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In einer Studie bewertet die OECD die Chancengleichheit im deutschen Bildungssektor sehr kritisch. Dieser Befund komme für die politisch Verantwortlichen nicht überraschend und müsse Konsequenzen haben, kommentiert Armin Himmelrath.Ein Kommentar von Armin HimmelrathDirekter Link zur Audiodatei

Eine angemessene Aufarbeitung der destruktiven Corona-Politik wird es vermutlich nicht geben: Fast alle einflussreichen gesellschaftlichen Gruppen haben sie entweder aktiv gestützt oder sich weggeduckt. Mit einer schonungslosen Bilanz würden sie sich also selber belasten. Dieser Befund ist fatal, weil dadurch einer Wiederholung wider besseres Wissen nichts im Wege steht. Von Tobias Riegel. Dieser Beitrag istWeiterlesen

Das Geschehen rund um Nawalny, Nowitschok und Nord Stream 2 gleicht einem Verwirrspiel. Nicht Aufklärung ist das Ziel, sondern Vorverurteilung eines „Systemgegners“. Der Umgang mit diesem Komplex offenbart eine beklemmende Orientierungslosigkeit und Beliebigkeit deutscher Politik. Dieser Befund gilt nicht nur für die Regierungskoalition, sondern auch für einen Großteil der parlamentarischen Opposition. Dieser Beitrag ist auchWeiterlesen

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

Morbus Alzheimer ist die häufigste Form einer Demenzerkrankung und stellt aufgrund der steigenden Lebenserwartung eine sehr große ökonomische und emotionale Belastung für Patienten, deren Familien und die gesamte Gesellschaft dar. Eine Verringerung dieser Belastung erfordert dringend krankheitsmodifizierende Therapien, die bisher nicht zur Verfügung stehen. Als wahrscheinlichste Erklärung für die molekularen Ursachen der Krankheit wurde in der Amyloid-Kaskaden-Hypothese postuliert, dass die Akkumulation und Aggregation des Abeta-Peptids das zentrale Ereignis darstellt. Infolgedessen kommt es zu synaptischen Beeinträchtigungen durch Abeta-Oligomere, Entzündungsreaktionen durch unlösliche Abeta-Aggregate in Form von amyloiden Plaques, progressiven Schädigungen von Synapsen und Neuronen, oxidativem Stress, der Hyperphosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau und einem Neuronenverlust. Das Abeta-Peptid wird durch sequentielle Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch die beta- und gamma-Sekretase konstitutiv im Gehirn produziert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der Überexpression eines humanen APP mit der schwedischen Mutation auf Synapsen und die Akkumulationskinetik des Abeta-Peptids zu amyloiden Plaques in einem Alzheimer-Mausmodell (Tg2576) untersucht. Die detaillierte Charakterisierung des Mausmodells wurde in einer Therapiestudie umgesetzt, in der eine passive Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere getestet wurde. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Überexpression des APP auf dendritische Spines untersucht, die das postsynaptische Kompartiment glutamaterger Synapsen entlang von Dendriten bilden. Als Reporter-Tiere wurden Mäuse verwendet, die das gelbfluoreszierende Protein YFP in einem Teil der pyramidalen Neuronen des Cortex exprimieren. Mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie wurden die denritischen Spines an den apikalen Dendriten der Schicht II/III und V Neurone im somatosensorischen Cortex analysiert. Die Überexpression des APP führte zu einem differentiellen Effekt, wobei in Schicht II/III Neuronen keine Änderung und in Schicht V Neuronen eine Erhöhung der Dichte dendritischer Spines gemessen wurde. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte eine Mehrzahl an stabilen Spines als ursächlich für die erhöhte Spinedichte, während keine zeitliche Änderung der Spinedichte über sechs Wochen detektiert wurde. Auch die Morphologie der dendritischen Spines war unverändert. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche physiologische Rolle von APP und/oder dessen proteolytische Fragmente an Synapsen. Ein wichtiges neuropathologisches Merkmal von Morbus Alzheimer sind amyloide Plaques, die durch Aggregation des Abeta-Peptids zu Amyloidfibrillen mit einer gekreuzten beta-Faltblattstruktur entstehen. Demzufolge wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie, unter der wiederholten Anwendung des spezifischen fluoreszenten Markers Methoxy-X04, die Entstehungs- und Aggregationskinetik amyloider Plaques untersucht. Eine quantitative Auswertung von Plaquegrößen, -wachstumsraten und -dichten in zwei Altersgruppen der frühen und späten amyloiden Pathologie führte zur bisher detailliertesten in vivo Charakterisierung in einem Alzheimer-Mausmodell. Für eine präzise Messung der Plaquedichten wurde ein sehr großes Gehirnvolumen von 3 Kubikmillimeter pro Gruppe untersucht. In einem Langzeitversuch über 15,5 Monate mit einer zeitlichen Auflösung von einer Woche wurde erstmals eine komplette Kinetik des Plaquewachstums in einem Mausmodell beschrieben, die den gleichen Verlauf einer Sigmoid-Funktion aufwies, wie er bereits in vitro und in Alzheimer-Patienten gezeigt wurde. Die Plaquedichte stieg asymptotisch mit dem Alter an und folgte einer exponentiellen, einphasigen Assoziationsfunktion. Neu entstandene Plaques wiesen mit Abstand die kleinste Plaquegröße auf, die mit zunehmendem Alter anstieg. Die lineare Plaquewachstumsrate, gemessen als Zuwachs des Plaqueradius pro Woche, sank mit ansteigendem Alter der Mäuse, was sich in einer negativen Korrelation der Plaquewachstumsrate mit der Plaquedichte widerspiegelte. Sehr große Plaques wurden früh in der Entstehungsphase gebildet und die Größe am Ende der Untersuchung korrelierte mit ihrer Wachstumsrate. In der frühen Phase der Plaqueentwicklung nahmen die Plaques mit einer maximalen Wachstumsrate zu, die nicht durch die Abeta-Konzentration limitiert war. Die Wachstumsraten individueller Plaques waren sehr breit verteilt, was auf einen Einfluss lokaler Faktoren schließen ließ. Dieser Befund wurde gestützt durch den Langzeitversuch, da kein Zusammenhang zwischen den Wachstumsraten benachbarter Plaques detektiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen ein physiologisches Wachstumsmodell, in dem Plaques sehr langsam über große Zeiträume wachsen bis zum Erreichen eines Äquilibriums. Durch die nachgewiesenen Parallelen zu den Befunden von in vitro Studien und in vivo Ergebnissen von Alzheimer-Patienten stellen die beschriebenen Zusammenhänge eine wertvolle Grundlage für die Translation von Ergebnissen zwischen präklinischer und klinischer Forschung zur Entwicklung von Abeta-senkenden Therapien dar. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Effekte einer passiven Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere untersucht. Nach einer zweimonatigen Antikörper-Behandlung wurden keine Unterschiede in der Plaqueentstehungs- und Plaquewachstumskinetik gemessen. Eine in der Literatur beschriebene Akkumulation von Abeta-Oligomeren konnte durch eine in vivo Visualisierung mit einem hochspezifischen Antikörper gegen diese Molekülspezies nicht bestätigt werden. Lösliche Abeta-Peptide oder Abeta-Aggregate akkumulierten erwartungsgemäß um den amyloiden Kern von Plaques. Am Ende der Immunisierungsstudie wurde die synaptische Pathologie mittels immunhistochemischer Färbung der Prä- und Postsynapsen mit den Markern Synapsin und PSD-95 untersucht. Innerhalb amyloider Plaques wurden sehr niedrige Synapsendichten gemessen, die mit zunehmender Entfernung zum Plaque asymptotisch zu einem Plateau anstiegen. Diese Analyse zeigte erstmals, dass der Einflussbereich der toxischen Wirkung amyloider Plaques für Präsynapsen wesentlich größer ist als für Postsynapsen, was auf eine höhere Sensibilität von Präsynapsen schließen lässt. Abseits von Plaques im Cortex waren die Synapsendichten niedriger im Vergleich zu Wildtyptieren, wie durch den Vergleich der Plateaus gemessen wurde. Beide therapeutischen Antikörper zeigten eine partielle Normalisierung der Synapsendichte. Daraus folgt, dass die Abeta-Oligomere ursächlich für die Synapsenpathologie waren, da eine spezifische Neutralisierung dieser Abeta-Aggregate für einen Therapieeffekt ausreichte. Diese Ergebnisse bestätigen in vivo die toxische Wirkung von Abeta-Oligomeren auf Synapsen und beweisen eine mögliche Neutralisierung dieser löslichen Abeta-Aggregate durch eine passive Immunisierung.

Morbus Alzheimer ist die am weitesten verbreitete Form der Demenz mit verheerendem Einfluss auf das Leben der Betroffenen, deren Angehörigen sowie die weltweiten Sozialsysteme. Durch die alternde Gesellschaft gewinnt die Krankheit immer mehr an Relevanz, vor allem da bisher weder die Ursache der Erkrankung bekannt noch hinreichende Therapien etabliert sind. Ein zentrales Problem in der Entwicklung neuer Therapieansätze liegt in dem Fehlen eines verlässlichen, breit einsetzbaren Frühdiagnoseverfahrens. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob ein Nachweis der Alzheimer-typischen Proteinaggregate von Aβ und Tau in der Retina für ein potentielles Diagnoseverfahren genutzt werden kann. Dabei sollte eine Methode etabliert werden, bei dem eine Aβ- und Tau-spezifische, fluoreszente Sonde systemisch appliziert und schließlich das gebundene Fluorophor unter Verwendung eines Retina-Scanners detektiert wird. Dieses Verfahren sollte zunächst in Mausmodellen des Morbus Alzheimer etabliert werden, die laut Literaturangaben Aβ-Plaques (u.a. DeltaE9 und Tg2576) bzw. fibrilläre Tau-Aggregate (P301S) im Gehirn und der Retina entwickeln. Unter Verwendung Aβ- bzw. Tau-spezifisch bindender Fluorophore (FSB und BSc4090) konnte in vivo kein Nachweis von Aβ-Plaques in der Retina mehrerer transgener Mauslinien erbracht werden. Begleitende histologische Untersuchungen zeigten ebenfalls keinerlei Anzeichen für Aβ-Plaques in diesen Retinae, was im Widerspruch zu publizierten Arbeiten steht. In der P301S-Linie gelang hingegen erstmals der in vivo Nachweis von fibrillären Tau-Aggregaten in retinalen Ganglienzellen unter Verwendung des Farbstoffes FSB. Dieser Befund wurde genutzt, um den Verlauf der Pathologie in der Retina der P301S-Linie über mehrere Monate zu verfolgen. Dabei wurde ein kontinuierlicher Anstieg der Anzahl von retinalen Ganglienzellen mit fibrillären Tau-Aggregaten festgestellt. Anzeichen für einen hierdurch bedingten Zellverlust fanden sich allerdings nicht. Diese Methode erlaubte erstmalig die Durchführung nicht-invasiver Langzeitexperimente zur Untersuchung von Wirkstoffen, die eine Bildung fibrillärer Tau-Aggregate verhindern sollen. Mit den verwendeten GSK3-Inhibitoren konnte allerdings kein Effekt beobachtet werden. Parallel zu den Experimenten im Mausmodell wurden histologische Untersuchungen an den Retinae verstorbener Alzheimer-Patienten durchgeführt. Analog zu den Befunden in den Mausmodellen konnten in den Retinae von Alzheimer-Patienten keine Aβ-Plaques nachgewiesen werden. Zwar wurden Ablagerungen von hyperphosphoryliertem Tau in den Retinae der Alzheimer-Fälle nachgewiesen, fibrilläre Tau-Aggregate fanden sich allerdings nicht. Somit kann der in vivo Nachweis fibrillärer Tau-Aggregate in der Retina des P301S-Modells nicht auf die humane Diagnose übertragen werden

Die Entwicklung kognitiver Fähigkeiten stellt sowohl historisch als auch aktuell eines der breitesten und lebendigsten psychologischen Forschungsfelder dar. Besonders bezüglich der (Alters-) Differenzierungshypothese, welche die Ausdifferenzierung kognitiver Fähigkeiten mit fortschreitendem Alter postuliert, weisen die durchgeführten Studien jedoch eine beachtliche Heterogenität in ihren Befunden auf. Die Diagnostik kognitiver Fähigkeiten hängt untrennbar mit den vorausgesetzten Modellen und eingesetzten diagnostischen Verfahren zusammen, welche den Befunden hinsichtlich ihrer Heterogenität in nichts nachstehen. Die gegenwärtige Arbeit zeigt, dass im Grundschulalter bei der Entwicklung von Inhibitionsfähigkeit, Arbeitsgedächtniskapazität und Reasoningfähigkeit keine Ausdifferenzierung im Sinne sinkender Korrelationen zu beobachten ist (Studie I). Eine Analyse möglicher Prädiktoren der Mathematiknote zeigt zudem, dass in der zweiten Klasse Arbeitsgedächtniskapazität die beste Vorhersage liefert, während Reasoningfähigkeit in der dritten und vierten Klasse den einzig relevanten Prädiktor darstellt. Diese Ergebnisse sind konform mit den Schwerpunkten des Mathematikunterrichts in den jeweiligen Klassenstufen. In einer anschließenden Studie (Studie II) zur Diagnostik der Arbeitsgedächtniskapazität mittels der Zahlenspanne Rückwärts wird gezeigt, dass sowohl visuelle als auch verbale kognitive Strategien zur Bearbeitung der Aufgabe eingesetzt werden können, welche sich nicht durch die Präsentationsmodalität der Aufgabe beeinflussen lassen müssen. Dieser Befund liefert wichtige Implikationen zur Einordnung verschiedener widersprüchlicher Ergebnisse in der Arbeitsgedächtnisdiagnostik und der klinischen Diagnostik. In einer Studie (Studie III) zur Diagnostik der Inhibitionsfähigkeit werden die beim klassischen Stroop Test involvierten kognitiven Subprozesse untersucht und durch Einsatz eines räumlichen Stroop Paradigmas die verbale Komponente des Stroop Phänomens isoliert. Zudem wird gezeigt, dass Interferenz zwar durch positionsinkongruente Richtungswörter konstruiert werden kann, die Position-Wort-Interferenz jedoch schwächer als die klassische Farbe-Wort-Interferenz ausfällt. Zusammengenommen zeigt die Serie der drei Studien, dass wissenschaftliche Ergebnisse zur Diagnostik kognitiver Fähigkeiten einen Großteil ihrer Aussagekraft einbüßen, wenn die involvierten kognitiven Teilprozesse nicht berücksichtigt werden.

Im Zellkern einer jeden Zelle besteht eine gewisse Ordnung der darin vorhandenen DNA und Proteine. Diese Ordnung wird unter dem Begriff „Zellkernarchitektur“ zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit ging es um die nähere Betrachtung einiger Aspekte der Zellkernarchitektur. Diese Aspekte betrafen 1. die Anordnung von Genen, 2. die Anordnung von Chromatin mit Hilfe unterschiedlicher Histonmodifikationen und 3. die Anordnungen von Chromosomenabschnitten, die mit komplexen messenger RNA-Sonden hybridisiert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels 3D FISH die dreidimensionale Positionierung von drei auf dem Chromosom 1 lokalisierten Genen in Zellkernen der Burkitt- Lymphom Zelllinie DG75 bestimmt. Diese Zelllinie wurde von Stefan Bohlander zur Verfügung gestellt und enthielt einen induzierbaren episomalen Vektor für das CALM-AF 10 Gen. Messungen der Genexpression, die in der Bohlander Gruppe mit Hilfe eines Affymetrix- Chips durchgeführt wurden, zeigten das die Induktion des Transgens zu genomweiten Veränderungen der Expressionsmuster hunderter Gene in dieser Zelllinie führten. Die für die 3D FISH Experimente ausgewählten Markergene zeigten nach der Induktion eine signifikant veränderte Expression. Dennoch änderte sich die radiale Positionierung dieser Gene, darunter versteht man die mehr innere oder mehr periphere Position der Gene, nicht. Dieses Ergebnis schien zuerst darauf hinzuweisen, dass die Transkriptionsstärke keine bedeutsamer Faktor im Hinblick auf die radiale Positionierung ist. Die Befunde der Affymetrix-Chip Analyse für diese Gene konnten jedoch in einer anschließende Untersuchungen der Genexpression mit Real-Time-PCR nicht bestätigt werden, obwohl der Vergleich von Affymetrix-Chip und Real- Time-PCR Daten insgesamt eine klare Korrelation zwischen den Datensätzen zeigte. Bei Diskrepanzen gehen wir davon aus, dass Real-Time-PCR die zuverlässigeren Ergebnisse liefert. Bei der hier durchgeführten Real-Time-PCR Untersuchung wurden auch die Expressionsstärken aller in einer Nachbarschaft von etwa 1 Mbp um die Markergene annotierten Gene ermittelt. Dieses Fenster wurde gewählt, weil Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer und anderen Gruppen gezeigt haben, dass ~1 Mbp Chromatindomänen die Basisstruktur der Chromatinorganisation darstellen. Als Maß für die gesamte Genexpression einer Chromatindomäne wurde eine „Total Expression Strength“ (TES) berechnet. Dieser Wert basiert auf den Real-Time-PCR Werten der annotierten Gene und berücksichtigt auch die Länge der ungespleissten RNA, die von einem Gen transkribiert wird. Dabei zeigte sich, dass das Markergen in der Domäne mit dem höchsten TES Wert am weitesten innen im Zellkern lokalisiert ist. Dieser Befund unterstützt Befunde aus der wissenschaftlichen Literatur, dass die radiale Positionierung von individuellen Genen von Eigenschaften der lokalen Umgebung abhängt. Da sich die Nachbarschaft der untersuchten Markergene nicht nur im Hinblick auf die TES Werte sondern auch im Hinblick auf die Dichte der dort annotierten Gene und den GC-Gehalt unterscheidet, bleibt offen, welcher dieser Parameter als Prädiktor für die zu erwartende radiale Position individueller Gene eine entscheidende Rolle spielt. Möglich ist auch, dass alle Parameter zusammenwirken oder dass je nach den speziellen Umständen einer Untersuchung verschiedene Parameter die radiale Positionierung eines Gens bevorzugt beeinflussen. Die Stabilität der radialen Positionierung der Markergene trotz einer genomweiten Veränderung des Genexpressionsmusters nach CALM-AF 10 Induktion stimmt mit Befunden verschiedener Arbeitsgruppe überein, die für einen hohen Grad an räumlicher Stabilität der Chromatinanordnung während der Interphase sprechen; ~1 Mbp Chromatindomänen zeigen dementsprechend meist nur sehr begrenzte lokale Bewergungen (

Mit dem ab Mitte der 1980er Jahre diagnostizierten Übergang in eine globale Wissensökonomie wird Unternehmensgründungen v. a. in den westlichen Industrienationen eine große Relevanz für die Durchsetzung von Innovationen und die Aufrechterhaltung der wirtschaftlichen Wettbewerbsfähigkeit zugesprochen. Dieser Befund hat speziell in den "gründungsschwachen" Marktwirtschaften des kontinentaleuropäischen Raums Debatten über die Notwendigkeit einer Steigerung der Gründungsproduktivität hervorgerufen. Während die wissenschaftliche Forschung zur Gründung und Frühentwicklung neuer Unternehmen (Entrepreneurship-Forschung) den Schlüssel zur Verringerung der europäischen "Gründungslücke" noch heute v. a. in der institutionellen Konvergenz mit dem nachweislich "erfolgreichen" angelsächsischen Modell des liberalen Kapitalismus vermutet, kann mit sekundarstatistischen Daten ein alternativer gründungspolitischer Ansatz nachgewiesen werden, der v. a. auf dem Abbau von bürokratischen Hürden und direkt wirkenden Maßnahmen der Sensibilisierung, Qualifizierung und finanziellen Bezuschussung bzw. Entlastung von Unternehmensgründern basiert. Dieser Ansatz ist notwendigerweise mit einer aktiven politischen Steuerung der Gründungsdynamik verbunden, deren Ursachen und Implikationen in der US-amerikanisch dominierten internationalen Entrepreneurship-Forschung bisher jedoch kaum thematisiert werden. In der vorliegenden Promotion wird unter Rückgriff auf Konzepte und Befunde der komparativen Kapitalismusforschung die These eines kontextsensitiven Pfades der Institutionalisierung entwickelt, systematisiert und in vier wissenschaftlichen Aufsätzen auf ihre Relevanz geprüft. Meta-analytisch angelegte Studien zur Organisation und inhaltlichen Ausrichtung der deutschen und europäischen Entrepreneurship-Forschung weisen dabei eine kontextspezifische Ausgestaltung der Debatte nach, in der die soziale und regionale Umwelt der Unternehmensentstehung sowie deren dynamische Transformation durch gezielte politische Eingriffe ein systematisch erhöhtes Forschungsaufkommen generieren. Die konkrete Analyse des politisch gesteuerten Institutionalisierungspfades am Beispiel der akademischen Gründungsförderung an deutschen Hochschulen macht darüber hinaus den adaptiven Charakter der europäischen Gründungspolitik deutlich, die durch eine charakteristische Kombination von grundungspolitischen Instrumenten gekennzeichnet ist, neben den aus der Referenzliteratur bekannten innovations- und beschäftigungspolitischen Zielsetzungen auch Züge einer ausgleichsorientierten Politik tragt und durch ein organisational und regional differenziertes System von sozialen Praktiken implementiert wird. Die Arbeit liefert damit insgesamt überzeugende Argumente für die These, dass die Intensivierung von gründungspolitischen Eingriffen im europäischen Raum als kontextsensitiver Prozess der Optimierung angelegt ist, der die breiteren polit-ökonomischen Strukturen der Gesellschaft explizit reflektiert und aufgrund seines transformativen Charakters in der US-amerikanisch dominierten Mainstream-Debatte sowohl konzeptionell als auch empirisch mehr Aufmerksamkeit erhalten muss.

Der vorliegende Beitrag untersucht die Determinanten der Performance europäischer Arbitrage Collateralized Loan Obligations für das Jahr 2009. Der Fokus liegt dabei auf der Bedeutung der performanceabhängigen Vergütung des CLO-Managers, den Eigenschaften des CLO-Managers und der Transaktionscharakteristika als mögliche Einflussfaktoren der Rating Performance. Es wird gezeigt, dass Transaktionen, bei denen dem CLO-Manager eine Incentive Management Fee gewährt wird, mit einer höheren Wahrscheinlichkeit herabgestuft werden als Transaktionen ohne Incentive Fee. Dieser Befund bestätigt die Hypothese, dass durch die Incentive Fee Risikoanreize für CLO-Manager geschaffen werden. Des Weiteren wird ein positiver Zusammenhang zwischen der Erfahrung bzw. der Größe eines CLO-Managers und der Rating Performance festgestellt. Der Einfluss des Managers auf die Performance einer CLO-Transaktion wird auch an den weiteren in der Studie herangezogenen managerspezifischen Charakteristika wie Typ und Unternehmenssitz bestätigt. Für die Transaktionscharakteristika wird hingegen im betrachteten Untersuchungszeitraum kein signifikanter Einfluss auf die Rating Performance nachgewiesen.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Studiendesign etabliert, um den Einfluss von Topiramat auf die Zielparameter Körpergewicht sowie Futter- und Wasseraufnahme und den Insulin- und Fettstoffwechsel unter kohlenhydratreicher Ernährung zu evaluieren. Es wurden insgesamt 4 Versuchsreihen im Paarfütterungsdesign durchgeführt. Homozygote Zuckerratten und db/db Mäuse erhielten über 1 bis 4 Wochen eine Hochdosis-Topiramattherapie (100 mg/kg/d) über eine orogastrale Sonde. Die db/db Maus erwies sich als nicht robust genug für das zu etablierende Studiendesign. Bei den Zuckerratten zeigte Topiramat den bekannten akuten anorektischen Effekt. Im Verlauf wurde bei den behandelten Tieren eine Verlangsamung der Wachstumsgeschwindigkeit gegenüber den Placebotieren trotz höherer oder gleicher Futteraufnahme deutlich. Dies lässt auf Wirkmechanismen des Topiramats schliessen, die das Energiegleichgewicht der Tiere auf metabolischer Ebene beeinflussen. Als ein wichtiger metabolische Effekt konnte die bereits vorbeschriebene antidiabetische Wirkung beobachtet werden. Daneben konnte erstmals eine Verminderung der de novo Lipogeneserate im weißen Fettgewebe nachgewiesen werden. Dieser Befund lässt der Carboanhydrasehemmung durch Topiramat eine zentrale Bedeutung für die gewichtsreduzierende Wirkung zukommen und gibt Anlass zur Erforschung weiterer Hemmstoffe, die nach Möglichkeit eine höhere Spezifität für das weiße Fettgewebe aufweisen sollten.

Vertreter des Enterobacter cloacae Komplexes sind gram-negative Bakterien der intestinalen Normalflora vieler Menschen und gleichzeitig häufige Erreger von Pneumonien, Septikämien und Harnwegsinfektionen auf Intensivstationen. Einen Unterschied zu anderen Krankheitserregern stellt die große Heterogenität des E. cloacae Komplexes dar. Er besteht aus 13 genetischen Clustern, von denen neun mittlerweile als Spezies bzw. Subspezies beschrieben sind. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Prävalenz der einzelnen Genotypen des Komplexes bei Patienten im Krankenhaus zu untersuchen und die Genotypen eventuell bestimmten Infektionsherden zuzuordnen. Deshalb wurden 196 prospektiv und randomisiert gesammelte klinische Isolate des E. cloacae Komplexes mittels hsp60 Sequenzierung ihren Genotypen zugeordnet und die Prävalenz sowie die Verteilung der Genotypen auf unterschiedliche klinische Materialien verglichen. Die wesentlichen Ergebnisse dabei waren, dass zwei Drittel der klinischen Isolate des E. cloacae Komplexes im Klinikum Großhadern den Subspezies von E. hormaechei und dem Cluster III zugeordnet werden konnten. E. cloacae Stämme, die dem Typstamm zugeordnet werden konnten, kamen selten vor und spielten offensichtlich eine sehr untergeordnete Rolle. Einige der Genotypen zeigten Präferenzen zu bestimmten klinischen Materialien, z.B. waren die Subspezies von E. hormaechei bei Wundinfektionen signifikant überrepräsentiert. Ein Großteil der Berichte über Infektionen mit Stämmen des E. cloacae Komplexes sind Berichte über klonale Ausbrüche. Zur Identifikation von klonalen Ausbrüchen sind schnelle und zuverlässige Methoden unverzichtbar. Die Validierung der dafür zur Verfügung stehenden PCR-basierten Methoden war für den E. cloacae Komplex aufgrund seiner Heterogenität bislang noch völlig unzureichend. Ebenso wenig war bekannt, wie oft klonale Ausbrüche tatsächlich in einem durchschnittlichen Krankenhaus vorkommen. Deshalb wurden in dieser Arbeit zwei PCR-basierte Methoden des genetischen „finger printings“ bei Bakterien, die ERIC- und REP-PCR, anhand zweier Genotypen des E. cloacae Komplexes auf ihr Potential hin untersucht, Isolate genetisch zu trennen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Häufigkeit klonaler Ausbrüche im Klinikum Großhadern in einem Zeitraum von fünf Jahren ermittelt. Dabei zeigte sich, dass die ERIC-PCR zur Differenzierung auf Stammebene im E. cloacae Komplex nicht geeignet ist, sie unterscheidet hingegen auf Genotypenebene. Mittels REP-PCR können klonale Isolate mit einer Spezifität von 90% identifiziert werden. Obwohl über fünf Jahre alle Blutkulturisolate untersucht wurden, wurden nur zwei klonale Übertragungen mit jeweils zwei betroffenen Patienten gefunden. Die Genotypen des E. cloacae Komplexes waren ungleich in der Klinik vertreten. Einige Genotypen hatten signifikante Assoziationen zu bestimmten klinischen Materialien. Außerdem schienen nicht klonale Ausbrüche, sondern viele Infektionen mit individuellen Keimen für die zunehmende Bedeutung der Vertreter des E. cloacae Komplexes als nosokomiale Erreger verantwortlich zu sein. Dieser Befund spricht für endogene Infektionen mit Stämmen des E. cloacae Komplexes. Mittels subtraktiver Hybridisierung wurde nach möglichen Faktoren gesucht, die eine verbesserte Überlebensfähigkeit im Krankenhausmilieu vermitteln könnten. Es wurde das Genom eines Sepsiserregers von dem eines Pflanzenisolates „genetisch subtrahiert“. Als Faktor, der möglicherweise die zunehmende Prävalenz von Infektionen mit Vertretern des E. cloacae Komplexes erklären könnte, fand sich eine Resistenz-Determinante gegen Silberionen. Da Silber als Desinfektionsmittel und Antiseptikum eingesetzt wird, würde eine Resistenz einen Überlebens- und Selektionsvorteil im Krankenhausmilieu darstellen. Eine genauere genetische Analyse der Silberresistenz-Determinante zeigte, dass die Nukleotidsequenzen sowie die abgeleiteten Proteinsequenzen im hohen Maße übereinstimmend waren mit denen der ursprünglich beschriebenen sil-Determinante auf Plasmid pMG101 von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium. Der Aufbau der Determinante entsprach dem der Originalbeschreibung bei Salmonella enterica Serotyp Typhimurium. 63% der untersuchten Isolate des E. cloacae Komplexes besaßen diese Resistenz-Determinante. Die sil-Determinante war Genotypen-spezifisch verteilt, wobei die häufig in der Klinik vertretenen Genotypen signifikant öfter Träger der Silberresistenz waren. Die sil positiven Isolate wuchsen bei 8x höheren Konzentrationen Silbernitrat als die sil negativen Isolate. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die unterschiedliche Relevanz der Genotypen des E. cloacae Komplexes bei verschiedenen Infektionen gezeigt. Außerdem wurde durch Identifizierung genetischer Differenz zwischen einem pathogenen und einem als apathogen geltenden Isolats eine Teilerklärung für die unterschiedliche klinische Prävalenz gefunden. Aufbauend auf den vorliegenden Ergebnissen sollte die Virulenz-assoziierte Bedeutung der Silberresistenz-Determinante analysiert werden. Multizentrische Studien könnten die molekular-epidemiologische und Hygiene-Bedeutung des Fitnessfaktors beleuchten.

Die vorliegende Arbeit vergleicht die detaillierten Strukturanalysen in der Retina von 4 Pavianarten mit den Untersuchungen in der Retina des Mantelpavians. Das Ziel dieser Arbeit ist es, tiefere Erkenntnisse über das Farbensehen des Mantelpavians zu erlangen. Die Anwendung moderner Messmethoden ist aus tierschutzrechtlichen Gründen bei den Pavianarten rar und nur in wenigen Fällen wurden in vitro-Untersuchungen durchgeführt. Die M- und L-Zapfendichte im Bereich 100 μm von der Fovea (79)(Krebs und Krebs, 1989), die S-Zapfendichte bei 1 Grad von der Fovea (84)(Marc und Sperling, 1977) und die Dichte der Ganglienzellen (80)(Fischer und Kirby, 1991) sind in der Retina des Grünen Pavians und Gelben Pavians gegenüber den Dichten in der menschlichen Retina leicht erhöht (51)(Curcio und Allen, 1990), (97)(Goodchild et al., 1996), (48)(Ahnelt, 1998). Die Zufallsverteilung bei den M- und L-Zapfen und die reguläre Verteilung bei den S-Zapfen haben der Gelbe Pavian und der Rote Pavian mit dem Menschen gemein (84)(Marc und Sperling, 1977), (83)(Martin et al., 2000). Der Grüne Pavian besitzt einen Visual streak (80)(Fischer und Kirby, 1991), der etwa die gleiche Form hat wie in der menschlichen Retina (51)(Curcio und Allen, 1990). Beim Gelben Pavian antworten die midget- und parasol- Ganglienzellen auf die erregenden KA-, AMPA-, NMDA-Rezeptoren und auf die hemmenden GABA-, GLY-Rezeptoren (85)(Zhou et al., 1994). Bis auf Untersuchungen an Müller-Zellen in der Mantelpavian-Retina, siehe Kap. 4.7.1 gibt es keine Veröffentlichung über das Sehsystem des Mantelpavians. In der Fovea wurden nur Zapfen und keine Stäbchen gezählt (87)(Reichenbach, 1999). Dieser Befund ist schlüssig mit der über alle Primaten getroffenen Aussage. Ein für elektrophysiologische Messungen nach der Methode FIS tauglicher portabler Versuchsaufbau wurde neu entwickelt. Messungen in medias res an 10 Mantelpavianen im Münchener Tierpark Hellabrunn belegen die hohe Qualität des Verfahrens. Die Methode FIS, die Entwicklung des Verfahrens, seine aufwendige Programmierung der Regelung und Auswertung werden in den Kap. 5, Kap. 7.2 und im Anhang Kap. 13 erläutert. Die Methode FIS erlaubt schnelle Messungen der ERG-Antworten mit hoher Auflösung im 10-9 m Bereich. Die daraus berechneten spektralen Empfindlichkeiten zeichnen sich durch gute Reproduzierbarkeit aus. Die spektralen Empfindlichkeiten können durch Summation von Absorptionskurven angenähert werden, wie ein Abgleich mit den nach der 96 9 Zusammenfassung / Summary Mikrospektralphotometrie gewonnenen Spektraldaten der Photopigmente beweist (82)(Bowmaker et al., 1991), siehe Kap. 7.2.3 und Kap. 7.3. Die Spektraldaten der Photopigmente der Mantelpaviane reihen sich in die Spektraldaten der Altweltaffen ein. Die Messungen der ERG-Antworten und die Berechnung der spektralen Empfindlichkeiten von 10 Mantelpavianen nach der Methode FIS bringen neue Ergebnisse über die Verteilung der S-, M- und L-Zapfen und über die Variation der L- zu M-Zapfenzahl bei den Pavianarten. Für die Mantelpavian-Retina beträgt die durchschnittliche prozentuale Verteilung der S-Zapfen ca. 5 Prozent, der M-Zapfen ca. 29 Prozent und der L-Zapfen ca. 66 Prozent, siehe Kap. 7.4. Die Werte zeigen eine ähnliche Verteilung der S-, M- und L-Zapfen wie sie in der menschlichen Retina beobachtet wird (18)(Sharpe et al. 1999b). In der Variation der L- zu M-Zapfenzahl zeichnet sich beim Mantelpavian eine Tendenz zu mehr L-Zapfen ab. Bei den Mantelpavian Weibchen wird eine Variation von 2,0:1 und bei den Mantelpavian- Männchen eine Variation von 2,4:1 bestimmt, siehe Kap. 7.5. Es gibt keinen großen Unterschied in der Variation der L- zu M-Zapfenzahl zwischen dem Geschlecht der Mantelpaviane. Bei den Altweltaffen existiert kein merklicher statistischer Unterschied im relativen Verhältnis der L- zu M-Zapfen-mRNA (58)(Deeb et al., 2000). Aus der Berechnung der spektralen Empfindlichkeiten bei den Mantelpavianen lassen sich eine klassische blau-gelb-Verschaltung und eine weitere Verschaltung ableiten, die aber näherer Prüfung bedarf. Das Ergebnis steht im Einklang mit der Zunahme des blau-gelb-Kanals gegenüber dem rot-grün-Kanal in der peripheren Retina (45)(Murray et al., 2006). In weiteren Forschungsvorhaben sollten bei den Pavianarten die Gegenfarbmechanismen der klassischen S-ON/(L+M)-OFF Zellen, SOFF/( L+M)-ON Zellen und weiterer Ganglienzelltypen untersucht werden, die zum Farbensehen beitragen könnten. Die neuen Ergebnisse über die Mantelpaviane geben weitere Impulse zu Untersuchungen offener Fragestellungen. Der Mantelpavian besitzt ein trichromatisches Farbensehen

Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.

Die Zellkernarchitektur beschreibt die räumliche Anordnung der linearen Gensequenz im dreidimensionalen Zellkern. Die Beobachtung einer geordneten räumlichen Strukturierung und radialen Verteilung der Gene und Chromosomen legt nahe, daß die Zellkernarchitektur Basis und Ausdruck von höheren Organisations- und Regulationsmechanismen ist. Chromosomen liegen im Interphasezellkern in definierten umschriebenen Regionen, sogenannten Chromosomenterritorien vor. Aus früheren Untersuchungen weiß man um die Gendichte-korrelierte radiale Anordnung dieser Chromosomenterritorien. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Frage, inwieweit die Gendichte eines subchromosomalen DNA-Bereiches (also eines Teilabschnittes eines Chromosoms) die Position dieses DNA-Abschnittes in Bezug auf das Chromosomenterritorium und den Interphasezellkern beeinflußt. Mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an 2D- und 3D-fixierten Zellkernen (2D/3D-FISH) und Epifluoreszenz- bzw. konfokaler Mikroskopie wurden spezifische subchromosomale Bereiche unterschiedlichen Gengehalts der Chromosomen 1 und 12 differentiell dargestellt. Beide Chromosomen zeichnen sich durch eine distinkte Gliederung in sehr genarme und sehr genreiche Areale aus. Als DNA-Sonden wurden fluoreszenzmarkierte Pools aus exakt kartierten BAC-Klonen von Chromosom 1 und 12 eingesetzt, die entweder einer R- oder G-Bande oder alternativ einem chromosomalen Abschnitt hoher oder niedriger Gendichte zugeordnet waren. Um mögliche andere, von der Gendichte unabhängige Einflüsse auf die radiale Verteilung subchromosomaler Bereiche wie z.B. die Kerngestalt zu identifizieren, wurden die Versuche an drei unterschiedlichen menschlichen Zellarten, Lymphozyten, Fibroblasten und Coloncarcinomzellen der Zellinie SW480, sowohl während der S-Phase als auch nach Verlassen des Zellzyklus in der G0-Phase durchgeführt. Die quantitative Evaluation der Anordnung und der radialen Verteilung der DNA-Segmente in Bezug auf das Chromosomenterritorium bzw. auf den Kern erfolgte an 3D-Rekonstruktionen von lichtoptischen Serienschnitten mittels zweier unabhängiger computergestützter Auswertungsprogramme. Es konnte gezeigt werden, daß in den annähernd runden Lymphozyten radiale Verteilungsunterschiede in Korrelation zur Gendichte gegeben sind: Genarme Bereiche des Chromosoms 12 ordnen sich unabhängig vom Zellzykluszeitpunkt in Bezug auf den geometrischen Mittelpunkt des Interphasekerns peripherer an als genreiche. Dieser Befund stützt die Hypothese, daß genreiche Regionen von Chromosomen eher zum Zellkernmittelpunkt hin präsentiert, genarme dagegen in die Peripherie verlagert werden. In der S-Phase konnte eine ebensolche radiale Verteilung auch in Bezug auf das Chromosomenterritorium gefunden werden. Hier wird die genarme DNA schwerpunktmäßig an den Rand des Territoriums verschoben. Anders verhält es sich bei den adhärent wachsenden, flachen humanen Fibroblasten. Hier konnte kein signifikanter Unterschied in der dreidimensionalen, räumlichen Anordnung genarmer und genreicher DNA-Abschnitte gefunden werden, und zwar weder in Bezug auf den Kern noch auf das Territorium. SW480-Tumorzellen sind rundliche bis ellipsoide Zellen. Ähnlich den Lymphozyten zeigen sie klare radiale Anordnungsunterschiede von Bereichen des Chromosoms 12, sortiert nach der Gendichte. Allerdings sind diese Unterschiede weniger stark ausgeprägt als bei den Lymphozyten. So konnte nur in Bezug auf das Chromosomenterritorium ein signifikanter radialer Verteilungsunterschied gefunden werden. In Bezug auf den Kern sieht man eine deutliche, aber statistisch nicht signifikante Tendenz, genarmes Chromatin in die Peripherie zu verlagern. Insgesamt belegen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, daß das Prinzip der Korrelation von Gendichte und radialer Verteilung grundsätzlich auch für subchromosomale Bereiche gilt. Es läßt sich jedoch feststellen, daß bei der radialen Verteilung von Chromosomenabschnitten weitere, noch nicht bekannte Faktoren eine Rolle spielen und sie nicht ausschließlich durch die Gendichte bestimmt wird.

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

Durch die Kombination verschiedener experimenteller Methoden konnten in der vorliegenden Arbeit zahlreiche Elemente eines bislang unbekannten GABAergen Steuerungssystems in der Nebennierenrinde nachgewiesen werden. Neben Markern neuroendokriner Differenzierung wie Syntaxin und VAMP-2 konnten sowohl endogene GABA-Produktion als auch GABA-Rezeptoren in steroidproduzierenden Zellen der Nebenniere identifiziert werden. Die Schlüsselenzyme GAD und VIAAT, die für die Synthese und Speicherung von GABA verantwortlich sind, wurden mittels immunologischer und molekularbiologischer Verfahren in adrenokortikalen Zellen lokalisiert. Außerdem wurde die Aktivität von GAD in einem in vitro-Assay nachgewiesen. Daneben wurden GABAA-Rezeptor-Untereinheiten und GABAB-Rezeptoren, darunter die Spleissvariante GABAB(1e), in der Nebennierenrinde vorgefunden. Diese Befunde wurden durch Untersuchung menschlicher und tierischer Gewebe sowie einer menschlichen Nebennierenrinden-Tumorzelllinie (NCI-H295R) gewonnen. Die ausgeprägten Übereinstimmungen zwischen den verschiedenen Modellsystemen unterstreichen dabei die Relevanz der Ergebnisse. Weitergehende Untersuchungen haben zudem ergeben, dass den GABAB-Rezeptoren in der Nebennierenrinde funktionelle Signifikanz zukommt: durch die Modulation von T-Typ Calcium-Strömen interagieren sie mit einem wichtigen Signalweg, dessen Bedeutung für die Steuerung der Steroid-Biosynthese gut belegt ist. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit auch bereits publizierte Erkenntnisse zur Expression von Calciumkanälen in der Zona glomerulosa bestätigt und durch die Untersuchung humanen Gewebes erweitert. Die in der Ratte festgestellte Lokalisation des GABAergen Systems in der Zona glomerulosa, in Kombination mit dem beobachteten Einfluss von GABAB-Rezeptoren auf Calciumkanäle, deckt sich unter funktionellen Gesichtspunkten gut mit der besonderen Bedeutung des Calcium-Signalwegs für die Regulation der Aldosteronproduktion. Hingegen konnte in der vorliegenden Arbeit weder ein deutlicher Einfluss von adrenokortikalen GABAB-Rezeptoren auf die cAMP-Signaltransduktionskaskade, noch eine Beeinflussung des Proliferationsverhaltens von NCI-H295R-Zellen durch GABAerge Stimulantien festgestellt werden. Die Klärung der physiologischen Rolle von GABA im Kortex der Nebennieren bedarf noch weiterer Forschungsanstrengungen. Insbesondere ist die Frage, ob eine GABAerge Modulation des Calciumeinstroms durch T-Typ-Kanäle tatsächlich die Produktion von Steroidhormonen beeinflusst, noch unbeantwortet. Zudem existieren auffällige Unterschiede in der Verteilung von GAD, VIAAT und GABAB(2) zwischen der Nebennierenrinde der Ratte, verglichen mit der des Menschen. Daher muss noch genauer untersucht werden, ob sich auch die funktionelle Bedeutung von GABA in diesen Spezies unterscheidet. In vivo-Experimente in Ratten, die akutem Stress ausgesetzt wurden, zeigten aber, dass die Verabreichung von Baclofen die Kortikosteron-Konzentration im Blut beeinflusst [95] und unterstreichen somit eine mögliche Rolle von GABA in der Kontrolle der Nebennieren-Funktion. Zusammengefasst zeigen die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse, dass in der Nebennierenrinde ein bislang unbekanntes, lokales GABAerges Signaltransduktionssystem existiert. Dieser Befund sollte zusammen mit ähnlichen, gut dokumentierten Befunden aus anderen endokrin aktiven Geweben wie der Adenohypophyse, dem endokrinen Pankreas und dem Hoden betrachtet werden. In diesen breiteren Kontext gestellt, unterstützt die vorliegende Arbeit das Konzept, dass GABA nicht nur ein wichtiger Neurotransmitter im ZNS ist, sondern auch ein weit verbreitetes Signalmolekül in peripheren Organen darstellt.

Hintergrund und Fragestellung: Die Konfrontation des Immunsystems mit einem definierten Antigen löst eine spezifische Immunantwort aus. Die daran beteiligten TH-Zellen können anhand der von ihnen sezernierten Zytokine in TH1- und TH2-Zellen sowie in weitere Subtypen differenziert werden. Dabei sind TH1-Zellen durch die Synthese von IFN-g charakterisiert, während TH2-Zellen vorwiegend Interleukin-4 produzieren. Die gezielte Auswanderung von TH-Zellen in inflammatorische Gewebe wird unter anderem durch Chemokinrezeptoren, welche chemotaktische Zytokine (sog. Chemokine) binden, gesteuert. TH1-Zellen exprimieren bevorzugt CXCR3 und CCR5, TH2-Zellen dagegen CCR3 und CCR4. TH-Zellen sind an der Pathogenese von Typ I Allergien entscheidend beteiligt. Für die Entwicklung der hinsichtlich der Ausbildung von Typ I Allergien protektiven TH1-Zellen scheint die Auseinandersetzung des Immunsystems mit mikrobiellen Antigenen in der allerfrühesten Kindheit notwendig zu sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in einem Pilotprojekt an einem Normalkollektiv zweijähriger Kinder das Expressionsmuster oben genannter Chemokinrezeptoren auf peripheren TH-Zellen zu analysieren. In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, ob ein positiver Zusammenhang zwischen TH2-assoziierten Chemokinrezeptoren und der Familienanamnese hinsichtlich atopischer Erkrankungen, der klinischen Diagnose einer atopischen Dermatitis und anderen in der Allergiediagnostik eingesetzten Parametern besteht, oder sich ein negativer Zusammenhang zwischen den TH1-assoziierten Chemokinrezeptoren und oben genannten Parametern zeigen lässt. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob zwischen der Endotoxinexposition, als Proxy für die mikrobielle Exposition in den ersten Lebensmonaten, und dem Expressionsmuster der Chemokinrezeptoren ein Zusammenhang nachgewiesen werden kann. Ergebnisse:Die Chemokinrezeptoren CCR4, CCR5 sowie CXCR3 waren bei allen Probanden nachweisbar. CCR3 konnte bei acht von 37, IFN-g bei 33 von 42 untersuchten Probanden nachgewiesen werden. IL-4 war nicht nachweisbar. Es bestand ein positiver Trend in der Korrelation zwischen der mRNA-Expression von IFN-g und den Chemokinrezeptoren CCR5 (r=0,571) sowie CXCR3 (r=0,386). Ebenso zeigte sich ein positiver Trend in der Korrelation zwischen CCR5 und CXCR3 (r=0,273). Diese Zusammenhänge waren nicht statistisch signifikant. Dagegen korrelierte die CCR5 mRNA-Expression hochsignifikant (p=0,001) sowie die CCR4 mRNA-Expression grenzwertig signifikant (p=0,046) mit dem Endotoxingehalt in der Muttermatratze der Probanden. Schlussfolgerungen: ·In unstimulierten peripheren T-Helferzellen zweijähriger Kinder ist die Quantifizierung der Chemokinzeptoren CCR4, CCR5 sowie CXCR3 mit Hilfe der real-time RT-PCR möglich. IFN-g ist in der überwiegenden Anzahl der untersuchten Probanden nachweisbar, CCR3 nur bei wenigen, IL-4 bei keinem der Probanden. ·Die mRNA-Expression TH1-/TH2-assoziierter Chemokinrezeptoren in unstimulierten, peripheren T-Helferzellen ist für die Differenzierung von Kindern mit von Kindern ohne atopische Dermatitis nicht hilfreich. ·Dagegen scheint die mRNA-Expression von CCR5 als möglichem Marker einer TH1-Antwort mit dem Symptomenkomplex wheezing zu korrelieren. Dieser Befund muss in Studien mit großen Fallzahlen überprüft werden. Wheezing ist am häufigsten mit viralen Infektionen vergesellschaftet. Die weitere Nachuntersuchung der Kinder im Schulalter wird zeigen, bei welchen Kindern sich dennoch Asthma manifestiert. ·Die perinatale Endotoxin-Exposition ist mit einer erhöhten CCR5 mRNA-Expression peripherer TH-Zellen assoziiert. ·Damit deuten die Befunde auf eine Verwertbarkeit der CCR5 mRNA-Expression als TH1-Marker in unstimulierten peripheren TH-Zellen hin.

Ziel der vorliegenden Studie war es, einen Überblick über die abdominale Sonoanatomie des Frettchens zu liefern. Zu diesem Zweck wurden 38 gesunde sowie 17 aufgrund verschiedener Krankheitssymptome vorgestellte adulte Frettchen mit einem 12 MHz-Linearschallkopf sonographisch untersucht. Dokumentiert wurden physiologische Parameter sowie häufig auftretende pathologische Veränderungen der abdominalen Organe. Mit Ausnahme des Pankreas konnten sämtliche Organe regelmäßig abgebildet werden. Die Darstellung der meisten Organe entsprach dem von Hund und Katze bekannten sonographischen Bild. Daneben konnten einige für das Frettchen spezifische Befunde erhoben werden. Besonders augenfällig war der bei allen untersuchten Tieren leicht auffindbare Lymphonodus mesentericus cranialis. Dieser dem Hund und der Katze fehlende Lymphknoten befand sich beim Frettchen auf Höhe der vorderen Gekrösewurzel zentral im Abdomen. Er stellt sich physiologischerweise als eine 6-18 mm lange, 3-14 dicke bohnenförmige Struktur dar, die eine deutliche Einziehung im Hilusbereich sowie eine klare Unterteilung in eine hyperechogene Mark- und eine hypoechogene Rindenzone erkennen läßt. Besondere Bedeutung kommt diesem Lymphknoten aus zwei Gründen zu. Zum einen ist eine genaue Kenntnis seiner Sonoanatomie unverzichtbar, da er aufgrund seiner Form, Größe und Lage sehr leicht mit einem Nebennierentumor, einer der häufigsten Neoplasien beim Frettchen, verwechselt werden kann. Zum anderen war er in allen in dieser Studie diagnostizierten Fällen von Lymphomen morphologisch verändert. Dieser Befund ist insofern relevant, als Lymphome neben den Tumoren der Nebenniere zu den häufigsten Neoplasien beim Frettchen zählen. Auffällige pathologische Befunde betrafen vor allem die Nieren. Hier fanden sich im wesentlichen zwei bei einer Vielzahl von Tieren feststellbare Veränderungen. Bei 20 von 55 untersuchten Frettchen wies mindestens eine der Nieren Zysten im Rindenbereich auf, deren Zahl und Größe individuell stark variierte. Lediglich zwei Tiere, bei denen nahezu das gesamte Organparenchym durch sehr große Zysten verdrängt war, wiesen eine Störung der Nierenfunktion auf. 22 der 55 Frettchen zeigten eine deutliche Hyperechogenität des Nierenmarks, bei der es sich vermutlich um eine Nephrokalzinose handelte. Nach den bisherigen Untersuchungen führt jedoch auch dieser Befund nicht zu einer Beeinträchtigung der Nierenfunktion. Daneben waren die am häufigsten auftretenden Befunde Lymphadenopathien, Splenomegalien sowie Nebennierentumoren. Insgesamt erwies sich die abdominale Sonographie beim Frettchen als eine sehr gut durchführbare und aussagekräftige Untersuchungsmethode, die bei einigen Erkrankungen das bildgebende diagnostische Mittel der Wahl darstellt. Der abdominalen Sonographie sollte daher beim Frettchen der gleiche Stellenwert zukommen, den sie bei Hund und Katze bereits besitzt.

Es gilt heute als gesichert, dass eine starke genetische Komponente in der Ätiologie der Schizophrenie vorliegt. In der vorliegenden Arbeit wurden in einer Fall-Kontroll-Assoziationsstudie drei genetische Polymorphismen in Genen des Interleukin-1-Genkomplexes auf eine mögliche Assoziation mit Schizophrenie untersucht: die Gene, die für die proinflammatorischen Interleukine Interleukin-1 alpha und Interleukin-1 beta kodieren, sowie das Gen, welches für den antiinflammatorischen Interleukin-1-Rezeptorantagonist kodiert. Dieser ist der natürlich vorkommende, endogene Gegenspieler von Interleukin-1. Seine biologische Funktion scheint in der Kontrolle des Ausmaßes der proinflammatorischen Interleukine zu liegen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Gene liegen innerhalb einer Genregion auf Chromosom 2p12-q22.1, die in einer groß angelegten Meta-Analyse als einziger Genabschnitt eine genomweite signifikante Kopplung erreichte (Lewis et al. 2003). Daher sind die Gene des Interleukin-1-Genkomplexes positionelle Kandidatengene in der Pathogenese der Schizophrenie. Außerdem sind die Interleukine deswegen sehr interessante Proteine für die Schizophrenie, da sie den Metabolismus von Neurotransmittern und die Hirnentwicklung beeinflussen sowie Informationen zwischen Zellen des peripheren Immunsystems und des zentralen Nervensystems vermitteln können. Im Blut, in der Zerebrospinalflüssigkeit sowie im präfrontalen Cortex schizophrener Patienten konnten veränderte Konzentrationen von IL-1 und IL-1RA im Vergleich zu Kontrollen beobachtet werden. Dies weist auf eine Dysregulation der Interleukine in der Schizophrenie hin. Da Anomalien bei der Hirnentwicklung, den Neurotransmittersystemen und dem Immunsystem als mögliche Pathomechanismen der Schizophrenie betrachtet werden, ist es durchaus vorstellbar, dass eine genetisch bedingte Störung in dem sensitiven Gleichgewicht zwischen pro- und antiinflammatorischen Interleukinen in der Schizophrenie zumindest teilweise krankheitsauslösend oder -beeinflussend sein kann. Für diese Fragestellung wurden Allel- und Genotypfrequenzen eines C-889T-Basenaustauschpolymorphismus im Promotor des Interleukin-1 alpha-Gens, eines C-511T-Basenaustauschpolymorphismus im Promotor des Interleukin-1 beta-Gens sowie eines variable number of tandem repeats (VNTR) -Polymorphismus im zweiten Intron des Interleukin-1-Rezeptorantagonist-Gens untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte keine Assoziation zwischen den untersuchten Polymorphismen der Gene des Interleukin-1 alpha und beta mit der Diagnose Schizophrenie festgestellt werden. Bei dem untersuchten Polymorphismus des IL-1RN konnte ein Trend in Richtung einer selteneren Häufigkeit des Allels 2 bei Schizophrenen nachgewiesen werden. Die Analyse von Haplotypen des IL-1-Genkomplexes auf Assoziation mit Schizophrenie ergab keinen Zusammenhang. Die vorliegenden Ergebnisse sprechen dafür, dass das seltenere Vorkommen des Allels 2 des IL-1RA bei den Schizophrenen einen Einfluss auf das Entstehungsrisiko der Schizophrenie haben könnte, indem es zu einer Verschiebung der sensitiven Balance des Interleukin-1-Genkomplexes zwischen pro- und antiinflammatorischen Interleukinen zugunsten der proinflammatorischen Interleukine führt. Dieser Befund bekräftigt die Hypothese, dass eine überschießende Aktivierung des Immunsystems in der Pathogenese der Schizophrenie eine Rolle spielen könnte. Außerdem weist er darauf hin, dass die Dysregulation der Interleukine bei den Schizophrenen zumindest teilweise genetisch bedingt sein könnte. Die Ergebnisse sprechen somit für eine mögliche schützende Rolle des Allels 2 des Interleukin-1-Rezeptorantgonisten vor der Entstehung der Schizophrenie. Dieser Befund wurde durch neuste Studien von Zanardini et al. (2003) und Bocchio-Chiavetto et al. (2002), in denen die Träger des IL-1RN Allel 2 signifikant seltener bei den Schizophrenen vertreten waren, unterstützt.

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch außerhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schließen, dass dort ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebeständigen PPK bzw. PK spezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK aufzuklären, sollte in dieser Arbeit zunächst mittels einer quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der übrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen für eine ubiquitäre, aber teils sehr unterschiedliche Expression der PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man außerhalb der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, während FXII-mRNA nahezu ausschließlich in der Leber synthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe am stärksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was für eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei Entzündungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilität der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abhängt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den Zellen durch ständige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewährleisten. Mittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. Während in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei am 5´-Ende verkürzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten und dadurch eine intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse für die Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein Initiator-Element assoziiert ist. Außerdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufwärts von Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazität. Durch die Generierung von neun Verkürzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die P-1729 Region neben ubiquitär exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazität besitzt. Ebenso zeigt aber auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivität. Somit können innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der PPK-Transkription ermöglicht wird.

Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich intensiv mit dem Einbau von Methylengruppen zwischen diphenolische Verbindungen. Die Methylenierung der entsprechenden Verbindung fand jeweils statt durch Umsetzung mit Kaliumhydroxidlösung und Dichlormethan unter Verwendung eines Phasentransferkatalysators. Eingesetzt wurden die Verbindungen: trans-Diethylstilbestrol, meso-Hexestrol, Bisphenol A, 1,1-Bis(4-hydroxyphenyl)-ethan und Bis(4-hydroxyphenyl)-methan. Nach der Erprobung verschiedener Phasentransferkatalysatoren stellte sich Tetra-n-butylammoniumhydroxid als der geeignete Katalysator heraus. Der Einbau gelang in allen Versuchen. Die Ergebnisse der Umsetzungen waren dabei recht unterschiedlich. Die Reaktion mit DES erbrachte eine elastische Folie, die mit Hexestrol und Bisphenol A lackartige, polymere Substanzen. Die Umsetzungen mit 1,1-Bis(4- hydroxyphenyl)-ethan und Bis(4-hydroxyphenyl)-methan schließlich führten zu pulverartigen, oligomeren Verbindungen. Die Gründe für die unterschiedlichen Reaktionsweisen sind in den Strukturen der eingesetzten Edukte zu suchen. Während bei der relativ starren Struktur des DES ein kettenartiger Aufbau der Polymers die wahrscheinlichste Lösung darstellt, sind im Falle der Ausgangssubstanzen Hexestrol und Bisphenol A auch andere Möglichkeiten der räumlichen Anordnung denkbar. Beim Hexestrol ist aufgrund der Drehbarkeit der Einfachbindung im Grundgerüst wohl zusätzlich zur Kettenbildung eine Ringbildung zu beobachten. Auch beim Bisphenol A ist die Bildung von Ringen wahrscheinlich, was in diesem Falle der gewinkelten Struktur des Moleküls zuzuschreiben ist. Bestätigt werden diese Vermutungen durch die Auswertungen der jeweiligen 1H-NMRSpektren, der Massenspektren und nicht zuletzt der Ergebnisse der Gelpermeationschromatographie. Weiterführende Untersuchungen mittels GC/MS bzw. HPLC/MS konnten nicht durchgeführt werden, da die Substanzen nicht in den Laufmitteln löslich sind, die für diese Verfahren eingesetzt werden. Mit der genannten Methode ließen sich auch die natürlichen Östrogene 17 β-Östradiol und Östron zu den Verbindungen 64 und 65 umsetzen. Bei der Bestimmung der Kreuzreaktivitäten wurde für das Östron-„Dimere“ 65 der erwartete Wert von unter 0.01 % in Bezug auf 17 β-Östradiol ermittelt, was de facto eine Nicht-Bindung an den Östrogenrezeptor bedeutet. Dieser Befund steht im Einklang mit der These, dass für eine Bindung einer östrogen wirksamen Substanz an den Rezeptor zwingend eine phenolische Hydroxylgruppe notwendig ist. Für den mehrfach gemessenen Wert von 0.07 % bei Verbindung 64 gibt es im Moment keine Erklärung.

1. Die Antworten der Serum-TSH-Spiegel (Thyreoidea-stimulierendes Hormon) auf TRF-Injektion (Thyrotropin Releasing Factor) bei 8 Normalpersonen und 37 z. T. zweimal untersuchten Patienten mit hypophysärer oder hypothalamischer Erkrankung werden mitgeteilt. 2. Hypophysektomierte Patienten mit intrasellären Tumoren (N=12) zeigten keine oder nur subnormale Anstiege der TSH-Spiegel. 3. Von 9 präoperativ untersuchten Patienten mit intrasellärem HVL-Adenom hatten 3 eine sekundäre Hypothyreose. Diese 3 reagierten dennoch mit einem normalen Anstieg der TSH-Spiegel. Dieser Befund schränkt die diagnostische Wertigkeit der TRF-Belastung zur Differenzierung hypophysärer und hypothalamischer sekundärer Hypothyreosen ein. Die 6 euthyreoten Patienten dieser Gruppe zeigten erwartungsgemäß einen normalen TSH-Anstieg. 4. Bei den Patienten mit sekundärer Hypothyreose bei suprasellärem Tumor oder hypothalamischer Erkrankung (N=7) fand sich mit einer Ausnahme ein normaler oder ein erhöhter TSH-Anstieg. Die Bedeutung des Ausschlusses einer primären Hypothyreose wurde dargestellt, da diese Erkrankung ebenfalls durch erhöhte TSH-Anstiege bei TRF-Belastung charakterisiert ist. 5. Je ein Patient aus der Gruppe der aktiven (N=7) und der behandelten (N=6) Akromegalie zeigten einen nicht auf eine primäre Hypothyreose zurückführbaren erhöhen TSH-Anstieg, dessen Rolle für das gehäufte Auftreten einer Struma bei Akromegalie zu diskutieren ist.