Podcasts about thrombusbildung

Die tiefe Venenthrombose (TVT) entsteht nicht allein durch eine pathologische Blutgerinnung, sondern wird primär durch eine Entzündungsreaktion mit massiver Rekrutierung von Zellen der unspezifischen Immunabwehr ausgelöst. In der vorliegenden Dissertation wurde, mit Hilfe eines etablierten Mausmodells zur Untersuchung der zellulären und molekularen Entstehungsmechanismen der tiefen Venenthrombose (TVT), der Einfluss von Antikörpermolekülen auf die Bildung venöser Thromben untersucht - einer weiteren wichtigen Komponente in immunologischen Prozessen und bekannter Auslöser verschiedener pathologischer Geschehen. Dabei stellte sich heraus, dass Antikörpermoleküle die Entstehung venöser Thromben im Mausmodell beeinflussen: In Mäusen ohne Antikörper war die Thrombusbildung massiv beeinträchtigt und konnte durch Antikörper-Substitution wiederhergestellt werden. Es wurde eine starke Korrelation zwischen IgM-Serumspiegel und Thrombusgewicht sowie eine Beteiligung natürlicher Antikörper festgestellt. Die zugrunde liegenden Mechanismen konnten bereits in Ansätzen aufgeklärt werden: Beteiligte Antikörpermoleküle scheinen an Strukturen des hypoxischen Endothels zu binden und Einfluss zu nehmen auf die initiale Thrombozytenrekrutierung, auf die Leukozytenakkumulation im Thrombus wie auch auf die Fibrinbildung und –stabilisierung. Die gewonnenen Ergebnisse weisen demnach darauf hin, dass bestimmte Antikörpermoleküle in der Lage sind, die Entstehung einer TVT zu begünstigen. Dieses Wissen und eingehendere Forschung kann dazu beitragen, zukünftig neue prognostische Faktoren für das Auftreten venöser Thrombose zu gewinnen und Behandlungsstrategien zu entwickeln, welche die unerwünschten Nebenwirkungen einer alleinigen Hemmung der Blutgerinnung umgehen.

Thu, 23 Apr 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10159/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10159/1/Bernlochner_Maria_Isabell.pdf Bernlochner, Maria Isabell ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakult

Atheromatöse Plaques sind vulnerabel, und deren Ruptur kann die Bildung gefäßverschließender plättchen- und fibrinreicher Thromben induzieren, welche akute Myokardinfarkte und ischämische Schlaganfälle verursachen können. Bisher geht man davon aus, dass der Plaque-„tissue factor“ als Aktivator der extrinsischen Blutgerinnung und Stimulator der Thrombin-vermittelten Plättchenaktivierung und Aggregation die bedeutendste prothrombogene Substanz atheromatöser Läsionen darstellt. Zu Beginn dieser Arbeit war nicht geklärt, ob und wie das lipidreiche atherosklerotische Plaquematerial auch direkt mit den Thrombozyten im Blut interagieren und auf diese Weise die Bildung eines gefäßverschließenden Plättchenthrombus induzieren kann. Die atheromatösen Läsionen von mehr als 60 verschiedenen Patienten mit Karotisstenose wurden mittels Endarterektomie isoliert und Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positive, morphologisch äußerst heterogene Strukturen in den Plaques identifiziert, welche direkt die Adhäsion, Sekretion und Aggregation von Plättchen in Puffer, Plasma und Blut stimulierten. Darüber hinaus lösten die Plaques auch die Bildung von Thrombozyten-Monozyten-Aggregaten sowie eine plättchenbeschleunigte Fibrinbildung und Gerinnung aus. Unter arteriellen Flussbedingungen induzierten die kollagenpositiven Komponenten des Plaquematerials die Adhäsion, das Ausbreiten und die Aggregatbildung der Thrombozyten. Die Plaque-stimulierte Plättchenaggregatbildung erfolgte sehr rasch (< 5 min) und wurde in Hirudin-antikoaguliertem Blut beobachtet, was darauf schließen lässt, dass diese direkt und unabhängig von der Plaque-„tissue factor“-vermittelten Koagulation erfolgte und sehr wahrscheinlich für die initiale und schnelle Thrombusbildung nach einer Plaqueruptur in vivo von Bedeutung ist. Sowohl die Ergebnisse mit humanen, als auch mit murinen Blutplättchen wiesen auf eine essentielle Rolle morphologisch diverser Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positiver Plaquestrukturen und des thrombozytären Kollagenrezeptors GPVI bei der durch atheromatöse Läsionen stimulierten Plättchenformveränderung, Adhäsion, Ausbreitung, Sekretion und Aggregation im statischen System und unter arteriellen Flussbedingungen hin. Der zweite bedeutende thrombozytäre Kollagenrezeptor, das Integrin α2β1, schien hingegen nicht an der durch die atheromatösen Läsionen hervorgerufenen Plättchenadhäsion und Aggregation im statischen System und unter Fluss beteiligt zu sein. Diese Beobachtungen führten zur Annahme, dass die Verabreichung von z. B. spezifischen anti-GPVI-Antikörpern oder löslichem GPVI-Protein, welche die Interaktion des thrombozytären GPVI-Rezeptors mit dessen Liganden im Plaquegewebe (Kollagen Typ I/Typ III) inhibieren, viel versprechende neue und effektive antithrombotische Strategien zur frühen Prävention kardio- und cerebrovaskulärer Gefäßverschlüsse darstellen könnten. Der thrombozytäre VWF-Rezeptor GPIbα war weder im gerührten System, noch unter Fluss mit niedrigeren Scherraten von 500 s-1 von Bedeutung für die durch atheromatöse Plaques induzierte Plättchenaggregation im Blut. Unter arteriellen Flussbedingungen mit höheren Scherraten von 1500 s-1 allerdings resultierte die Blockade von GPIbα in einer starken Reduktion (77±5%) der Plaque-stimulierten Thrombozytenadhäsion und Aggregatbildung. Dies lässt darauf schließen, dass unter diesen Strömungebedingungen auch die Interaktion des VWF mit dem Plättchen-GPIbα-Rezeptor eine wichtige Rolle für die Thrombusbildung nach Plaqueruptur spielt. Sowohl die ADP-Rezeptor-Antagonisten MRS2179 (P2Y1-Antagonist) und AR-C69931MX (P2Y12-Antagonist), als auch Aspirin® konnten die Plaque-vermittelte Thrombozytenaggregation in gerührtem PRP und Blut signifikant verringern, wobei die Kombination aller drei Plättchenhemmer am effektivsten wirkte und die Plaque-induzierte Aggregation vollständig inhibierte. Unter arteriellem Fluss (Scherraten: 1500 s-1) wirkten MRS1279, AR-C69931MX sowie deren Kombination allerdings deutlich weniger effizient als im statischen System und reduzierten die Plaque-stimulierte Plättchenaggregatbildung nur um 35±14%, 32±13% und 58±12%. Überraschender Weise führte die Zugabe von Aspirin® unter Fluss zu keiner signifikanten Reduktion der Plaque-induzierten Thrombozytenaggregatbildung. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass ADP-Rezeptor-Antagonisten sowie Aspirin® die Bildung eines gefäßverschließenden Thrombus nach Plaqueruptur eher ineffizient hemmen dürften. Die atheromatösen Plaquehomogenate verschiedener Patienten wiesen unterschiedliche thrombozytenaktivierende Eigenschaften auf, welche weder auf deren variierenden Gehalt an löslichem Kollagen, noch auf die unterschiedliche Morphologie der Kollagen Typ I- und Kollagen Typ III-positiven Plaquekomponenten zurückgeführt werden konnte. Weiterhin verhielt sich sowohl fibrilläres als auch lösliches Kollagen Typ I und Kollagen Typ III anders als das Plaquematerial bezüglich der Plättchenaggregation im PRP. Die Bindung des thrombozytären GPVI-Rezeptors an das Plaquematerial stellte die Voraussetzung für die Plättchenaktivierung der Plaques dar, wobei jedoch keine eindeutige positive Korrelation zwischen der GPVI-Bindung und der Aktivität der atheromatösen Läsionen verschiedener Patienten hergestellt werden konnte. Der Grund für die unterschiedliche Thrombozytenaktivierung induziert durch das Plaquematerial verschiedener Patienten bleibt letztlich also unklar. Die weitere Erforschung möglicher Ursachen für die unterschiedlichen plättchenaktivierenden Eigenschaften der lipidreichen atheromatösen Läsionen verschiedener Patienten stellt eine interessante und vor allem klinisch relevante zukünftige Fragestellung dar.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde der potentielle Einfluss des endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF) auf Thrombozyten untersucht und geprüft, ob die EDHF Wirkungen durch eine (oder mehrere) Epoxyeicosatriensäuren (Produkte der endothelialen CYP450 Monooxygenase) ausgelöst sein könnten. EDHF wurde bisher hauptsächlich, neben NO und Prostazyklin, als dritter funktionell bedeutender vom Endothel gebildeter vasodilatierender Faktor charakterisiert. Für NO und Prostazyklin ist vielfach eine Freisetzung in das Gefäßlumen und damit neben der lokalen dilatierenden Wirkung auch eine Beeinflussung zirkulierender Blutbestandteile, wie Thrombozyten beschrieben. Beide können die thrombozytäre Aktivierung und Aggregation effektiv hemmen und dadurch gefäßprotektive Wirkungen ausüben. Ob EDHF ebenfalls Blutbestandteile wie Thrombozyten beein-flussen kann, war die Hauptfragestellung dieser Arbeit. Wir konnten erstmals im Bioassay zeigen, dass kultivierte menschliche Endothelzellen (HUVEC) nach entsprechender Stimulation einen EDHF freisetzen, der Thrombozyten hyperpolarisiert. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass dieser Faktor die thrombozytäre Adhäsion an Endothelzellen sowie die thrombozytäre Aktivierung (P-Selektin Expression) hemmte. Diese Effekte waren - analog zu den hyper-polarisierenden Effekten - vermittelt durch Aktivierung von Calcium aktivierbaren Kalium-Kanälen (KCa-Kanäle) mit großer (BKCa) und mittlerer (IKCa) Leitfähigkeit, nicht jedoch von denen mit geringerer (SKCa) Leitfähigkeit. Die beobachteten Hemmeffekte waren durch die EDHF Wirkungen auf das thrombozytäre Membranpotential erklärbar, ein zusätzlicher ergänzender membranpotentialunabhängiger Effekt konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden. Der in unserem Bioassay nachweisbare EDHF zeigte ähnliche Eigenschaften wie exogen verabreichte Epoxyeicosatriensäuren (EETs) - Produkte, die durch die Cytochrom P450 2C8/9 Oxidase im Endothel aus Arachidonsäure gebildet werden. Erhärtet wurden diese Befunde durch eine CYP2C9 stabil überexprimierende Zellinie mit endothelialen Eigenschaften, welche verschiedene EETs in physiologischen Konzen-trationen freisetzte und deren Überstand ähnliche hyperpolarisierende und antiadhäsive Effekte auf Thrombozyten wie der EDHF hatte. EDHF stellte somit unter unseren experimentellen Bedingungen eine Epoxyeicosa-triensäure (oder eine Mischung verschiedener EETs) dar. Bei vielen Herz-Kreislauf Erkrankungen spielen thrombozytäre Aktivierung und Adhäsion eine wichtige Rolle. Insbesondere beim akuten Herzinfarkt, der Haupttodesursache in westlichen Industrieländern, kommt es in patho-physiologisch, z.B. durch Atherosklerose, vorgeschädigten Gefäßen, aufgrund einer arteriellen Thrombusbildung zum kompletten Gefäß-verschluss mit Myokardischämie. Daher könnte EDHF bzw. EET - infolge seiner thrombozytenhyperpolarisierenden und antiadhäsiven Effekte - von großer Bedeutung sein, vor allem, wenn er durch Risikofaktoren wie freie Sauerstoffradikale und Hyperlipidämie weniger stark beeinflusst würde als NO. Die Daten dieser Dissertation könnten somit zukünftiger Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen sowie Basis für die Entwicklung potentiell gefäßprotektiver Medikamente zur effektiveren Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen darstellen.

Akute Koronarerkrankungen stellen direkte Folgen arterieller Thrombosen dar und bilden die Haupttodesursache in den Industrienationen. Einige der molekularen Mechanismen der Pathogenese von arteriellen Thrombosen wurden in den letzten Jahren unter in vitro Bedingungen charakterisiert. Ihre Relevanz im intakten Organismus wird erst durch die Analyse der arteriellen Thrombogenese in vivo ersichtlich. Die bislang etablierten Tiermodelle der Thrombose/Hämostase reflektieren wahrscheinlich nur einen geringen Anteil der bei Patienten mit thrombotischen Erkrankungen beobachteten Veränderungen. Ein Ziel dieser Arbeit bestand daher darin, neue krankheitsrelevante Mausmodelle der Thrombose/Hämostase zu etablieren. Mittels chemischer Mutagenese wurden in Mäusen zufällig über das gesamte Genom verteilte Mutationen induziert und die Fibrinbildung in den Nachkommen geprüft. Ausgehend von phänotypisch auffälligen Tieren konnten mehrere, über Generationen hinweg stabile Mauslinien mit Blutgerinnungsstörungen gezüchtet werden. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde mittels eines arteriellen Thrombosemodelles in der Maus erstmals die Bedeutung von Serinproteasen der neutrophilen Granulozyten für die Thrombusbildung nachgewiesen. Intravitalmikroskopische Untersuchungen in GECGdefizienten Tieren identifizierten diese Serinproteasen als entscheidende Mediatoren für eine stabile Thrombusbildung. Dabei wurde die proteolytische Inaktivierung von TFPI, des Inhibitors des Gerinnungsstartes, durch die Serinproteasen als zugrunde liegender Mechanismus ermittelt. Desweiteren konnte ein zentraler neuer Mechanismus der initialen Gerinnungsaktivierung etabliert werden. Nach endothelialer Schädigung wurde eine massive Freisetzung der Thiol- Isomerase PDI beobachtet, die über die Aktivierung des zentralen gerinnungsstartenden Proteins TF die Fibrinbildung in vivo induzierte. Demzufolge bewirkte die Inhibition der endogenen PDI-Aktivität eine Verminderung der TF-abhängigen Fibrinbildung. Untersuchungen mit TF-positiven Mikropartikeln zeigten, dass PDI intravasalen TF über einen redoxabhängigen Mechanismus aktiviert. Die in der vorliegenden Arbeit aufgedeckten Regulierungsmechanismen der Fibrinbildung in vivo tragen zum Verständnis der komplexen Pathologie der arteriellen Thrombogenese im Menschen bei und weisen daher neue Perspektiven für therapeutische Ansätze auf.

Zur Therapie der Stammveneninsuffizienz stehen seit wenigen Jahren minimal-invasive endoluminale thermische Behandlungsverfahren zur Verfügung, bei welchen die erkrankte Stammvene (V. saphena magna, V. saphena parva) durch Hitze alteriert und durch anschließende Fibrosierungsprozesse obliteriert und damit ausgeschaltet werden soll. Diese modernen thermischen Verfahren haben den Anspruch auf den „Goldstandard“ der chirurgischen Crossektomie mit Stripping der Stammvene zu verzichten. Bei diesen Methoden zur Therapie der Varikosis (Radiofrequenzobliteration - RFO, endovenöse Lasertherapie – ELT) wird die thermische Energie über spezielle endoluminale Radiofrequenzsonden (VNUS-Closure)durch Widerstandserwärmung bzw. durch monochromatisches Licht verschiedener Wellenlängen durch Absorption erzeugt. Die Folgen der thermischen Behandlung (Zellnekrose, Kollagenkontraktion, Wandverdickung, Reduktion des Lumens, Thrombusbildung, Obliteration) können klinisch bzw. duplexsonographisch evaluiert werden. Obwohl diese Verfahren zur klinischen Anwendung zugelassen sind, stehen systematische experimentelle Untersuchungen der thermischen Läsionen nach Radiofrequenz- und Lasertherapie zur Optimierung der Dosimetrie bzw. Evaluation perivaskulärer thermischer Alterationen bisher kaum zur Verfügung. Deshalb wurde hierzu von unserer Arbeitsgruppe ein standardisiertes ex-vivo Modell etabliert, wobei Rindervenen mit den klinisch üblichen Applikationssystemen behandelt und dann vergleichend standardisiert makroskopisch, histologisch und optisch-bildgebend evaluiert wurden. Als ex-vivo Modell dienten Fußamputate von frisch geschlachteten Mastbullen (18-24 Monate, 550-650 Kg, linke hintere Extremität) deren subkutane Venensegmente (V. digitalis dorsalis communis III und V. saphena lateralis) mit einer Gesamtlänge von 23-25cm und einem Durchmesser von 3,5-5,5mm mit den klinisch eingesetzten endoluminalen Therapiesonden kanülierbar sind. Die erste Versuchsreihe diente einer standardisierten makroskopischen perivaskulären und endoluminalen Beurteilung nach Anwendung beider Verfahren unter Einhaltung der vom Gerätehersteller vorgegebenen klinischen Behandlungsparameter. In einer zweiten Versuchsreihe wurden definierte Venensegmente histologisch sowie prä- und postinterventionell mit einem neuen hochauflösenden, bildgebenden optischen Verfahren (Endoluminale Optische Kohärenztomographie – eOCT) untersucht. Die makroskopische Auswertung von jeweils fünf mit RFO und ELT behandelten Rindervenen zeigte nach RFO konstant eine homogene zirkuläre Induration der Venenwand ohne transmurale Defekte, während nach ELT entsprechend der getakteten Illumination und nicht zentrierten Laserfaser stark variierende fokal betonte thermische Läsionen mit Gewebsablation, Karbonisierung bis hin zur periadventitiellen Einblutung und Perforation beobachtet wurden. Im Rahmen der zweiten Versuchsreihe wurden 50mm lange Venensegmente mit RFO und ELT behandelt und neben der makroskopischen Evaluation einer histologischen Untersuchung (HE, 40fach) zugeführt. Für jede Behandlungmethode wurden 20 axiale Schnittbilder vergleichend beurteilt. Dabei zeigte sich in der RFO Gruppe konstant eine komplette Destruktion der Intima mit einer zirkulären gleichmäßigen Alteration der Media unter Ausbildung von spangenartigen Gewebedefekten. Nach ELT wurden je nach Schnittlokalisation Gewebsalterationen mit sehr unterschiedlichem Ausmaß gesehen. Diese reichten von diskreten Gewebeablationen bis hin zu kompletten Wandperforationen. Diese qualitativen Veränderungen konnten in den OCT-Schnittbildern regelhaft reproduziert werden. Der Vergleich korrenspondierender prä- und postinterventioneller OCT Schnittbilder dokumentierte nach beiden Verfahren eine quantifizierbare, statistisch signifikante, thermisch bedingte Kollagenkontraktion bzw. Verdickung der Media. Dieser Effekt war nach RFO deutlicher ausgeprägt als nach ELT. Das hier vorgestellte ex-vivo Modell ist damit geeignet unter Standardbedingungen mit etablierten makroskopischen, histologischen und opitsch-bildgebenden Kriterien endovenöse thermische Behandlungsformen wissenschaftlich reproduzierbar zu evaluieren. Die ersten Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Optimierung der ELT zur Sicherstellung einer gleichmäßigeren zirkulären Energieverteilung und Vermeidung transmuraler Gewebedefekte sinnvoll erscheint.

Im Rahmen des Wissenszuwachses der molekularen Pathophysiologie des Myokardinfarktes konnte in der Vergangenheit gezeigt werden, dass ein Zusammenhang zwischen Thrombozytenadhäsion an freiliegendes Kollagen der Gefäßwand, Thrombozytenaktivierung mit daraus resultierender Thrombembolisierung und schließlich Ausdehnung des durch die Ischämie geschädigten Bereiches besteht. GPVI wird in der aktuellen Literatur als der wesentliche thrombozytäre Oberflächenrezeptor für Kollagen beschrieben: durch die initiale Adhäsion über GPVI kommt es zur Thrombozytenaktivierung und zur Thrombusbildung. Das Ziel dieser Studie war es zum einen, erstmals in einem murinen Ischämie-Reperfusions-Modell den Einfluss des GPVI auf das Infarktgeschehen am Myokard zu untersuchen. Weiterhin sollte der therapeutische Nutzen des soluble GPVI-Fc, einer löslichen klonierten Form des GPVI-Rezeptors, für die Therapie und Prophylaxe eines Myokardinfarktes im Tiermodell geprüft werden. Dazu wurde je einer Gruppe von 10 männlichen Mäusen des Stammes C57Bl/6J mit einen Körpergewicht von 20 bis 30 g eine Stunde prae-interventionell (intravenös) und 12 h (intraperitoneal) nach der künstlich hervorgerufenen Ischämie 100 µg soluble GPVI-Fc bzw. Kontroll-Fc appliziert. Sodann wurden die Tiere mit MMF und zur Erhaltung mit Isofluran anästhesiert. Nach intratrachealer Intubation und lateraler inter-kostaler Thorakotomie im 4. Interkostalraum erhielten beide Gruppen für 30 Minuten eine partielle Myokardischämie durch vollständige Ligatur der linken Koronararterie. Nach 24 Stunden anschließender Reperfusionsphase wurden die Tiere erneut anästhesiert, euthanasiert und die Herzen entnommen. Diese wurden mit 2,3,5-Triphenyltetrazolium-Chlorid (TTC) und Evansblue so gefärbt, dass Area at risk (AAR), Infarkt (I) und Area not at risk (AnAR) unterschieden werden können. Anschließend wurden die Herzen geschnitten und die ca. 1mm starken Schnitte photographiert, um die Infarktgröße planimetrisch zu bestimmen. Außerdem wurde die Herzfunktion beider Gruppen prae- und postoperativ echokardiographisch untersucht. Trotz gleichgroßer Area at risk beider Gruppen konnte in der Soluble-GPVI-Fc-Gruppe die planimetrisch ermittelte Infarktgröße I/AAR (16,17±11,31%) gegenüber der Fc-Kontrollgruppe (31,12 ±13 %) signifikant (Signifikanzniveau p=0,019) reduziert werden. Bei der Echokardiographie war allerdings kein signifikanter Unterschied in der Herzfunktion beider Gruppen festzustellen. Die in dieser Studie erreichte Reduktion der Infarktgröße durch die beschriebene Intervention zeigt erstmals die Möglichkeit eines therapeutischen Nutzens für soluble GPVI-Fc durch Blockade der initialen Thrombozytenadhäsion und Aktivierung der Thrombozyten für die Prävention und Behandlung des Myokardinfarktes auf.