterest.com/AgingUS/ Spotify - https://open.spotify.com/show/1X4HQQgegjReaf6Mozn6Mc Media Contact 18009220957 MEDIA@IMPACTJOURNALS.COM

TWiV discusses WHO declaration of Mpox as a public health emergency of international concern, Sweden reports first case of clade 1b outside of Africa, can household pets be productively infected with monkeypox virus, widespread exposure to SARS-CoV-2 in wildlife communities, and modulation of plant defenses by insect salivary GAPDH benefits viral transmission. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Alan Dove, Rich Condit, and Kathy Spindler Subscribe (free): Apple Podcasts, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode MicrobeTV Discord Server Mpox outbreak is PHEIC (WHO) Tecovirimat not great against monkeypox virus clade I (NIH) Case of Mpox Clade I in Sweden (PHAS) Mpox and pets in USA (Emerg Inf Dis) SARS-CoV-2 widespread in wildlife communities (Nat Comm) Salivary GAPDH benefits plant virus transmission (Nat Comm) Letters read on TWiV 1143 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Dickson – NASA Confirms Evidence That Liquid Water Flows on Today's Mars Kathy – TBP for PCR internal control Rich –  xmACIS2 compares the data in the ACIS database to that in GHCN-Daily Alan – Larry, the world's most highly cited cat Vincent – The Viral Paleontologist Who Unearths Pathogens' Deep Histories Listener Pick Ryan – Mpox emergencies AP News one and two Rona – Up in smoke David – Ode to Joy (YouTube, TikTok) Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv Content in this podcast should not be construed as medical advice.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.30.522347v1?rss=1 Authors: Biswas, P., Stuehr, D. J. Abstract: Indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO1) and Tryptophan-2, 3-dioxygenase (TDO) catalyze the conversion of L-tryptophan to N-formyl-kynurenine and thus play primary roles in metabolism, inflammation, and tumor immune surveillance. Because their activities depend on their heme contents which range from 30-60% heme-saturated in biological settings and go up or down in a dynamic manner, we studied how their heme levels may be impacted by nitric oxide (NO) in mammalian cells. We utilized cells expressing TDO or IDO1 either naturally or via transfection and determined their activities, heme contents, and expression levels as a function of NO exposure. We found NO has a bimodal effect: A narrow range of very low NO exposure promoted cells to allocate heme into TDO and IDO1 and boosted their activities several fold, while beyond this range the NO exposure transitioned to have a negative impact on their heme contents and activities. NO did not alter dioxygenase protein expression levels and its bimodal impact was observed when NO was released by a chemical donor or was generated naturally by immune-stimulated macrophage cells. NO-driven heme allocations to IDO1 and TDO required participation of a GAPDH-heme complex and for IDO1 required chaperone Hsp90 activity. Thus, cells can up- or down-regulate their IDO1 and TDO activities through a bimodal control of heme allocation by NO. This mechanism has important biomedical implications and helps explain why the IDO1 and TDO activities in animals go up and down in response to immune stimulation. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

A 2015 study published in the journal Science found that high doses of vitamin C impaired growth of colon cancer tumors that have previously resisted other treatments. Listen in this week as Dee discusses the findings of the study, and what this means for the future of treatment for many other types of cancer.References:Monti, D. A., Mitchell, E., Bazzan, A. J., Littman, S., Zabrecky, G., Yeo, C. J., Pillai, M. V., Newberg, A. B., Deshmukh, S., & Levine, M. (2012). Phase I evaluation of intravenous ascorbic acid in combination with gemcitabine and erlotinib in patients with metastatic pancreatic cancer. PLoS ONE, 7(1). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029794Yun, J., Mullarky, E., Lu, C., Bosch, K. N., Kavalier, A., Rivera, K., Roper, J., Chio, I. I., Giannopoulou, E. G., Rago, C., Muley, A., Asara, J. M., Paik, J., Elemento, O., Chen, Z., Pappin, D. J., Dow, L. E., Papadopoulos, N., Gross, S. S., & Cantley, L. C. (2015). Vitamin C selectively kills KRAS and BRAF mutant colorectal cancer cells by targeting GAPDH. Science, 350(6266), 1391–1396. https://doi.org/10.1126/science.aaa5004Nature Works Best Cancer Clinic in Tempe, AZ: https://natureworksbest.com/

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.08.31.505712v1?rss=1 Authors: Godfrey, W. H., Hwang, S., Gharibani, P., Abramson, E., Kornberg, M. D. Abstract: Multiple sclerosis (MS) is a neuroinflammatory disease of the central nervous system (CNS). Although classically considered a demyelinating disease, neuroaxonal injury occurs in both the acute and chronic phases and represents a pathologic substrate of disability not targeted by current therapies. Nitric oxide (NO) generated by CNS macrophages and microglia contributes to neuroaxonal injury in all phases of MS, but candidate therapies that prevent NO-mediated injury have not been identified. Here, we demonstrate that the multifunctional protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is robustly nitrosylated in the CNS in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse model of MS. GAPDH nitrosylation is blocked in vivo with daily administration of CGP3466b, a CNS-penetrant compound with an established safety profile in humans. Consistent with the known role of nitrosylated GAPDH (SNO-GAPDH) in neuronal cell death, blockade of SNO-GAPDH with CGP3466b attenuates neurologic disability and reduces axonal injury in EAE independent of effects on the immune system. Our findings suggest that SNO-GAPDH contributes to neuroaxonal injury during neuroinflammation and identify CGP3466b as a candidate neuroprotective therapy in MS. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by PaperPlayer

Question: Cataracts: what are the roles of methylglyoxal and polyols?Is the polyol pathway activation and methylglyoxal independent causes of cataract formation or are they related to one another? And the answer is a little bit of both. You know, if independent means unrelated, then they’re related. Not independent. But they are independent in the sense that you could have more of one. You know, you could do something that increases one and not the other or at least disproportionately increases one versus the other. So, the polyol pathway, I think the best way to describe that is under conditions of severe hyperglycemia where you have too much sugar to be disposed of in the normal routes. You can use the sugar to synthesize polyols. Glutathione is needed, among other things, to detoxify methylglyoxal. And methylglyoxal causes cataracts. Now, that's not to say that there aren’t other things going on. I mean, certainly glutathione is also needed to defend against oxidative stress. But then again, this might not be the only way that oxidative stress contributes to cataracts, but oxidative stress increases methylglyoxal generation in part by decreasing the activity of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase or GAPDH, which is the enzyme within glycolysis that is responsible for clearing what are known as triose phosphates. If you would like to be part of the next live Ask Me Anything About Nutrition, sign up for the CMJ Masterpass, which includes access to these live Zoom sessions, a private discussion group, premium features on all my content, and hundreds of dollars of exclusive discounts. You can sign up at https://chrismasterjohnphd.com/masterpass/ and use the code QANDA to get 10% off the membership for life.  For the remainder of 2020, I will be working full-time on finishing my Vitamins and Minerals 101 book, while reserving a portion of my time for consulting clients. You can pre-order my book at https://chrismasterjohnphd.com/book. You can sign up for a consultation at https://chrismasterjohnphd.com/consultations  DISCLAIMER: I have a PhD in Nutritional Sciences and my expertise is in performing and evaluating nutritional research. I am not a medical doctor and nothing herein is medical advice.

DNA microscopy法という分子や細胞の位置を、分子間の近接情報のみから再構成することができる新しい方法論について、原著論文とその周辺技術を中心に詳しく話しました。Show notes DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction…bioRixv (Open Acess) 論文のPDFが入手できます。 DNA Microscopy論文のFigure 1…PodcastではほぼFigure1の説明に終始しているので、これを見ながら…だと理解の助けになるのかもしれない… DNA Microscopy: Optics-free Spatio-genetic Imaging by a Stand-Alone Chemical Reaction…Cell Press. Joshua Weinsteinのセミナー動画 (YouTube)…1st author Joshua Weinsteinが論文には書かれていない背景なども含めてDNA microscopyについてBroad研で発表した動画。 dnamic (GitHub)…DNA microscopyのデータ解析に使われたpythonのコード In-gel PCR…Four-arm PEG acrylateとHS-PEG-SHというポリエチレングリコール (PEG)をPCR反応液に追加することにより、高温下でも分子の拡散を抑えることができる。この液体の中で、Overlap extension PCRが起き、それぞれのUMIは新しいタグを持ちながら増幅され、近接する2つのUMIを持つ分子同士はUEIを受け取りつつ連結される。 Overlapping extension PCR Virtual microfluidics for digital quantification and single-cell sequencing. Nature Methods 2016…In-gel PCRの元論文。 In situ cDNA synthesis…固定した細胞に対しても逆転写酵素とプライマーなどを用いてcDNA合成を行うことができる。これを利用することで、細胞内でRNA分子の配列をその場でシーケンシングすることがIn situ RNA sequencing (FISSEQ法)で可能になった。 Fluorescent In Situ Sequencing (FISSEQ) Illumina sequencing…一塩基ごとに蛍光標識されたdyeを用いた伸長反応により大量のDNA配列を決定する。こちらのYoutubeの動画が原理を知るにはわかりやすい。 A Theory of Network Localization A remark on global positioning from local distances… Locally rigid embeddingのオリジナル論文。 ブラウン運動…何故、あるUMIを持つDNAが溶液中を移動して、異なるUMIを持つDNAと出会い、Overlap extension PCRを介して、新たなUEIを形成することができるのか。DNA microsocpyで明らかにしようとしている空間サイズでは、PCRに用いられるような高温にしてしまうと、一瞬でDNA群は均一に混じり合ってしまうことが予想されるが、粘度が高いゲル中でPCR反応を行うことにより、DNA分子の拡散を抑えることができる。これにより、UMI diffusion cloudsが形成される。 距離空間 (Wikipedia) 正規分布 (Wikipedia) Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Lieberman-Aiden et al. Science, 2009…Hi-C法のオリジナル論文。この論文を起点として、核内における染色体高次構造、クロマチン構造解析が爆発的に進むようになった。この方法も光学系ではなく、シーケンシングによってクロマチン構造を明らかにしようというコンセプトからなる。DNA配列同士の”Contact Probability”を中心にしている。 光学顕微鏡の解像度の限界:回折限界…蛍光顕微鏡を用いる際の回折限界は、波長の大きさとレンズの開口数によって計算することができる。 超解像顕微鏡法…2014年に超解像顕微鏡法がノーベル賞を受賞したときに書かれた阪大永井先生の総説。超解像顕微鏡法とは回折限界以下で行うことができる蛍光イメージングのことを指す。PALM, STORM, STED, SIMなど様々な方法が現在用いられている。 ハウスキーピング遺伝子…どの細胞においても定常的に多量発現している遺伝子のこと。GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-アクチンなどが含まれる。DNA microscopy法でもbeaconとしてACTBやGAPDHが用いられた。 V(D)J recombination (Wikipedia)…B細胞やT細胞ではランダムな遺伝子群の組み換え反応 (recombination)により、ウィルスやがん細胞など多様な抗原に作用する抗体が作り出される。 smFISH…蛍光標識した蛍光プローブを用いることで一分子のRNAの位置を調べることができる。 MS2 tagging (Wikipedia)…MS2 RNAとそれに結合するMCPタンパク質を組み合わせることで生細胞で特定のRNAを可視化することができる。 CLARITY (Wikipedia)…厚みのある組織の透明化技術の一つ。 DNA Microscopyのsohによるメモ Editorial notes Cell誌のTheoryセクションということもあり、日本ではほとんど報道もなく紹介記事も見当たらない中、このDNA microscopyという画期的なコンセプトが伝わればいいと思いますが果たして…(soh) カンゼンニリカイシタ (coela) トリッキーな内容と論文の文体から、とてもスマートに感じるDNA microscopyであるが、内容を理解していくにつれて、案外膨大な試行の先にたどり着いた泥臭い方法論なのではないかと思うようになった。枯れたテクノロジーをできるだけ使いたい保守派研究者としては、DNA microscopyに対して思うことはたくさんある。しかし、そのモヤモヤは一度横に置き、自分の研究にどのように応用できるか、そしてこれからのどのように発展するか、その行き先を見つめていきたい (tadasu)

It is widely known that cells from epithelial tumors, e.g., breast cancer, detach from their primary tissue and enter blood circulation. We show that the presence of circulating tumor cells (CTCs) in samples of patients with primary and metastatic breast cancer can be detected with an array of selected tumor-marker-genes by reverse transcription real-time PCR. The focus of the presented work is on detecting differences in gene expression between healthy individuals and adjuvant and metastatic breast cancer patients, not an accurate quantification of these differences. Therefore, total RNA was isolated from blood samples of healthy donors and patients with primary or metastatic breast cancer after enrichment of mononuclear cells by density gradient centrifugation. After reverse transcription real-time PCR was carried out with a set of marker genes (BCSP, CK8, Her2, MGL, CK18, CK19). B2M and GAPDH were used as reference genes. Blood samples from patients with metastatic disease revealed increased cytokine gene levels in comparison to normal blood samples. Detection of a single gene was not sufficient to detect CTCs by reverse transcription real-time PCR. Markers used here were selected based on a recent study detecting cancer cells on different protein levels. The combination of such a marker array leads to higher and more specific discovery rates, predominantly in metastatic patients. Identification of CTCs by PCR methods may lead to better diagnosis and prognosis and could help to choose an adequate therapy.

It is widely known that cells from epithelial tumors, e. g., breast cancer, detach from their primary tissue and enter blood circulation. We show that the presence of circulating tumor cells (CTCs) in samples of patients with primary and metastatic breast cancer can be detected with an array of selected tumor-marker-genes by reverse transcription real-time PCR. The focus of the presented work is on detecting differences in gene expression between healthy individuals and adjuvant and metastatic breast cancer patients, not an accurate quantification of these differences. Therefore, total RNA was isolated from blood samples of healthy donors and patients with primary or metastatic breast cancer after enrichment of mononuclear cells by density gradient centrifugation. After reverse transcription real-time PCR was carried out with a set of marker genes (BCSP, CK8, Her2, MGL, CK18, CK19). B2M and GAPDH were used as reference genes. Blood samples from patients with metastatic disease revealed increased cytokine gene levels in comparison to normal blood samples. Detection of a single gene was not sufficient to detect CTCs by reverse transcription real-time PCR. Markers used here were selected based on a recent study detecting cancer cells on different protein levels. The combination of such a marker array leads to higher and more specific discovery rates, predominantly in metastatic patients. Identification of CTCs by PCR methods may lead to better diagnosis and prognosis and could help to choose an adequate therapy.

Das Mantelzelllymphom (MCL) ist eine neoplastische Erkrankung des blutbildenden Systems, die durch die ektopische Expression des Zellzyklus-regulierenden Proteins Cyclin D1 charakterisiert ist und im Regelfall durch eine chromosomale Translokation t(11;14)(q13;q32) ausgelöst wird. Trotz stetiger Verbesserungen der Behandlungsmethoden, insbesondere der Optimierung der Kombinationstherapie und dem Einsatz der Anti-CD20-Antikörpertherapie- konnte bislang jedoch keine wesentliche Verbesserung des Gesamtüberlebens erzielt werden. Die Untersuchung der Wirksamkeit und der Wirkmechanismen neuer, molekular ausgerichteter Therapieformen hat daher bei dieser Erkrankung besonders große Bedeutung. Zu diesem Zweck wurde ein 2D-PAGE-basiertes Verfahren zur Analyse der zellulären Proteinspiegel etabliert und durch die Charakterisierung der Unterschiede zwischen zwei Non-Hodgkin-Lymphom (NHL)-Subtypen (MCL und FL) auf Proteomebene validiert. Im Verlauf dieser Tests wurde darüber hinaus die Aussagekraft der 2D-PAGE-Analyse durch die Verwendung von „Proben-Pools“ verbessert, wodurch die Detektion zufallsbedingter molekularer „Bystander“-Aberrationen unterdrückt und ein repräsentativer molekularer Phänotyp charakterisiert werden konnte. Die Zahl solcher unspezifischen Proteinpunkte, die nur in einzelnen Zelllinien des Probenkollektivs nachgewiesen wurden, konnten in den „Proben-Pools“ um >66% gesenkt werden. Im Vergleich der zellulären Proteinspiegel der beiden NHL-Subtypen wiesen 175 von insgesamt 1350 Punkte auf den 2D-PAGE-Gelen Subtyp-spezifisch unterschiedliche Proteinspiegel auf, von denen 38 Punkte durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert wurden. Die identifizierten Kandidatenproteine können grob 7 funktionellen Gruppen (Apoptose / Zelltod, Reparaturmechanismen, Zellzyklus und Proliferation, Regulation der Transkription, grundlegende zelluläre Funktionen, Tumor-Antigene, unbekannte Proteinfunktion / hypothetische Proteine)zugeordnet werden und interagieren vorwiegend in einem Netzwerk um den Tumorsuppressor p53. Das Verfahren der 2D-PAGE-Analyse mit massenspektrometrischer (MS) Proteinidentifizierung wurde anschließend benutzt, um die molekulare Wirkung des Proteasomen-Inhibitors Bortezomib auf MCL (Zelllinien und primäre Patientenzellen) zu analysieren. Dazu wurden 5 MCL-Zelllinien (Granta519, HBL-2, Jeko-1, NCEB-1 und Rec-1) einer Bortezomib-Konzentration von 25nM ausgesetzt und die Veränderungen der zellulären Proteinspiegel nach 1h und 4h mit denen von unbehandelten Zellen verglichen. In dieser Analyse waren die Proteinspiegel von 148 der insgesamt 1013 in allen MCL-Zelllinien nachweisbaren Proteinpunkten nach Bortezomib signifikant verändert. Durch MS konnten 38 der 41 reproduzierbar nachweisbaren Proteinpunkte identifiziert werden, wobei 20 ausschließlich in Bortezomib-sensitiven Zelllinien veränderte Spiegel aufwiesen. Eine Western Blot-Analyse von 17 der 38 identifizierten Proteine bestätigte in 76% die in 2D-PAGE-Gelen beobachteten Veränderungen der Proteinspiegel. Alle Zelllinien zeigten veränderte Spiegel von verschiedenen Hitzeschockproteinen (HSPA9, HSP7C, HSPA5, HSPD1), während Zelllinien die auf eine Behandlung mit Bortezomib ansprachen, auch veränderte Proteinspiegel bei Parametern des Energiestoff-wechsels (ATP5B, AK5, TPI1, ENO2, ENO3, ALDOC, GAPDH), der RNA- und Transkriptionsregulation (HNRPL, SFRS12) und der Zellteilung (NEBL, ACTB, SMC1A, C20orf23) sowie der Tumorsuppressoren ENO-1 und FH aufwiesen. Diese Proteine konnten in einem engen Interaktionsnetzwerk um das wichtige zelluläre „Checkpoint“-Molekül p53 gruppiert werden. Entsprechend konnten diese Ergebnisse in primären MCL-Patientenproben bestätigt werden, was die Rolle dieser Proteine im Rahmen der Proteasomeninhibition beim MCL unterstreicht.

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist charakterisiert durch die Dilatation und beeinträchtigte Kontraktilität des linken oder beider Ventrikel. Sie ist eine der häufigsten Ursachen für ein schweres Herzversagen beim Hund. Häufig von der Erkrankung betroffene Rassen sind Dobermänner, Doggen, Bernhardiner und Irische Wolfshunde. Nur 37% der erkrankten Hunde überleben ein Jahr nach der Diagnosestellung. In vielen Fällen ist die Ätiologie der Erkrankung nicht geklärt. Bei einem Teil der DCM-Fälle scheint es sich um Autoimmunerkrankungen zu handeln. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die humorale Immunantwort von caninen DCM-Patienten mit Hilfe von zweidimensionalen Western Blots auf potenzielle Autoantigene zu untersuchen und diese mittels Massenspektrometrie zu identifizieren. Mit zweidimensionaler Gelelektrophorese ist es möglich, ein Gewebe in mehre tausend Proteine aufzutrennen und somit Reaktivitäten einzelnen Antigenen zuordnen zu können. Die humorale Immunreaktion von 78 DCM-Patienten und 62 herzgesunden Kontrolltieren wurde im Western Blot getestet und miteinander verglichen. Die Ergebnisse der zweidimensionalen Western Blots wurden dem Proteinmuster der eingesetzten Herzpräparationen (linkes und rechtes Atrium, linker und rechter Ventrikel) zugeordnet und die Reaktivitäten der DCM erkrankten Tiere mit herzgesunden Kontrolltieren wurden miteinander verglichen. Mit dieser Methode konnten sieben potenzielle DCM-Autoantigene ermittelt werden, die im Anschluß mittels Massenspektrometrie eindeutig identifiziert werden konnten. Dabei handelte es sich um die schwere Kette des Herzmyosins, eine regulatorische leichte Kette des Herzmyosins (MYL4), Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), die Gehirnform der Glycogen Phosphorylase (GPBB), cardiac Actin, Aconitase und Desmin. Die Reaktion gegen sechs dieser Proteine wurde anschließend in eindimensionalen Western Blots mit den gereinigten Proteinen validiert. Nur für MYL4 stehen diese Untersuchungen noch aus. Bei der schweren Kette des Herzmyosins, GAPDH, GPBB, cardiac Actin und Aconitase wiesen die DCM-Hunde signifikant häufiger Autoantikörper auf als die Kontrolltiere. Bei einem großen Teil der DCM-Hunde ergaben sich damit Hinweise auf Autoimmunreaktionen. In dieser Studie konnten erstmals sechs potenzielle Autoantigene für die canine DCM identifiziert werden. Vier dieser Autoantigene sind auch potenzielle neue Autoantigene für die DCM des Menschen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden mögliche molekulare Wirkmechanismen pharmakologischer und ischämischer Präkonditionierung zur Prävention des Ischämie-Reperfusionsschadens (IRS) am Modell der Rattenleber untersucht. Im Mittelpunkt stand dabei der Einfluss dieser Therapieansätze auf das Eisenregulierende Protein IRP-1 (Iron regulatory protein-1) und das zytoprotektiv wirkende Eisenspeicherprotein Ferritin sowie auf die Aktivität von Matrix Metalloproteinasen, die vor allem an der Ablösung der sinusoidalen Endothelzellen von der sie umgebenden Matrix beteiligt sind. Außerdem wurde die Rolle von Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), einem Schlüsselenzym der Glykolyse, beim IRS genauer betrachtet. Hormonelle Präkonditionierung mit dem Atrialen Natriuretischen Peptid (ANP) verringerte die RNA-Bindungsaktivität von IRP-1. Dieser Effekt wird wahrscheinlich über cGMP vermittelt und ist unabhängig von einer Hämoxygenase-1 Induktion. Die Regulation der RNA-Bindungsaktivität erfolgt nicht über eine Veränderung des Phosphorylierungsstatus von IRP-1, sondern wird vermutlich über ROS vermittelt, die möglicherweise von Kupfferzellen gebildet werden. ANP war außerdem in der Lage, die Ferritinexpression zu induzieren. Dies ist wahrscheinlich eine Folge der verminderten IRP-1 Bindungsaktivität und einer daraus resultierenden Erhöhung der Ferritintranslation. Die Aktivität von Matrix Metalloproteinasen wird durch Präkonditionierung mit ANP nicht beeinflusst. Bei den Untersuchungen zu GAPDH wiesen zwei der verwendeten Methoden zur mRNA-Quantifizierung auf eine Reduktion der GAPDH mRNA-Expression durch ANP hin und lassen eine neuartige Rolle von GAPDH beim IRS vermuten, z.B. eine Beteiligung an der Auslösung von Apoptose. Da die Reduktion der GAPDH mRNA-Menge sich in einer Größenordnung von ca. 40% bewegte und es bisher keine Methode der mRNA-Quantifizierung gibt, die diese relativ geringen Unterschiede zuverlässig und reproduzierbar detektieren kann, konnten wir aufgrund methodischer Grenzen keine eindeutige Aussage bezüglich einer Reduktion der GAPDH mRNA-Expression durch ANP treffen. Die GAPDH Proteinmenge blieb unverändert. Präkonditionierung mit α-Liponsäure führte ebenfalls zu einer Reduktion der IRP-1 Bindungsaktivität. Folglich liegt IRP-1 wahrscheinlich überwiegend als zytosolische Aconitase vor und könnte aufgrund der hohen Homologie zur mitochondrialen Aconitase an einer vermehrten Umsetzung von Citrat im Citratzyklus beteiligt sein. Dies ist vermutlich ein Hinweis darauf, wie α-Liponsäure den ATP-Gehalt in den Zellen erhöhen und so die Energiebereitstellung in der Leber verbessern kann. Auf die Ferritinexpression hatte die Präkonditionierung mit α-Liponsäure keinen Einfluss. Ischämische Präkonditionierung hatte eine deutliche Induktion der Ferritinexpression zur Folge, was zum Schutz vor IRS erheblich beitragen könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen neue Hinweise zum molekularen Wirkmechanismus verschiedener Therapieansätze zum Schutz vor IRS geben. Diese Kenntnisse sind eine wichtige Voraussetzung für deren sinnvolle und rationale Anwendung in der Klinik.

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch außerhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schließen, dass dort ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebeständigen PPK bzw. PK spezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK aufzuklären, sollte in dieser Arbeit zunächst mittels einer quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der übrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen für eine ubiquitäre, aber teils sehr unterschiedliche Expression der PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man außerhalb der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, während FXII-mRNA nahezu ausschließlich in der Leber synthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe am stärksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was für eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei Entzündungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilität der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abhängt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den Zellen durch ständige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewährleisten. Mittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. Während in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei am 5´-Ende verkürzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten und dadurch eine intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse für die Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein Initiator-Element assoziiert ist. Außerdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufwärts von Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazität. Durch die Generierung von neun Verkürzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die P-1729 Region neben ubiquitär exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazität besitzt. Ebenso zeigt aber auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivität. Somit können innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der PPK-Transkription ermöglicht wird.

Chloroplast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is composed of two different subunits, GapA and GapB. cDNA clones containing the entire coding sequences of the cytosolic precursors for GapA from pea and for GapB from pea and spinach have been identified, sequenced and the derived amino acid sequences have been compared to the corresponding sequences from tobacco, maize and mustard. These comparisons show that GapB differs from GapA in about 20% of its amino acid residues and by the presence of a flexible and negatively charged C-terminal extension, possibly responsible for the observed association of the enzyme with chloroplast envelopes in vitro. This C-terminal extension (29 or 30 residues) may be susceptible to proteolytic cleavage thereby leading to a conversion of chloroplast GAPDH isoenzyme I into isoenzyme II. Evolutionary rate comparisons at the amino acid sequence level show that chloroplast GapA and GapB evolve roughly two-fold slower than their cytosolic counterpart GapC. GapA and GapB transit peptides evolve about 10 times faster than the corresponding mature subunits. They are relatively long (68 and 83 residues for pea GapA and spinach GapB respectively) and share a similar amino acid framework with other chloroplast transit peptides.