Podcasts about Epitope

“We cannot be dogmatic about what we say about epinephrine…we need as a field to stop being so dogmatic and do more studies to understand."   -- Dr. Matthew GreenhawtJoin us on this eye-opening episode, where we explore the latest breakthroughs in allergy and immunology with Dr. Matthew Greenhawt as he walks us through the pivotal articles of 2023 that are redefining the field.On this episode:Review penicillin allergy delabeling and why this is ready to incorporate into your medical practice.Understand the evidence for various atopic dermatitis treatment strategies using evidence-based graded recommendations.Discover the potential of dupilumab in its two newest indications - eosinophilic esophagitis and COPD. Delve into our latest understanding of epinephrine doses and future directions in research on this fundamental medication.Exclusive insights into the EPITOPE trial from the lead author.This episode is a must-listen for allergists and immunologists looking for a quick literature review and key highlights from 2023. Tune in now for a journey into the heart of the articles that will change the field of allergy!Links to articles mentioned in the episode:The Safety of the Direct Drug Provocation Test in Beta-Lactam Hypersensitivity in Children: A Systematic Review and Meta-Analysis - PubMed (nih.gov) Atopic dermatitis (eczema) guidelines: 2023 American Academy of Allergy, Asthma and Immunology/American College of Allergy, Asthma and Immunology Joint Task Force on Practice Parameters GRADE- and Institute of Medicine-based recommendations - PubMed (nih.gov)Dupilumab in Adults and Adolescents with Eosinophilic Esophagitis - PubMed (nih.gov)Dupilumab for COPD with Type 2 Inflammation Indicated by Eosinophil Counts - PubMed (nih.gov)Optimal dose of adrenaline auto-injector for children and young people at risk of anaphylaxis: A phase IV randomized controlled crossover study - PubMed (nih.gov)Phase 3 Trial of Epicutaneous Immunotherapy in Toddlers with Peanut Allergy - PubMed (nih.gov)Visit the Canadian Society of Allergy and Clinical ImmunologyFind an allergist using our helpful toolFind Dr. Hanna on X, previously Twitter, @PedsAllergyDoc or CSACI @CSACI_caThe Allergist is produced for CSACI by PodCraft Productions

This week, Catriona tells us about exciting new developments in using chimaeric antigen receptor (CAR) T cells against all forms of blood cancer; and Chris shares what physics can tell us about hand clapping, particularly the best way to clap for measuring acoustics.Wellhausen et al. 2023 “Epitope base editing CD45 in hematopoietic cells enables universal blood cancer immune therapy”: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.adi1145(See also https://www.pennmedicine.org/news/news-releases/2023/august/an-immunotherapy-strategy-against-all-blood-cancers)Papadakis & Stavroulakis 2020 "Handclap for Acoustic Measurements: Optimal Application and Limitations: https://doi.org/10.3390/acoustics2020015Fletcher 2013 “Shock waves and the sound of a hand-clap – A simple model”: http://www.acoustics.asn.au/journal/2013/2013_41_2_Fletcher_paper.pdfMann et al. 2013 “The dynamics of audience applause”: https://doi.org/10.1098/rsif.2013.0466

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.04.20.537636v1?rss=1 Authors: Davies, F. C. J., Marshall, G. F., Gadd, D. A., Abbott, C. M. Abstract: All vertebrate species express two independently-encoded forms of translation elongation factor eEF1A. In humans and mice eEF1A1 and eEF1A2 are 92% identical at the amino acid level, but the well conserved developmental switch between the two variants in specific tissues suggests the existence of important functional differences. Heterozygous mutations in eEF1A2 result in neurodevelopmental disorders in humans; the mechanism of pathogenicity is unclear, but one hypothesis is that there is a dominant negative effect on eEF1A1 during development. The high degree of similarity between the eEF1A proteins has complicated expression analysis in the past; here we describe a gene edited mouse line in which we have introduced a V5 tag in the gene encoding eEF1A2. Expression analysis using anti-V5 and anti-eEF1A1 antibodies demonstrates that, in contrast to the prevailing view that eEF1A2 is only expressed postnatally, it is expressed from as early as E11.5 in the developing neural tube. Two colour immunofluorescence also reveals coordinated switching between eEF1A1 and eEF1A2 in different regions of postnatal brain. Completely reciprocal expression of the two variants is seen in post-weaning mouse brain with eEF1A1 expressed in oligodendrocytes and astrocytes and eEF1A2 in neuronal soma. Although eEF1A1 is absent from neuronal cell bodies after development, it is widely expressed in axons. This expression does not appear to coincide with myelin sheaths originating from oligodendrocytes but rather results from localised translation within the axon, suggesting that both variants are transcribed in neurons but show completely distinct subcellular localisation at the protein level. These findings will form an underlying framework for understanding how missense mutations in eEF1A2 result in neurodevelopmental disorders. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.13.519845v1?rss=1 Authors: Goswami, D., Arredondo, S. A., Betz, W., Armstrong, J., Oualim, K. M. Z., Seilie, A. M., Murphy, S. C., Kappe, S. H. I., Vaughan, A. M. Abstract: Malaria, the disease caused by Plasmodium parasites, causes significant mortality and morbidity. Whole parasite vaccination with pre-erythrocytic parasite stages, attenuated through sporozoite irradiation or chemo-attenuation, confers sterilizing immunity against subsequent parasite infection. This provides a rationale for the creation of whole parasite vaccines that are attenuated using gene editing. Here, we report on the creation of a novel genetically attenuated parasite (GAP) by the deletion of Plasmodium LINUP, encoding a liver stage nuclear protein. Epitope-tagging of LINUP in the rodent malaria parasite Plasmodium yoelii showed LINUP expression exclusively in liver stage nuclei after the onset of exo-erythrocytic schizogony. P. yoelii parasites with a gene deletion of LINUP (linup--) suffered an exclusive liver stage phenotype with developmental arrested late in exo-erythrocytic schizogony. Liver stages showed incomplete segregation of nuclei and, mitochondria and apicoplast. These cellular perturbations caused a defect in exo-erythrocytic merozoite formation and a concomitant severe attenuation of liver stage-to-blood stage transition. LINUP gene deletion in Plasmodium falciparum also caused a severe defect in late liver stage differentiation. Importantly, P. falciparum linup-- liver stages showed a severe defect in parasite transitioning from liver stage to viable blood stage infection. These results suggest that P. falciparum LINUP is a useful target for late liver stage attenuation and an additional gene deletion that can be incorporated into a late liver stage-arresting replication competent whole parasite vaccine. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.11.22.517482v1?rss=1 Authors: Wallace, M., Fedorchak, G. R., Agrawal, R., Gilbert, R. M., Patel, J., Park, S., Paszek, M., Lammerding, J. Abstract: Lamins A/C are nuclear intermediate filament proteins that are involved in diverse cellular mechanical and biochemical functions. Here, we report that recognition of Lamins A/C by a commonly used antibody (JOL-2) that binds the Lamin A/C Ig-fold and other antibodies targeting similar epitopes is highly dependent on cell density, even though Lamin A/C protein levels do not change with cell density. The density-dependent Lamin A/C labeling was distinct from previously reported differential apico-basal labeling, which was independent of cell density. Comparison of the density-dependent labeling effects of antibodies recognizing different Lamin A/C epitopes suggests that the effect is caused by partial unfolding or masking of the C'E and/or EF loops of the Ig-fold in response to cell spreading. Seeding cells on micropatterned surfaces with different areas confirmed that increased cell spreading resulted in reduced Lamin A/C labeling with the JOL-2 antibody. Surprisingly, JOL-2 antibody labeling was insensitive to depolymerization of cytoskeletal filaments or disruption of the Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) complex. Although the density-dependent changes of the Ig-fold did not alter nuclear stiffness or nucleo-cytoskeletal force transmission, they may nonetheless modulate interaction with lamin binding partners and thereby affect cellular functions. Taken together, our results point to a previously unrecognized change in the Lamin A/C Ig-fold that affects recognition by the JOL-2 antibody. These findings are not only important for the interpretation of immunofluorescence data for Lamin A/C, but also raise the intriguing prospect that the conformational changes may play a role in Lamin A/C mediated cellular function. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

We earlier isolated 10 single-domain antibodies (VHHs) that specifically bind intact (146S) FMDV particles but not the (12S) degradation products of serotype A strain A/TUR/14/98. Such 12S particles are much less immunogenic than 146S particles. As a result, the 146S particle specific VHHs are useful tools for quality control of FMDV antigens used in vaccines. Conventional monoclonal antibodies (mAbs) were shown to bind at least 5 independent antigenic sites by competition ELISAs and sequencing of mutants that are resistant to neutralization by mAbs. Escape mutants of serotype A binding 146S specific mAb 9 had mutations in VP3, near the 2-fold symmetry axis where separate 12S particles join into a 146S particle. This suggests that 146S specificity is caused by the epitope lying on two adjacent 12S pentamers that is separated by 146S particle dissociation. However, cryo EM structural analysis the serotype O 146S specific VHH M170 showed that it recognizes a loop on VP3 that has a different 3D structure in the 12S particle compared to the 146S particle. This change in conformation most likely causes the 146S particle specificity. To further understand the mechanism of 146S specificity, we mapped the antigenic sites of serotype A binding VHHs by competition ELISAs, VNTs and cross-linking mass spectrometry. By Haozhou Li

There are seven antigenically distinct FMDV serotypes; O, A, C, Asia1, SAT1, SAT2 & SAT3, with no cross protection between serotypes. There are five known antigenic sites on the FMDV capsid against which neutralizing antibodies bind to confer protection against the viral infection. VP1 contains the virus attachment motif (RGD) on the G-H loop that binds to the cellular receptor integrin for all the seven serotypes known and carries the serotype specific immune dominant epitope which is part of antigenic site 1. It has been shown that the RGD motif is not an essential constituent of peptides able to elicit neutralising antibody responses against the virus (Brown et al., 1999). Monoclonal antibody (Mab) D9 is a neutralising Mab that binds to the linear immune dominant epitope of G-H loop, where for serotype O, its neutralising activities are affected by the changes at amino acid positions VP1 (L144, L148 and K154). In this study we hypothesised that there are two different types of epitopes on the G-H loop, one is conserved between serotypes, and non-neutralising, while the second epitope is neutralising and serotype specific.

Time to locate the areas of attack. My Website: https://dairyfreedudeid.wixsite.com/mysite

Amy returns to TWiV to discuss her work on the identification of cross-reactive antibody responses among diverse enteroviruses, and the implications for our understanding of viral pathogenesis and seroprevalence studies. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Rich Condit Brianne Barker, and Amy Rosenfeld Subscribe (free): Apple Podcasts, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode ABRCMS ePoster Spring Symposium for Emerging Scientists Cross-reactive enterovirus antibodies (mBio) Poliovirus receptor transgenic mice (virology blog) Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Dickson – European scientists set new record in production of nuclear fusion energy Amy – Alfredo's Magic Wand Brianne – What Happened After the Chicken-Pox Vaccine? Rich – Year Three of COVID-19: Harsh Truths, Realities, and Glimmers of Hope Vincent – Economists Are Fueling the War Against Public Health Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Amy returns to TWiV to discuss her work on the identification of cross-reactive antibody responses among diverse enteroviruses, and the implications for our understanding of viral pathogenesis and seroprevalence studies. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Rich Condit Brianne Barker, and Amy Rosenfeld Subscribe (free): Apple Podcasts, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode ABRCMS ePoster Spring Symposium for Emerging Scientists Cross-reactive enterovirus antibodies (mBio) Poliovirus receptor transgenic mice (virology blog) Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Dickson – European scientists set new record in production of nuclear fusion energy Amy – Alfredo's Magic Wand Brianne – What Happened After the Chicken-Pox Vaccine? Rich – Year Three of COVID-19: Harsh Truths, Realities, and Glimmers of Hope Vincent – Economists Are Fueling the War Against Public Health Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

TWiV kicks off 2022 with a review of the virology highlights of 2021, from three virologists, one immunologist, a science writer, and a partridge in a pear tree. Hosts: Vincent Racaniello, Alan Dove, Rich Condit, Kathy Spindler, and Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode COVID vaccines: TWiV 708, 715, 718, 844 Non-CoV papers: TWiV 763, 784, 819, 822, 740, 848 Immune correlates of protection: TWiV 791, 799, 835, 832, 841, 789 Fitness: TWiV 705, 836, 768, 757 Guests off beaten track: 723, 726, 732, 838, 773, 745 Lab leak nonsense: TWiV 762, 774 One Health/Viruses in Wildlife: TWiV 799, 722, 771, 809, 798, 759, 791, 847, 750, 821, 824, 804 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Brianne – Don't Look Up Kathy – spaceweather.com Rich – Video of a Green Flash  (wiki) Alan – Fungally-modified violins Vincent – This Old Tony especially this segment Listener Picks Paul – Deep Mind and AlphaFold Grant – SARS-CoV-2 reproduction cycle Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

TWiV kicks off 2022 with a review of the virology highlights of 2021, from three virologists, one immunologist, a science writer, and a partridge in a pear tree. Hosts: Vincent Racaniello, Alan Dove, Rich Condit, Kathy Spindler, and Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode COVID vaccines: TWiV 708, 715, 718, 844 Non-CoV papers: TWiV 763, 784, 819, 822, 740, 848 Immune correlates of protection: TWiV 791, 799, 835, 832, 841, 789 Fitness: TWiV 705, 836, 768, 757 Guests off beaten track: 723, 726, 732, 838, 773, 745 Lab leak nonsense: TWiV 762, 774 One Health/Viruses in Wildlife: TWiV 799, 722, 771, 809, 798, 759, 791, 847, 750, 821, 824, 804 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Brianne – Don't Look Up Kathy – spaceweather.com Rich – Video of a Green Flash  (wiki) Alan – Fungally-modified violins Vincent – This Old Tony especially this segment Listener Picks Paul – Deep Mind and AlphaFold Grant – SARS-CoV-2 reproduction cycle Intro music is by Ronald Jenkees Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Shane Crotty returns to TWiV to review the immunology of COVID-19, including differences between infection and vaccination, increased breadth of antibodies after infection followed by vaccination, the roles of T cells, and whether booster vaccinations are needed. Hosts: Vincent Racaniello, Rich Condit, Kathy Spindler, and Brianne Barker Guest: Shane Crotty Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode ASV Vaccine Town Halls SARS-CoV-2 immune memory 8 months post-infection (Science) SARS-CoV-2 T cell epitopes (Cell Host Microbe) Letters read on TWiV 802 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Brianne – How the cat gets its stripes Kathy – Kurzgesagt on Giruses (giant viruses) and beautiful APOD Rich – The 1911 Triangle Factory Fire; Triangle: The Fire That Changed America by David Von Drehle Vincent – Two Top F.D.A. Vaccine Regulators Are Set to Depart During a Crucial Period Listener Picks Debby – River Runner Lin – Your Vaccinated Immune System Is Ready for Breakthroughs Intro music is by Ronald Je Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Shane Crotty returns to TWiV to review the immunology of COVID-19, including differences between infection and vaccination, increased breadth of antibodies after infection followed by vaccination, the roles of T cells, and whether booster vaccinations are needed. Hosts: Vincent Racaniello, Rich Condit, Kathy Spindler, and Brianne Barker Guest: Shane Crotty Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode ASV Vaccine Town Halls SARS-CoV-2 immune memory 8 months post-infection (Science) SARS-CoV-2 T cell epitopes (Cell Host Microbe) Letters read on TWiV 802 Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Picks Brianne – How the cat gets its stripes Kathy – Kurzgesagt on Giruses (giant viruses) and beautiful APOD Rich – The 1911 Triangle Factory Fire; Triangle: The Fire That Changed America by David Von Drehle Vincent – Two Top F.D.A. Vaccine Regulators Are Set to Depart During a Crucial Period Listener Picks Debby – River Runner Lin – Your Vaccinated Immune System Is Ready for Breakthroughs Intro music is by Ronald Je Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Den vollständigen Standpunkte-Text (inkl ggf. Quellenhinweisen und Links) findet ihr hier: https://kenfm.de/die-popel-epidemiologie-von-wolfgang-wodarg Ein Standpunkt von Wolfgang Wodarg. Früher betrachtete man sie als gesund und ließ sie in Ruhe: Kinder, die keine Symptome zeigten, deren Nase höchstens ein bisschen lief, gehörten zum Alltag an Schulen. Heute ist jeder ein potenzieller Überträger einer Tod bringenden Krankheit. Man heilt keine Krankheiten, sondern fahndet nach verborgenen Infektionen und treibt so die Fallzahlen nach oben, hält das Land dauerhaft in Angst. Das brüsk in ein kindliches Nasenloch gerammte Wattestäbchen ist zum Symbolgegenstand unserer Zeit geworden. Dr. Wolfgang Wodarg, dessen neues Buch „Falsche Pandemien. Argumente gegen die Herrschaft der Angst“ in diesen Tagen im Rubikon-Verlag erscheint, ist ein erfahrener und unerschrockener Wissenschaftsrebell der ersten Stunde. Viel angefeindet, blieb er seinen einmal für richtig erkannten Thesen treu und spezifiziert sie nun in den Tagen von Massen-Zwangstests und aufdringlichen Impfkampagnen. Er dekonstruiert die irreführenden Zahlenspiele der Angstmacher und zeigt, welche Gefahr von den — speziell für Kinder — völlig unnötigen Impfungen für die Gesundheit ausgehen. Der schwedische Gesundheitsdienst hat am 29. April 2021 nach erneuten ausführlichen Konsultationen mit den zuständigen Fachgesellschaften bestätigt: „Die PCR-Technologie, die in Tests zum Nachweis von Viren verwendet wird, kann nicht zwischen Viren, die in der Lage sind, Zellen zu infizieren, und Viren, die vom Immunsystem inaktiviert wurden, unterscheiden, und daher können diese Tests nicht verwendet werden, um festzustellen, ob jemand infektiös ist oder nicht.“ Die Schweden setzen zur Infektionskontrolle vor allem auf klinische Parameter und entscheiden danach über entsprechende Beratung für Infektiöse und deren Umgebung (1). Tests bei Gesunden oder Symptomlosen gelten in Schweden als unsinnig, so wie bis vor eineinhalb Jahren in Deutschland und anderen Teilen der Welt ja auch. Der deutschen Bevölkerung werden jetzt andere Regeln auferlegt. Sie werden den Menschen nicht von Fachgesellschaften, sondern von der Politik zugemutet. Dabei umgehen Bundesregierung und Länderchefs sogar die Möglichkeit, ihre eigenen hochqualifizierten wissenschaftlichen Nutzenbewerter einzuschalten (2). Erstaunlicherweise hat man bei uns heutzutage etwas eigentlich Selbstverständliches aus den Augen verloren: Wer zum Beispiel als Kind, Jugendlicher oder als Lehrkraft zum Unterricht geht, der ist normalerweise nicht krank. Deshalb werden mit den Testorgien in deutschen Ländern grundsätzlich normal leistungsfähige Lehrkräfte und vor allem Kinder untersucht, denen höchstens mal die Nase läuft. Diese Kinder gehören — besonders im Winter — auch in den Klassenräumen schon immer dazu. Sie durchleben schon immer ohne ernste Probleme die ersten Kontakte mit zahlreichen Atemwegsviren, tauschen diese untereinander aus und werden dadurch für viele Jahre gegen sie immun. Wenn sie nach Hause kommen, lassen sie regelmäßig auch ihre Familie an diesem Immuntraining teilnehmen. Obwohl es sich dabei um Influenza-, Parainfluenza-, Rhino-, Adeno-, RS-, Metapneumo- und eben auch Coronaviren handelt, führt das nur in sehr seltenen Fällen zu stärkeren Symptomen, sondern eher zu Husten, Schnupfen, Heiserkeit. Die allermeisten merken von ihren Viruskontakten jedoch gar nichts. Aus diesen unterschiedlich intensiven, aber regelmäßigen natürlichen Begegnungen resultiert eine zelluläre, langanhaltende Herdenimmunität gegen alles, was so ähnlich aussieht wie die kontaktierten Viren (Kreuzimmunität) (3). In einer Übersichtsarbeit aus dem berühmten La Jolla Institute (4) in San Diego werden 1.434 unterschiedliche Epitope (molekulare Merkmale) bei SARS-CoV-2-Viren aufgeführt, die gegebenenfalls von unseren T-Zellen erkannt werden und eine Abwehrreaktion auslösen. Also auch die immer wieder neuen Mutanten haben keine Chance. Es war und ist unstrittig, dass junge wie ältere Menschen beim Auftreten von Symptomen sich erst einmal auskurieren sollten, bevor sie wieder unter Leute gehen. In früheren Jahren wurde aber kaum einmal ein Kind nur wegen laufender Nase oder etwas Husten nach Hause geschickt. Es waren natürlich schon immer diese kleinen munteren „Superspreader“, welche die Viren allen anderen zugänglich gemacht haben und auch zu Hause bei Eltern und Großeltern für Viren-Updates sorgten. Die derzeitigen popeligen Präventionsmaßnahmen wären vor zwei Jahren wohl noch als Zumutung vom Schulhof gejagt worden. Und das wäre auch weiterhin berechtigt. Nun sind aber die Menschen in vielen Ländern durch Regierungen, Medien und andere Profiteure der Angst — anders als in Schweden — immer noch darauf konditioniert, nicht Kranke, sondern positive Testergebnisse als Zeichen einer Bedrohung wahrzunehmen. Wer die Freiheiten der Menschen durch Bangemachen einschränken möchte, der braucht also gar keine Kranken. Es reicht aus, genügend viele Tests dort zu machen, wo vermutlich viele positive Ergebnisse zu erwarten sind. Derzeit sind die Labore in Deutschland mit wöchentlich über 1 Million PCR-Tests bereits stark belastet. Hinzu kommen die Antigen-Selbsttests. Die Deutsche Gesellschaft für Kinder- und Jugendmedizin e.V. warnte in ihrer Stellungnahme vom 26. März 2021 (5) vor einer wöchentlich zu erwartenden halben Million falsch positiver Tests:…weiterlesen hier: https://kenfm.de/die-popel-epidemiologie-von-wolfgang-wodarg +++ KenFM jetzt auch als kostenlose App für Android- und iOS-Geräte verfügbar! 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Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.09.375204v1?rss=1 Authors: Kosaloglu-Yalcin, Z., Lee, J., Nielsen, M., Greenbaum, J., Schoenberger, S. P., Miller, A., Kim, Y. J., Sette, A., Peters, B. Abstract: MHC class I antigen processing consists of multiple steps that result in the presentation of MHC bound peptides that can be recognized as T cell epitopes. Many of the pathway steps can be predicted using computational methods, but one is often neglected: mRNA expression of the epitope source proteins. In this study, we improve epitope prediction by taking into account both peptide-MHC binding affinities and expression levels of the peptide's source protein. Specifically, we utilized biophysical principles and existing MHC binding prediction tools in concert with RNA expression to derive a function that estimates the likelihood of a peptide being presented on a given MHC class I molecule. Our combined model of Antigen eXpression based Epitope Likelihood-Function (AXEL-F) outperformed predictions based only on binding or based only on antigen expression for discriminating eluted ligands from random background peptides as well as in predicting neoantigens that are recognized by T cells. We also showed that in cases where cancer patient-specific RNA-Seq data is not available, cancer-type matched expression data from TCGA can be used to accurately estimate patient-specific gene expression. Using AXEL-F together with TGCA expression data we were able to more accurately predict neoantigens that are recognized by T cells. The method is available in the IEDB Analysis Resource and free to use for the academic community. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.09.374082v1?rss=1 Authors: Musico, A., Frigerio, R., Mussida, A., Barzon, L., Sinigaglia, A., Riccetti, S., Gobbi, F., Piubelli, C., Bergamaschi, G., Chiari, M., Gori, A., Cretich, M. Abstract: A workflow for SARS-CoV-2 epitope discovery on peptide microarrays is herein reported. The process started with a proteome-wide screening of immunoreactivity based on the use of a high-density microarray followed by a refinement and validation phase on a restricted panel of probes using microarrays with tailored peptide immobilization through a click-based strategy. Progressively larger, independent cohorts of Covid-19 positive sera were tested in the refinement processes, leading to the identification of immunodominant regions on SARS-CoV-2 Spike (S), Nucleocapsid (N) protein and Orf1ab polyprotein. A summary study testing 50 serum samples highlighted an epitope of the N protein (region 155-171) providing 92% sensitivity and 100% specificity of IgG detection in Covid-19 samples thus being a promising candidate for rapid implementation in serological tests. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.08.373092v1?rss=1 Authors: Mohabati, R., Rezaei, R., Mohajel, N., Ranjbar, M. M., Azadmanesh, K., Roohvand, F. Abstract: Producing a functional consensus sequence is a preliminary bioinformatics task, which is a necessity for many research purposes. However, the existence of hypervariable regions in the input multiple sequence alignment files causes complications in generating a useful consensus sequence. The current methods for consensus generation, Threshold, and majority algorithms, have several problems, which exclude them as applicable algorithms for such highly variable sequence clusters. Hence, we designed a novel alternative algorithm for the same purpose. The algorithm was explained both using a mathematical formula and a practical implementation in Python programming language. A sequence set from HCV genotype 1b E2 protein has been utilized as a practical example for evaluating the performance of the algorithm. A few in silico tests have been performed on the output sequence and the results have been compared to results from other algorithms. Epitope-mapping analysis indicates the functionality of this algorithm, by preserving the hotspot residues in the consensus sequence, and the antigenicity index shows significant antigenicity of the consensus sequence. Moreover, phylogenetic analysis shows no significant change in the placement of the new consensus sequence on the phylogenetic tree compared to other algorithms. This approach will have several implications in designing a new vaccine for highly variable viruses such as HIV-1, Influenza, and Hepatitis C Viruses (HCV). Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

In this podcast first recorded at the 2020 IO360° Summit, Asthika Goonewardene, SunTrust Robinson Humphrey, moderated a cancer immunotherapy debate on insitu vaccinations vs systemic neo-epitope vaccinations. Participants included: Charles Drake, MD, PhD, Columbia University Medical Center Karin Jooss, PhD, Gritstone Oncology To learn more about the upcoming 2021 IO360° Summit, please visit www.io360summit.com

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.06.325969v1?rss=1 Authors: Tamura-Sakaguchi, R., Aruga, R., Hirose, M., Ekimoto, T., Miyake, T., Hizukuri, Y., Oi, R., Kaneko, M. K., Kato, Y., Akiyama, Y., Ikeguchi, M., Iwasaki, K., Nogi, T. Abstract: Antibody labeling has been extensively conducted for structure determination in both x-ray crystallography and EM analysis. However, establishing target-specific antibodies is a prerequisite for applying antibody-assisted structural analysis. To expand the applicability of this strategy, we have developed an alternative method to prepare an antibody-complex by inserting an exogenous epitope into the target. We here demonstrated that the Fab of monoclonal antibody NZ-1 could form a stable complex with the target containing an inserted PA14 tag as an epitope. By adopting a closed ring-like conformation inside the antigen-binding pocket, the inserted PA14 tag had less impact on the folding of the target. In fact, the PA14 tag could also be inserted into the sterically hindered loop for labeling. Using the improved labeling technique, we performed negative-stain EM on a bacterial site-2 protease, which enabled us to approximate the domain arrangement based on the docking mode of the NZ-1 Fab. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.09.14.296392v1?rss=1 Authors: Sabban, S. S. Abstract: Due to the increased hygienic life style of the developed world allergy is an increasing disease. Once allergy develops, sufferers are permanently trapped in a hyper immune response that makes them sensitive to innocuous substances. This paper discusses the strategy and protocol employed which designed proteins displaying a human IgE motif very close in proximity to the IgE's Fc{epsilon}RI receptor binding site. The motif of interest was the FG motif and it was excised and grafted onto the protein scaffold 1YN3. The new structure (scaffold + motif) was fixed-backbone sequence designed around the motif to find an amino acid sequence that would fold to the designed structure correctly. Ten computationally designed proteins showed successful folding when simulated using the AbinitioRelax folding simulation and the IgE epitope was clearly displayed in its native three dimensional structure in all of them. Such a designed protein has the potential to be used as a pan anti-allergy vaccine by guiding the immune system towards developing antibodies against this strategic location on the body's own IgE molecule, thus neutralising it and presumably permanently shutting down a major aspect of the Th2 immune pathway. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.09.09.287771v1?rss=1 Authors: Mohammed, A. A., Elkhalifa, M. E., Elamin, K. E., Mohammed, R. A., Ibrahim, M. E., Dirar, A. I., Migdar, S. H., Hamid, M. A., Elawad, E. H., Abdelsalam, S. O., Hassan, M. A. Abstract: Background: Lujo virus LUJV is a highly fatal human pathogen belonging to the Arenaviridae family. Lujo virus causes viral hemorrhagic fever VHF. An In silico molecular docking was performed on the GPC domain of Lujo virus in complex with the first CUB domain of neuropilin-2. The aim of this study is to predict effective epitope-based vaccine against glycoprotein GPC precursor of Lujo virus using immunoinformatics approaches. Methods and Materials: glycoprotein GPC precursor of Lujo virus Sequence was retrieved from NCBI. Different prediction tools were used to analyze the nominees epitopes in BepiPred-2.0: Sequential B-Cell Epitope Predictor for B-cell, T-cell MHC class II & I. Then the proposed peptides were docked using Autodock 4.0 software program. Results and Conclusions: The proposed and promising peptides FWYLNHTKL and YMFSVTLCI show a very strong binding affinity to MHC class I & II alleles with high population coverage for the world, South Africa and Sudan. This indicates a strong potential to formulate a new vaccine especially with the peptide YMFSVTLCI which is likely to be the first proposed epitope-based vaccine against glycoprotein GPC of the Lujo virus. This study recommends an in-vivo assessment for the most promising peptides especially FWYLNHTKL, YMFSVTLCI and LPCPKPHRLR. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.09.09.289355v1?rss=1 Authors: Meysman, P., Postovskaya, A., De Neuter, N., Ogunjimi, B., Laukens, K. Abstract: Much is still not understood about the human adaptive immune response to SARS-CoV-2, the causative agent of COVID-19. In this paper, we demonstrate the use of machine learning to classify SARS-CoV-2 epitope specific T-cell clonotypes in T-cell receptor (TCR) sequencing data. We apply these models to public TCR data and show how they can be used to study T-cell longitudinal profiles in COVID-19 patients to characterize how the adaptive immune system reacts to the SARS-CoV-2 virus. Our findings confirm prior knowledge that SARS-CoV-2 reactive T-cell diversity increases over the course of disease progression. However our results show a difference between those T cells that react to epitope unique to SARS-CoV-2, which show a more prominent increase, and those T cells that react to epitopes common to other coronaviruses, which begin at a higher baseline. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.08.27.269456v1?rss=1 Authors: Agarwal, V., Tiwari, A., Varadwaj, P. K. Abstract: The emergence of COVID-19 as a pandemic with a high morbidity rate is posing serious global concern. There is an urgent need to design a suitable therapy or vaccine that could fight against SARS-CoV-2 infection. As spike glycoprotein of SARS-CoV-2 plays a crucial role in receptor binding and membrane fusion inside the host, it could be a suitable target for designing of an epitope-based vaccine. SARS-CoV-2 is an RNA virus and thus has a property to mutate. So, a conserved peptide region of spike glycoprotein was used for predicting suitable B cell and T cell epitopes. 4 T cell epitopes were selected based on stability, antigenicity, allergenicity and toxicity. Further, MHC-I were found from the immune database that could best interact with the selected epitopes. Population coverage analysis was also done to check the presence of identified MHC-I, in the human population of the affected countries. The T cell epitope that binds with the respective MHC-I with highest affinity was chosen. Molecular dynamic simulation results show that the epitope is well selected. This is an in-silico based study that predicts a novel T cell epitope from the conserved spike glycoprotein that could act as a target for designing of the epitope-based vaccine. Further, B cell epitopes have also been found but the main work focuses on T cell epitope as the immunity generated by it is long lasting as compared to B cell epitope. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.08.26.267997v1?rss=1 Authors: Mazzocco, G., Niemiec, I., Myronov, A., Skoczylas, P., Kaczmarczyk, J., Sanecka-Duin, A., Gruba, K., Krol, P., Drwal, M., Szczepanik, M., Pyrc, K., Stepniak, P. Abstract: The heavy burden imposed by the COVID-19 pandemic on our society triggered the race towards the development of therapies or preventive strategies. Among these, antibodies and vaccines are particularly attractive because of their high specificity, low probability of drug-drug interaction, and potentially long-standing protective effects. While the threat at hand justifies the pace of research, the implementation of therapeutic strategies cannot be exempted from safety considerations. There are several potential adverse events reported after the vaccination or antibody therapy, but two are of utmost importance: antibody-dependent enhancement (ADE) and cytokine storm syndrome (CSS). On the other hand, the depletion or exhaustion of T-cells has been reported to be associated with worse prognosis in COVID-19 patients. This observation suggests a potential role of vaccines eliciting cellular immunity, which might simultaneously limit the risk of ADE and CSS. Such risk was proposed to be associated with FcR-induced activation of proinflammatory macrophages (M1) by Fu et al. 2020 and Iwasaki et al. 2020. All aspects of the newly developed vaccine (including the route of administration, delivery system, and adjuvant selection) may affect its effectiveness and safety. In this work we use a novel in silico approach (based on AI and bioinformatics methods) developed to support the design of epitope-based vaccines. We evaluated the capabilities of our method for predicting the immunogenicity of epitopes. Next, the results of our approach were compared with other vaccine-design strategies reported in the literature. The risk of immuno-toxicity was also assessed. The analysis of epitope conservation among other Coronaviridae was carried out in order to facilitate the selection of peptides shared across different SARS-CoV-2 strains and which might be conserved in emerging zootic coronavirus strains. Finally, the potential applicability of the selected epitopes for the development of a vaccine eliciting cellular immunity for COVID-19 was discussed, highlighting the benefits and challenges of such an approach. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Immune explains a study demonstrating T cells that react with SARS-CoV-2 epitopes in individuals who have never been infected with the virus, implying cross-reactivity with common cold coronaviruses. Hosts: Vincent Racaniello and Cynthia Leifer Guest: Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts. RSS, email Become a patron of Immune! Links for this episode Cross-reactive coronavirus CD4+ T cells (Science) Immune misfiring in severe COVID-19 (Nature) A COVID-19 riddle for the immune system (Nature) Letters read on Immune 34 Time stamps by Jolene. Thanks! Music by Steve Neal. Immune logo image by Blausen Medical Send your immunology questions and comments to immune@microbe.tv

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.08.14.251496v1?rss=1 Authors: Ong, E., Huang, X., Pearce, R., Zhang, Y., He, Y. Abstract: The current COVID-19 pandemic caused by SARS-CoV-2 has resulted in millions of confirmed cases and thousands of deaths globally. Extensive efforts and progress have been made to develop effective and safe vaccines against COVID-19. A primary target of these vaccines is the SARS-CoV-2 spike (S) protein, and many studies utilized structural vaccinology techniques to either stabilize the protein or fix the receptor-binding domain at certain states. In this study, we extended an evolutionary protein design algorithm, EvoDesign, to create thousands of stable S protein variants without perturbing the surface conformation and B cell epitopes of the S protein. We then evaluated the mutated S protein candidates based on predicted MHC-II T cell promiscuous epitopes as well as the epitopes' similarity to human peptides. The presented strategy aims to improve the S protein's immunogenicity and antigenicity by inducing stronger CD4 T cell response while maintaining the protein's native structure and function. The top EvoDesign S protein candidate (Design-10705) recovered 31 out of 32 MHC-II T cell promiscuous epitopes in the native S protein, in which two epitopes were present in all seven human coronaviruses. This newly designed S protein also introduced nine new MHC-II T cell promiscuous epitopes and showed high structural similarity to its native conformation. The proposed structural vaccinology method provides an avenue to rationally design the antigen's structure with increased immunogenicity, which could be applied to the rational design of new COVID-19 vaccine candidates. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.07.27.224121v1?rss=1 Authors: Nomi, T., Inoue, S., Fujita, H., Sadamitsu, K., Sakaguchi, M., Tenma, A., Nakagami, H. Abstract: B-cells inducing antigen-specific immune responses in vivo produce large amounts of antigen-specific antibodies by recognizing the subregions (epitope regions) of antigen proteins. They can inhibit their functioning by binding antibodies to antigen proteins. Predicting of epitope regions is beneficial for the design and development of vaccines aimed to induce antigen-specific antibody production. However, prediction accuracy requires improvement. The conventional epitope region prediction methods have focused only on the target sequence in the amino acid sequences of an entire antigen protein and have not thoroughly considered its sequence and features as a whole. In the present paper, we propose a deep learning method based on short-term memory with an attention mechanism to consider the characteristics of a whole antigen protein in addition to the target sequence. The proposed method achieves better accuracy compared with the conventional method in the experimental prediction of epitope regions using the data from the immune epitope database. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.07.22.214254v1?rss=1 Authors: Serapian, S., Marchetti, F., Triveri, A., Morra, G., Meli, M., Moroni, E., Sautto, G. A., Rasola, A., Colombo, G. Abstract: Betacoronavirus SARS-CoV-2 is posing a major threat to human health and its diffusion around the world is having dire socioeconomical consequences. Thanks to unprecedented efforts of the scientific community, the atomic structure of several viral proteins has been promptly resolved. As the crucial mediator of host cell infection, the heavily glycosylated trimeric viral Spike protein (S) has been attracting the most attention and is at the center of efforts to develop antivirals, vaccines, and diagnostic solutions. Herein, we use an energy-decomposition approach to identify antigenic domains and antibody binding sites on the fully glycosylated S protein. Crucially, all that is required by our method are unbiased atomistic molecular dynamics simulations; no prior knowledge of binding properties or ad hoc combinations of parameters/measures extracted from simulations is needed. Our method simply exploits the analysis of energy interactions between all intra-protomer aminoacid and monosaccharide residue pairs, and cross-compares them with structural information (i.e., residue-residue proximity), identifying potential immunogenic regions as those groups of spatially contiguous residues with poor energetic coupling to the rest of the protein. Our results are validated by several experimentally confirmed structures of the S protein in complex with anti- or nanobodies. We identify poorly coupled sub-domains: on the one hand this indicates their role in hosting (several) epitopes, and on the other hand indicates their involvement in large functional conformational transitions. Finally, we detect two distinct behaviors of the glycan shield: glycans with stronger energetic coupling are structurally relevant and protect underlying peptidic epitopes; those with weaker coupling could themselves be poised for antibody recognition. Predicted Immunoreactive regions can be used to develop optimized antigens (recombinant subdomains, synthetic (glyco)peptidomimetics) for therapeutic applications. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.07.23.218529v1?rss=1 Authors: Banerjee, S., Majumder, K., Gutierrez, G. J., Gupta, D., Mittal, B. Abstract: The novel Corona Virus Disease (COVID-19) pandemic has spread a blaze of increasing fatality rates across the world. The dearth of potential vaccines has left the survival of mankind with doubts. The development of multi-epitope vaccine in this current situation could be a possible COVID treatment. We have designed a novel multi-epitope, multi-protein vaccine with different proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome - Corona Virus -2 (SARS-CoV-2) with immuno-informatics approaches, which has been validated in silico to be stable and potential. It has been prepared with Cytotoxic T-cell (TC ) and Helper T-cell (TH ) cell binding epitopes overlapping with B-cell binding epitopes predicted for 6 proteins conserved among 4 different viral strains isolated across the world. Both the humoral and cell-mediated immune responses are ensured due to the presence of T cell and B-cell inducing epitopes along with interferon-gamma inducing epitopes. The final vaccine construct comprises of an adjuvant at the N terminal, Cytotoxic T Lymphocyte and Helper T Lymphocyte epitopes. The construct showed potential antigenicity and was non-allergic. The molecular docking of the refined, validated tertiary structure model of the vaccine was performed with immune-stimulatory Toll Like Receptors (TLR), TLR-2,3,4. The molecular dynamics simulations of docking revealed binding interactions of receptor with vaccine. The immune simulation of the vaccine even confirmed the initiation of elevated host immune responses. The efficient translation of the vaccine in an expression vector was confirmed with in-silico cloning approach. Certainly, the development of such vaccine candidate could possibly be an effective therapy for COVID-19. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

TWiV explains the use of a neuronal cell line to study herpes simplex virus latency and reactivation, and a strategy for creating vaccines that induce antibodies against specific epitopes. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier,Alan Dove, Rich Condit, and Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode Neuronal cell line supports herpes simplex virus latency (J Virol) Protect, modify, deprotect (PNAS) Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Science Picks Alan - Quabbin Reservoir Rich - Katherine Swan Ginsburg Humanism in Medicine Program; The Arnold P. Gold Foundation Brianne- UPitt Measles Simulator Dickson- James Webb Space Telescope Vincent- Nobel Prizes and Life Sciences by Erling Norrby Intro music is by Ronald Jenkees. Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

TWiV explains the use of a neuronal cell line to study herpes simplex virus latency and reactivation, and a strategy for creating vaccines that induce antibodies against specific epitopes. Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier,Alan Dove, Rich Condit, and Brianne Barker Subscribe (free): iTunes, Google Podcasts, RSS, email Become a patron of TWiV! Links for this episode Neuronal cell line supports herpes simplex virus latency (J Virol) Protect, modify, deprotect (PNAS) Timestamps by Jolene. Thanks! Weekly Science Picks Alan - Quabbin Reservoir Rich - Katherine Swan Ginsburg Humanism in Medicine Program; The Arnold P. Gold Foundation Brianne- UPitt Measles Simulator Dickson- James Webb Space Telescope Vincent- Nobel Prizes and Life Sciences by Erling Norrby Intro music is by Ronald Jenkees. Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Editor-in-Chief Dr Marwan Bukhari interviews Dr Laura Cappelli (Johns Hopkins University, USA) about her recent paper, which examines the frequency of shared epitope (SE) alleles in patients with immune checkpoint inhibitor-induced inflammatory arthritis. The study found that over 60% of these patients possessed at least one SE allele, and included comparisons to both rheumatoid arthritis patients and healthy controls. This paper is the Editor's Choice for March 2019.

Editor-in-Chief Dr Marwan Bukhari interviews Dr Laura Cappelli (Johns Hopkins University, USA) about her recent paper, which examines the frequency of shared epitope (SE) alleles in patients with immune checkpoint inhibitor-induced inflammatory arthritis. The study found that over 60% of these patients possessed at least one SE allele, and included comparisons to both rheumatoid arthritis patients and healthy controls. This paper is the Editor's Choice for March 2019.

Editor-in-Chief Dr Marwan Bukhari interviews Dr Laura Cappelli (Johns Hopkins University, USA) about her recent paper, which examines the frequency of shared epitope (SE) alleles in patients with immune checkpoint inhibitor-induced inflammatory arthritis. The study found that over 60% of these patients possessed at least one SE allele, and included comparisons to both rheumatoid arthritis patients and healthy controls. This paper is the Editor's Choice for March 2019.

The Immune hosts explain how antibody molecules mature, then discuss the finding in infants of potent neutralizing antibodies against respiratory syncytial virus without somatic hypermutation. Hosts: Vincent Racaniello, Stephanie Langel, and Cynthia Leifer Become a patron of Immune! Links for this episode Potent anti-RSV antibodies without somatic hypermutation (Immunity) History of vaccine enhanced RSV disease (Clin Vacc Immunol) Image credit Letters read on Immune #6 Weekly Science Picks Steph - REACTOME project (free icons) Cindy - Gender Imbalance in Stories Vincent - Trump, Tell Us About Your Flu Shot Music by Steve Neal. Immune logo image by Blausen Medical. Send your immunology questions and comments to immune@microbe.tv

Jon and Teddy Yewdell join the TWiV team to talk about their careers, their research, and the problems with biomedical research. Hosts: Vincent Racaniello, Alan Dove,and Rich Condit Guest: Jon Yewdell and Teddy Yewdell Become a patron of TWiV! Links for this episode Jon Yewdell laboratory Chaudhuri laboratory Truth Wins by Jon Yewdell (epub or mobi download) Noncoding RNAs and class switch recombination (Int Imm) Translating DRiPs (J Leuk Biol) Lamprey VLRP response to influenza virus (eLife) The Biomedical Research Crisis (TWiV 208) This episode is brought to you by the Department of Microbiology at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai. Composed of over 20 virology labs, all centralized in one building in the heart of New York City, this department is a perfect fit for anyone with an interest in pursuing virus research. For more information about the Department, visit http://bit.ly/micromssm Intro music is by Ronald Jenkees. Send your virology questions and comments to twiv@microbe.tv

Danny Wells speaks to CHI on July 6th, 2017. Dr. Wells will be speaking during Neoantigen-Based Personalized Immunotherapies meeting at ImPACT: Immunotherapy Progress and Clinical Treatments, December 5-7th, 2018 in San Diego, California. Topics include scaling up personalized therapies, future clinical applications of neoantigens, and new frontiers in cancer immunotherapy. For more information, please visit http://www.ImpactImmunotherapy.com/Neoantigen-Immunotherapy/

Hosts: Vincent Racaniello, Dickson Despommier, Alan Dove, Rich Condit, and Kathy Spindler The TWiVniks discuss the structure of a virus that reproduces in an extreme environment, long-term consequences of Ebolavirus infection, and VirScan, a method to identify the different virus infections you have had in your lifetime. Links for this episode Virus with A-form DNA (Science) Viruses in the extreme (virology blog) Sequelae of Ebolavirus infection (Lancet Inf Dis) Long term Ebolavirus effects (virology blog) Take the chili ME challenge Serological profiling of human viral infections (Science) Your viral past (virology blog) Letters read on TWiV 342 Timestamps by Jennifer. Thank you! Weekly Science Picks Dickson - Incredible photosAlan - Alone in a room full of science writersKathy - Calico cats and Siamese catsRich - Missing link in evolutionVincent - Podcasts saving NPR and Podcasting blossoms Listener Pick of the Week Jenny - What Bill Gates is afraid ofNeva - The Kardashian Index Send your virology questions and comments (email or mp3 file) to twiv@twiv.tv

Control of human cytomegalovirus (HCMV) depends on CD8+ T cell responses that are shaped by an individual's repertoire of MHC molecules. MHC class I presentation is modulated by a set of HCMV-encoded proteins. Here we show that HCMV immunoevasins differentially impair T cell recognition of epitopes from the same viral antigen, immediate-early 1 (IE-1), that are presented by different MHC class I allotypes. In the presence of immunoevasins, HLA-A- and HLA-B-restricted T cell clones were ineffective, but HLA-C*0702-restricted T cell clones recognized and killed infected cells. Resistance of HLA-C*0702 to viral immunoevasins US2 and US11 was mediated by the alpha3 domain and C-terminal region of the HLA heavy chain. In healthy donors, HLA-C*0702-restricted T cells dominated the T cell response to IE-1. The same HLA-C allotype specifically protected infected cells from attack by NK cells that expressed a corresponding HLA-C-specific KIR. Thus, allotype-specific viral immunoevasion allows HCMV to escape control by NK cells and HLA-A- and HLA-B-restricted T cells, while the virus becomes selectively vulnerable to an immunodominant population of HLA-C-restricted T cells. Our work identifies a T cell population that may be of particular efficiency in HCMV-specific immunotherapy.

Background: The National Institutes of Health classified Hepatitis E as an emerging disease since Hepatitis E Virus (HEV) is the major cause of acute hepatitis in developing countries. Interestingly, an increasing number of sporadic cases of HEV infections are described in industrialized countries as zoonosis from domestic livestock. Despite the increasing relevance of this pathogen in clinical virology, commercial antibody assays are mainly based on fragments of HEV open reading frame (ORF) 2 and ORF3. The largest ORF1 (poly)protein, however, is not part of current testing formats. Methods: From a synthesized full length HEV genotype 1 cDNA-bank we constructed a complete HEV gene library consisting of 15 respective HEV ORF domains. After bacterial expression and purification of nine recombinant HEV proteins under denaturating conditions serum profiling experiments using 55 sera from patients with known infection status were performed in microarray format. SPSS software assessed the antigenic potential of these nine ORF domains in comparison to seven commercial HEV antigens (genotype 1 and 3) by performing receiver operator characteristics, logistic regression and correlation analysis. Results: HEV antigens produced with our method for serum profiling experiments exhibit the same quality and characteristics as commercial antigens. Serum profiling experiments detected Y, V and X domains as ORF1-antigens with potentially comparable diagnostic significance as the well established epitopes of ORF2 and ORF3. However no obvious additional increase in sensitivity or specificity was achieved in diagnostic testing as revealed by bioinformatic analysis. Additionally we found that the C-terminal domain of the potential transmembrane protein ORF3 is responsible for IgG and IgM seroreactivity. Data suggest that there might be a genotype specific seroreactivity of homologous ORF2-antigens. Conclusions: The diagnostic value of identified ORF1 epitopes might not necessarily improve sensitivity and specificity, but broaden the overall quality of existing test systems. ORF2 and ORF3-antigens are still commonly used in diagnostic assays and possibly hold the potential to serologically differentiate between genotype 1 and 3 infections. Our systematic approach is a suitable method to investigate HEV domains for their serologic antigenicity. Epitope screening of native viral domains could be a preferable tool in developing new serologic test components.

Vincent and Dickson review an in silico pipeline for identifying molecular mimicry candidate proteins in the genomes of parasites, and catch up on listener email.

Es hat sich gezeigt, dass virusspezifische CD8+ T Zellenantworten eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der HIV-Infektion spielen. Aus bislang ungeklärten Gründen geht diese anfängliche Kontrolle durch HIV-spezifische CD8+ T Zellen jedoch mit der Zeit verloren und es kommt zu einem Fortschreiten der HIV Infektion, die letztlich eine medikamentöse Therapie notwendig macht. Eine chronische Immunaktivierung ist kennzeichnend für eine fortschreitende HIV Infektion. Daher wurde im ersten Teil der vorliegenden Arbeit zunächst die Expression von immunstimulierenden Signalen, anhand von CD38, und von inhibitorischen Signalen, anhand von PD-1, auf HIV-spezifischen CD8+ T Zellen von Patienten mit einer unbehandelten, chronischen HIV-Infektion untersucht. Es zeigte sich, dass CD38 und PD-1 auf HIV-spezifischen CD8+ T Zellen ko-exprimiert wurden und mit den klinisch wichtigen Parametern Viruslast und CD4+ T Helferzellzahl korrelierten. Die Ko Expression von CD38/PD-1 auf CD8+ T Zellen von Progressoren mit fortschreitender HIV-Infektion war hoch signifikant höher als bei Controllern, deren CD8+ T Zellen die HI-Virämie noch kontrollieren konnten (p

Vincent, Rich, and Abbie review a broad spectrum antiviral protein, and selective pressure applied by a failed HIV-1 vaccine.

Im Rahmen einer Invitro-Studie mit porcinene Aortenendothelzellen wurde der Einfluss von Hypothermie und den Kardioplegielösungen UW-Lösung und Bretschneider-Lösung auf die alpha-gal-Epitope untersucht. Zur Bestimmung des Einflusses von Hypothermie auf die alpha-gal-Epitope wurden die Zellen der Versuchsgruppen über 1h,4h und 6h bei 4°C gekühlt, die Zellen der Kontrollgruppen wurden über den entsprechenden Zeitraum bei 38°C inkubiert. Zur Bestimmung des Einflusses der Kardioplegielösungen wurden die Zellen der Versuchsgruppen über 4h bei 4°C unter Zusatz von Bretschneider- oder UW-Lösung gekühlt, während die Zellen der Kontrollgruppen über 4h bei 4°C ohne Zusatz der entsprechenden Lösung gekühlt wurden. Es zeigte sich kein signifikanter Einfluss der Hypothermie von 4°C auf die alpha-Gal-Epitope. Die Kardioplegielösungen aber führten zu einer signifikanten Reduktion der Epitope pro Zelle (UW-Lösung 50%, Bretschneider-Lösung 32%). Der hier nachgewiesene alpha-gal-Epitop reduzierende Effekt der Kardioplegielösungen könnte eine therapeutische Option zur Verhinderung der Abstoßungsreaktionen in der Xenotransplantation darstellen.

Die Reaktivierung von Herpesviren, wie EBV, CMV und HHV-6, kann bei Patienten nach einer allogenen Stammzelltransplantation zu schwerwiegenden Erkrankungen und sogar zum Tod führen. Zur Behandlung von EBV- oder CMV-assoziierten Komplikationen hat sich in der Vergangenheit der adoptive Transfer von virusspezifischen T-Zellen, die aus dem T-Zellgedächtnis des Stammzellspenders isoliert wurden, als wirksam und gut verträglich erwiesen. Patienten mit einem CMV-negativen Transplantatspender haben ein erhöhtes Risiko für CMV-assoziierte Erkrankungen, und gerade in diesem Fall fehlt eine adoptive Therapie, weil CMV-spezifische T-Zellen von einem solchen Spender nicht verfügbar sind. Um dieses Problem zu lösen, habe ich in meiner Arbeit die Herstellung von CMV-spezifischen T-Zellen mittels retroviralem Transfer des spezifischen T-Zellrezeptors untersucht. Zuerst habe ich CD4+ und CD8+ T-Zellklone mit verschiedenen HLA-Restriktionen, die die endogen prozessierten und präsentierten CMV-Antigene pp65 und IE-1 erkennen, aus dem T-Zellgedächtnis von CMV-positiven Spendern generiert und charakterisiert. Für den retroviralen Transfer wurden vier pp65-spezifische T Zellrezeptoren unterschiedlicher HLA-Restriktionen ausgewählt. Die Gene der TCRs wurden kloniert und auf primäre T-Zellen CMV-negativer Spender übertragen. CMV-TCR-transgene T Zellen zeigten ein breites Spektrum an wichtigen Effektorfunktionen wie die Freisetzung von IFN-γ und IL 2 sowie Zytotoxizität und Proliferation gegenüber endogen prozessiertem pp65, und die Zellen konnten durch strikt antigenspezifische Stimulation angereichert und expandiert werden. Die Expansion der TCR-transgenen Zellen war von einem Anstieg der spezifischen Effektorfunktionen begleitet, was zeigt, dass die übertragene Spezifität stabil und voll funktionsfähig war. Deshalb erwarte ich, dass diese CMV-TCR-transgenen T-Zellen sich für die effektive Kontrolle einer akuten CMV-Infektion eignen und darüber hinaus für ein antivirales Gedächtnis sorgen werden. Auch die Reaktivierung von HHV-6 führt in immunsupprimierten Patienten zu ernsthaften Erkrankungen. Leider ist es allerdings bisher nicht möglich, HHV-6-spezifische T Zellen für den adoptiven Transfer herzustellen, weil die Antigene und Epitope der HHV-6-spezifischen Immunantwort nicht bekannt sind. Durch die Stimulation mit Peptiden aus den HHV-6-Tegumentproteinen U11 und U54, die aufgrund von konservierten HLA-Bindungsmotiven als CD8-T-Zellepitope vorhergesagt wurden, ist es mir gelungen, HHV-6-spezifische CD8+ T-Zellen von gesunden Virusträgern in vitro anzureichern. Ich konnte T-Zellklone spezifisch für mehrere HLA-A*0201-restringierte Epitope herstellen: die U11-Peptide GIL, MLW und SLM sowie die U54-Peptide ILY und LLC. Ich zeigte, dass ILY und LLC bei der intrazellulären Antigenprozessierung entstehen. ILY-spezifische T-Zellen erkannten virusinfizierte Zellen in vitro. Damit habe ich die ersten CD8-T Zellepitope von HHV-6 charakterisiert und gezeigt, dass sich auch die HHV-6-spezifische T Zellantwort, ähnlich wie die CMV-spezifische, gegen virale Tegumentproteine richtet. Durch Multimerfärbung von peripheren Blutzellen konnte ich zeigen, dass diese HHV-6-spezifischen T Zellen im T-Zellgedächtnis gesunder Virusträger im Vergleich zu anderen herpesvirusspezifischen T-Zellen selten sind. Diese Erkenntnisse liefern eine Grundlage für weitere Untersuchungen des HHV-6-spezifischen T-Zellrepertoires und helfen, Strategien für die Herstellung von HHV-6-spezifischen T-Zellen für die Immuntherapie zu entwickeln.

Speaker: Prof. C. Seoighe Abstract: We describe a phylogenetic model of protein-coding sequence evolution that includes environmental variables. We apply it to a set of viral sequences from individuals with known human leukocyte antigen (HLA) genotype and include parameters to model selective pressures affecting mutations within immunogenic (epitope) regions that facilitate viral evasion of immune responses. We combine this evolutionary model with a hidden Markov model to identify regions of the HIV-1 genome that evolve under immune pressure in the presence of specific HLA class I alleles and may therefore represent potential T cell epitopes. This phylogenetic hidden Markov model (phylo-HMM) provides a probabilistic framework that can be combined with sequence or structural information to enhance epitope prediction.

Speaker: Prof. C. Seoighe Abstract: We describe a phylogenetic model of protein-coding sequence evolution that includes environmental variables. We apply it to a set of viral sequences from individuals with known human leukocyte antigen (HLA) genotype and include parameters to model selective pressures affecting mutations within immunogenic (epitope) regions that facilitate viral evasion of immune responses. We combine this evolutionary model with a hidden Markov model to identify regions of the HIV-1 genome that evolve under immune pressure in the presence of specific HLA class I alleles and may therefore represent potential T cell epitopes. This phylogenetic hidden Markov model (phylo-HMM) provides a probabilistic framework that can be combined with sequence or structural information to enhance epitope prediction.

Bronchialkarzinome stellen heute in den westlichen Industrieländern die häufigste Krebstodesursache in allen ethnischen Gruppen dar.48,49,98 Bei 75 Prozent der Bronchialkarzinome findet sich histologisch ein nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom.96 Die Prognose des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist im Vergleich zum kleinzelligen Bronchialkarzinom deutlich besser.90 In frühen Tumorstadien ist die Operation die Therapie der Wahl. Allerdings ist die Fünf-Jahresüberlebensrate auch im Stadium I und II mit 50 bis 60 Prozent nicht zufriedenstellend.31,61 Ungefähr 40 Prozent der Stadium I Patienten, die postoperativ als tumorfrei gelten, entwickeln innerhalb von 24 Monaten ein Rezidiv.62 Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, des Wachstums und der Ausbreitung von Bronchialkarzinomen könnten helfen, Patienten zu identifizieren, die von einer adjuvanten Therapie profitieren könnten. Die Familie der Matrix Metalloproteinasen (MMP) scheint durch ihre proteolytischen Eigenschaften eine Schlüsselrolle bei der Invasion, Migration, Ausbreitung und Metastasierung von malignen Zellen zu spielen. Hierbei spielt vor allem die Degradierung der Extrazellularmatrix, sowie die Zerstörung und das Durchdringen der Basalmembran eine entscheidende Rolle.25 MMP-9 ist in der Lage Kollagen Typ IV, einen Hauptbestandteil der Basalmembran zu degradieren.21,51,68 Die klinische Relevanz der MMP in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen wird weiterhin kontrovers diskutiert.32,33 Diese Studie untersucht den klinischen Einfluss von MMP-9 bei einem Kollektiv von 141 Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom und langem Follow-up. Zu diesem Zweck wurde eine immunhistochemische Untersuchung zum Nachweis von MMP-9 durchgeführt. Zu Beginn der Arbeit wurde das immunhistochemische Verfahren optimiert. Nach sorgfältiger Auswahl des Antikörpers und Demaskierung der Epitope durch Wärmebehandlung zeigte sich die LSAB-Methode hervorragend geeignet zum Nachweis geringer Antigenmengen.17 Als Antikörper diente ein monospezifischer, polyklonaler primärer anti-MMP-9 Antikörper, der sowohl die aktive als auch die latente Form von MMP-9 erkennt.59 Eine homogene MMP-9 Expression fand sich in 18,4 % der Fälle. Eine Korrelation zwischen homogener MMP-9 mit dem pT-Stadium, pN-Stadium, Tumorhistologie, Tumordifferenzierung oder Geschlecht ließ sich statistisch signifikant nicht nachweisen. 128 Patienten konnten bei einem durchschnittlichen Follow-up von 72 Monaten in weitere Überlebensanalysen eingeschlossen werden. Eine statistische signifikante Korrelation konnte zwischen homogener MMP-9 Expression und ungünstigem Langzeitüberleben gefunden werden (p = 0,0135). Ebenso traten Lokalrezidive und eine Metastasierung statistisch signifikant gehäuft bei den Tumoren mit homogener MMP-9 Expression auf (p = 0,0078 und p = 0,0211). Die Cox-Regressionsanalyse zeigte, dass die homogene MMP-9 Expression mit einem p-Wert von 0,045 ein signifikanter und unabhängiger prognostischer Faktor für ein kürzeres Überleben bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom ist. Der genaue Entstehungsort der MMP-9 kann durch diese Arbeit nicht abschließend beantwortet werden. In dieser Arbeit zeigte sich eine heterogene und homogene MMP-9 Expression bei 54,6 % vorwiegend in den Tumorzellen beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom. In den Fibroblasten konnte MMP-9 in 28,8 % der Fälle in niedrigen Konzentrationen festgestellt werden, so dass die Expression von MMP-9 eher in den Tumorzellen des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms anzusiedeln ist. Die homogene MMP-9 Expression geht mit einer schlechten Prognose, einem höherem Lokalrezidivrisiko, einer höheren Metastasierung und einem kürzerem Überleben beim nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom einher. Die homogene MMP-9 Expression konnte als unabhängiger Prognosefaktor bezüglich des Überlebens ausgewählt werden. Aktuell bietet die TNM-Klassifikation beim nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom den besten prognostischen Wert. Allerdings zeigt sich in frühen Tumorstadien (Stadium I und II) bereits eine deutliche Heterogenität bezüglich des Überlebens.31 Obwohl diese Patienten kurativ durch Lobektomie und Lymphadenektomie behandelt worden sind, kommt es bei einem nicht unerheblichen Teil zu Lokalrezidiven oder zu Fernmetastasierungen, so dass bei einigen Patienten auch in frühen Stadien von einer systemischen Erkrankung ausgegangen werden muss.62 Möglicherweise kann die Expression von MMP-9 Patienten mit aggressiveren Bronchialkarzinomen identifizieren. Vor allem Patienten mit dem Stadium I oder II könnten von einer adjuvanten Chemotherapie oder von neueren Therapien, wie zum Beispiel dem Einsatz von spezifischen MMP-Inhibitoren profitieren. In der Zukunft könnten mit Hilfe weiterer Prognosefaktoren die Tumoren besser differenziert und die sich daraus ableitende Therapie weiter verbessert werden. Ziel dieser Grundlagenforschung sollte die Etablierung eines genetischen und biologischen „Fingerabdruckes“ eines jeden Tumors sein um besonders aggressive Formen zu identifizieren und dann spezifisch zu behandeln. Vermutlich werden diese Prognosefaktoren den Einzug in den klinischen Alltag finden und die Therapie des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms wesentlich beeinflussen. Durch die bessere Identifikation von Risikopatienten könnte die vollständige Remission und die Fünf-Jahres-Überlebensrate erheblich gesteigert werden. Außerdem konnte der wichtige Stellenwert der Immunhistochemie durch diese Arbeit gezeigt werden. Die Immunhistochemie ist eine technisch einfache und relativ kostengünstige Methode zur Bestimmung der wichtigsten Prognose- und Prädiktivfaktoren. Weiterhin ist die Methode wenig personalintensiv und könnte problemlos in den klinischen Alltag bei den histopathologischen Untersuchungen der Präparate mit integriert werden.

Background: Recent evidence suggests that distinction of subsets of rheumatoid arthritis (RA) depending on anticyclic citrullinated peptide antibody (anti-CCP) status may be helpful in distinguishing distinct aetiopathologies and in predicting the course of disease. HLA-DRB1 shared epitope (SE) and peptidylarginine deiminase type 4 (PADI4) genotype, both of which have been implicated in anti-CCP generation, are assumed to be associated with RA. Objectives: To elucidate whether PADI4 affects the clinical characteristics of RA, and whether it would modulate the effect of anti-CCPs on clinical course. The combined effect of SE and PADI4 on autoantibody profile was also analysed. Methods: 373 patients with RA were studied. SE, padi4_94C.T, rheumatoid factor, anti-CCPs and antinuclear antibodies (ANAs) were determined. Disease severity was characterised by cumulative therapy intensity classified into ordinal categories (CTI-1 to CTI-3) and by Steinbrocker score. Results: CTI was significantly associated with disease duration, erosive disease, disease activity score (DAS) 28 and anti-CCPs. The association of anti-CCPs with CTI was considerably influenced by padi4_94C.T genotype (C/C: ORadj=0.93, padj=0.92; C/T: ORadj=2.92, padj=0.093; T/T: ORadj=15.3, padj=0.002). Carriage of padi4_94T exhibited a significant trend towards higher Steinbrocker scores in univariate and multivariate analyses. An association of padi4_94C.T with ANAs was observed, with noteworthy differences depending on SE status (SE2: ORadj=6.20, padj,0.04; SE+: ORadj=0.36, padj=0.02) and significant heterogeneity between the two SE strata (p=0.006). Conclusions: PADI4 genotype in combination with anti- CCPs and SE modulates clinical and serological characteristics of RA.

Hello Welcome to the first edition of the Tumor Immunology Round Table podcast. In this edition I present you an very interesting and novel finding recently published in Journal of Experimental Medicine by Maness et al: the immune system induces the mutation by the SIV of an DRIP (defective ribosomal product) that is immunogenic and induces strong dominant responses in monkeys infected with SIV. The DRIP derives from a alternative reading frame of the gene env. The mutation specifically target the immunogenic peptide presented my the rhesus macaques haplotype mamu-B*17, as it doesn't affect the env sequence (sinonimous mutation). The mutation renders the peptide with much lower affinity than the wild type peptide and therefore the virus escape the immunological control. That's a great example of immunological editing of virus and the conclusions can be easily extrapolated to cancer immune editing.

Hello Welcome to the first edition of the Tumor Immunology Round Table podcast. In this edition I present you an very interesting and novel finding recently published in Journal of Experimental Medicine by Maness et al: the immune system induces the mutation by the SIV of an DRIP (defective ribosomal product) that is immunogenic and induces strong dominant responses in monkeys infected with SIV. The DRIP derives from a alternative reading frame of the gene env. The mutation specifically target the immunogenic peptide presented my the rhesus macaques haplotype mamu-B*17, as it doesn't affect the env sequence (sinonimous mutation). The mutation renders the peptide with much lower affinity than the wild type peptide and therefore the virus escape the immunological control. That's a great example of immunological editing of virus and the conclusions can be easily extrapolated to cancer immune editing.

Prions are unconventional pathogens that cause transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). According to the "protein only" hypothesis, prions consist of an infectious protein that is capable of converting a normal host protein termed PrPc into a protease resistant form termed PrPSc. PrPSc is poorly degraded by the host and accumulates in the CNS. Normal biological functions of PrPc and mechanisms involved in neurodegeneration remain obscure. During the past two decades, considerable efforts have been made to elucidate prion diseases and in particular to identify PrP interactors for a better understanding in prion biology. A major break-through was the identification of the 37 kDa laminin receptor (LRP), which represents the precursor of the human 67 kDa high-affinity laminin receptor (LR), as the cell surface receptor for the cellular prion protein. We investigated the role of LRP/LR in the propagation of PrPSc in chronically infected cells by different approaches. Three strategies resulted in downregulation or blocking of LRP and prevented PrPSc accumulation in different scrapie infected neuronal cell lines (i) transfection with an antisense LRP RNA expression plasmid (ii) transfection with small interfering (siRNAs) specific for the LRP mRNA and (iii) incubation with the polyclonal anti-LRP antibody, W3. We observed that the treatment with W3 abolished PrPSc deposition and reduced PrPc levels after one week of incubation. PrPSc did not reappear in cells being cultured for 14 additional days without therapeutic antibody treatment. Taken together, these results indicate that LRP is not only required for PrPc metabolism under non-pathological conditions but also has a pivotal role in prion propagation in a cell culture model. LRP/LR appears then to be a promising potential target for the development of therapeutics for the treatment of prion disease. Due to these encouraging cell culture data, we decided to select single chain antibodies (scFv) encompassing a suitable format for therapy. ScFvs are composed of variable parts of heavy and light chains of an immunoglobulin that are connected by a peptidic linker. The antibodies were screened on recombinant GST::LRP employing a phage display strategy. Two scFvs termed N3 and S18 were screened and selected by ELISA. Both antibodies were further characterized by western blotting and FACS analysis: both N3 and S18 specifically recognized mouseLRP and humanLRP overexpressed in mammalian cells under denaturating conditions (western blot) and under native conditions at the cell surface (FACS). Epitope mapping revealed that as expected both scFvs are directed against the extracellular part of LRP: S18 and N3 recognized amino acid residues 225-233 and 273-278, respectively. The ability of N3 and S18 to interfere with LRP/PrP interaction was tested by pull-down assays. In contrast to the control scFv C9 directed against the pre-S1 coat-protein of hepatitis B virus, both anti-LRP scFvs were able to block the specific LRP/PrP binding. In order to investigate a potential curing effect of scFv S18 in vivo, this scFv was tested in a scrapie mouse model by passive immunization. The application of S18 by intra-peritoneal injection was able to reduce PrPSc deposition in the spleen in comparison to mice injected with PBS or C9. However the survival times of S18 treated animals was not increased. Anti-LRP scFv S18 seems to contribute to block prion propagation in the periphery but it is likely that this effect was not enough strong to have an impact on the CNS invasion. Thus, we hypothesized that a strategy targeting directly the brain should be more effective. In this context, an approach based on the expression of single chain antibodies as secretory molecules in the brain via an adeno-associated virus (AAV) vector was initiated. To assure secretion of the scFv expressed in mammalian cells, a signal sequence was fused to the scFvs. Tranfection experiments demonstrated that neuronal cells were able to express and secrete high quantities of both scFvs. Furthermore, the generated scFvs were still functional as shown by western blotting. To find the appropriate AAV serotype for scFv expression, neuronal cells were transduced with varying serotypes carrying a GFP. AAV serotype 2 was chosen due to (i) its good transduction performance in two neuronal cell lines and (ii) the possibility of its purification by affinity chromatography. The sequences encoding for the scFvs N3, S18 and C9 have been cloned in an AAV-based vector. The AAV system was also able to drive high expression of scFvs into the supernatant by transfection or transduction. rAAV-scFv particles were produced and purifed for further stereotaxic injections into mice. Although the investigation of this therapeutic strategy is still in progress in a murine scrapie model, we already proved that a single injection of rAAV led to the expression of scFvs into the brain of mice 30 days post injection. This study represents the first gene therapeutic approach for the treatment of prion diseases.

Ziel dieser Arbeit war es, monoklonale Antikörper zur Charakterisierung von Stromazellen der Maus und der Ratte herzustellen. Zur Immunisierung wurden Stromazellen aus dem Knochenmark von Maus und Ratte verwendet. Aus drei Zellfusionen konnten 28 interessante Zellkulturüberstände gewonnen werden. Die Zellen aus den positiven Kavitäten wurden nachfolgend subkloniert und erneut getestet. Die durch Immunfluoreszenzanalyse als positiv bewerteten Klone wurden nachfolgend immunhistochemisch mit adhärenten Knochenmarkzellen in Zellkulturplatten, auf Knochenschnitten und verschiedenen Organschnitten untersucht. Der Klon 1F12F10 erkennt ein Epitop, das für eine kleine Knochenmarkzellpopulation spezifisch zu sein scheint. Das Epitop ist auch auf anderen Zellen, die mesenchymaler und epithelialer Herkunft sind, auffindbar. Der Klon 3H10A12 erkennt ein Epitop, das nicht sehr spezifisch für mesenchymale Knochenmarkzellen ist. Die Klone 6B10B6 und 6B10H8 zeigen ähnliche Ergebnisse und erkennen mit hoher Wahrscheinlichkeit das gleiche Epitop. Der Klon 6A8C8 weist im FACS eine relativ eng begrenzte Zellpopulation auf. In der Immunhistologie sieht man, das nur wenige Zellen im Knochenmark positiv sind. Durch Western Blot und Immunpräzipitation konnte die Größe eines Ratten- und eines Maus-Oberflächenproteins, das durch den jeweiligen Antikörper erkannt wird, festgestellt werden. Über die Struktur der Epitope, die von den Antikörpern der Klone erkannt werden, können keine weiteren Aussagen gemacht werden. In dieser Arbeit konnten Aussagen über die Morphologie der positiven Zellen und ihrer Verteilung in den verschiedenen Geweben gemacht werden. Um die Struktur der erkannten Proteine zu identifizieren, wären weitere Versuchsansätze nötig.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und molekularen Charakterisierung von humanen CD34- Zelllinien aus dem peripheren Blut (V54/1, V54/2) im Vergleich zu den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien (L87/4, L88/5). Die Klone V54/1 und V54/2 wurden aus dem peripheren Blut nach Stammzellmobilisierung und CD6 Depletion durch Zugabe eines Faktorengemisches aus IL-1b, IL-3, IL-6, IL-7, IL-8 und IL-11 erzeugt. L87/4 und L88/5 hingegen sind adhärente und wachstumsarretierte Stromazellen, die die Erhaltung und Differenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen durch Mediatoren ermöglichen (Thalmeier et al. 2000). Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von Stammzelleigenschaften bei den Zelllinien L87/4, L88/5, V54/1 und V54/2. Dazu soll die Färbung mit den Farbstoffen Rhodamin 123 (Rh123) und Hoechst 33342 zeigen, ob Subpopulationen innerhalb der Klone mit unterschiedlichen Färbeeigenschaften, bestehen. Die biologische Bedeutung der beiden Farbstoffe liegt darin, dass Sie dazu geeignet sind frühe Stammzellen zu identifizieren. Als Substrat der P-Glykoproteinpumpe, die u.a. auf frühen Vorläuferzellen mit stark erhöhter Repopulationskapazität gefunden wird, werden diese Farbstoffe aus der Zelle gepumpt. Der Farbstoff-Efflux kommt durch die mdr-Gen-kodierte (multi-drug-resistance) und Kalzium-abhängige P-Glykoproteinpumpe zustande. Das P-Glykoprotein hat neben der Bedeutung in der Stammzellbiologie in der angewandten Medizin eine wichtige Funktion in der Resistenzentwicklung von Tumoren. Des weiteren wurden bei den Zelllinien stammzellrelevante Oberflächenantigene (CD10, CD34, CD14, CD105, SH3 und CD117) untersucht, um Unterschiede zwischen L87/4, L88/5 und den Klonen V54/1, V54/2 zu erkennen. Versuche zur Induktion der Differenzierung sollten Hinweise auf die Plastizität der Zelllinien geben. Experimente an den durch den Rh123-Efflux unterscheidbaren Subpopulationen der Zelllinie V54/2 dienen der Aufklärung von Unterschieden in Morphe, zellulären Transportfunktionen und Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken. Methodisch wurde für die Analyse der Epitope und der Färbungen mit Rh123 und Hoechst 33342 ein Durchflußzytometer verwendet. Die Analyse der Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken wurde mittels Reverse Transkriptase Polymerase Ketten Reaktion durchgeführt. Die Ergebnisse der Färbeexperimente zeigten, dass bei allen untersuchten Zelllinien durch eine unterschiedliche Anfärbbarkeit der Zellen mit dem Farbstoff Rh123 zwei Subpopulationen unterschieden werden können. Die jeweils größere Subpopulation der Zelllinien färbt sich mit Rh123 an und bleibt auch nach einer definierten Inkubationszeit, die den Rh123-Efflux ermöglichen soll, gefärbt. Sie wird Rh123high genannt. Die übrigen Zellen, die bei allen Zelllinien unter 10% der Gesamtpopulation betragen, sind in der Lage den Farbstoff aus der Zelle zu pumpen. Diese Subpopulation wird Rh123low genannt und ist mit Stammzelleigenschaften wie tausendfach erhöhter Repopulationsfähigkeit in NOD/SCID-Mäusen assoziiert. Es konnte also innerhalb der untersuchten monoklonalen Linien eine Rh123low Subpopulation identifiziert werden, die sich durch zahlreiche biologische Eigenschaften von der Gesamtpopulation unterscheidet. Da der Rh123 Efflux durch eine Kalzium-abhängige Pumpe zustande kommt, lässt sie sich durch den Kalziumantagonisten Verapamil hemmen. Eine Hemmung der Pumpe bewirkt, dass die Rh123low Zellen nicht mehr in der Lage sind Rh123 aus der Zelle zu pumpen, so dass sie nach einer definierten Inkubationszeit mit Rh123 gefärbt bleiben. Neben diesem funktionellen Beweis für die P-Glykoproteinpumpe konnte durch den strukturellen Nachweis der Pumpe mittels eines Antikörpers gegen P-Glykoprotein ein definitiver Beweis für das Vorhandensein der aktiven P-Glykoproteinpumpe bei der Rh123low Population erbracht werden. Mit dem anderen Farbstoff Hoechst 33342 können die jeweiligen Anteile der Zelllinien in den einzelnen Stadien des Zellzyklus nachgewiesen und zudem ein kleiner Anteil an Zellen bestimmt werden, der als „Side Population“ (SP-Zellen) definiert wird. Diesen SP-Zellen werden Eigenschaften von aktiven Stammzellen zugeschrieben. Hierbei besteht ein Unterschied zwischen den aus dem Knochenmark und den aus dem peripheren Blut etablierten Linien, da die Zellen aus dem peripheren Blut nicht nur ein anderes Zellzyklusmuster aufweisen, sondern auch einen höheren Anteil an SP-Zellen besitzen. Es wurden vergleichende Untersuchungen zwischen den Zelllinien und zwischen den Rh123high und Rh123low Subpopulationen innerhalb einer Zelllinie mit Antikörpern gegen die Epitope CD14, CD45, HLA-DR, CD10, CD117, CD105 und SH3 durchgeführt. Dabei waren CD14 und CD45 auf allen Zelllinien negativ, wobei alle Zelllinien eine positive Expression für den mesenchymalen Marker Endoglin (CD105) und für SH3 (CD73) zeigten. CD117 konnte nur auf den aus dem Knochenmark etablierten Zelllinien L87/4 und L88/5 nachgewiesen werden. CD34, ein charakteristischer Marker für hämatopoetische Vorläuferzellen, aber auch für Endothelzellen, konnte nur auf den Zellen der Rh123low Subpopulation nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu exprimieren die Rh123high Zellen kein CD34. Da es sich bei den Zelllinien um Klone handelt, ist der Unterschied in der Expression von CD34 zwischen der Rh123low und der Rh123high Population ein deutlicher Hinweis auf die Plastizität der Zelllinien und das Fließgleichgewicht zwischen Rh123low und Rh123high. Durch eine Zellsortierung der Zelllinie V54/2 wurde die Rh123low von der Rh123high Subpopulation getrennt, um sie dann bezüglich ihrer Morphologie, dem Wachstum in Methylzellulose und der Expression ausgewählter Funktionseinheiten von Transkriptionsfaktor Netzwerken zu untersuchen. Dabei erhärtete sich die Hypothese, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation um aktivere Zellen mit einer gesteigerten Expression von erythroid/myeloischen und mesodermalen Eingaben (z.B. VEGF, BMP-4), Rezeptoren (z.B. tie-1), vernetzter Transkriptionsfaktoren (z.B. GATA, ETS) und letztendlich Ausgaben (z.B. PECAM) handelt. Diese fungieren in Netzwerken mit dem Ziel, stammzellrelevante Funktionen zu ermöglichen. Die Morphologie zeigte in den Zytozentrifugationspräparaten deutliche Unterschiede zwischen Zellen der Rh123low und der Rh123high Subpopulation. Die Rh123low Subpopulation besteht aus lymphoid-ähnlichen Zellen, was für Zellen mit Stammzellfunktion charakteristisch ist. Die Rh123high Subpopulation dagegen hat ein insgesamt größeres Zellvolumen und einen gebuchteten Kern mit perinukleärer Aufhellung. Untersuchungen des klonalen Wachstums in der Methylzellulose ergaben bei keiner der Subpopulationen eine wesentliche Koloniebildung. Durch die Inkubation der Zelllinie V54/2 mit dem Neurotropen Wachstumsfaktor (NGF) konnte eine morphologische Änderung in Richtung einer neuronalen/glialen Differenzierung nach 8-12 Stunden induziert werden. Der immunhistochemische Nachweis von Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) bestätigte die mesenchymale Potenz zumindest in Richtung einer glialen Differenzierung. Das unterschiedliche Expressionsmuster ausgewählter, für die Differenzierung notwendiger Zusammenspieler innerhalb von Transkriptionsfaktor Netzwerken innerhalb der Rh123high und der Rh123low Population bei V54/2 war ein weiterer Hinweis, dass es sich bei der Rh123low Subpopulation um aktive Vorläuferzellen mit möglicher Stammzellpotenz handelt. In der Rh123low Subpopulation wurde im Gegensatz zur Rh123high Population eine Expression von BMP4, GATA1, GATA3 nachgewiesen, die essentiell für die Hämatopoese und für eine mesenchymale Differenzierung ist. Die Faktoren für GATA2, GATA3, beta globin, Elf-1 und PECAM1 wurden in einem stärkeren Maß in der Rh123low als in der Rh123high Population exprimiert. BMP-Rez., Myb, sowie die Endothel-assoziierten Faktoren Tie-1 und VEGF waren in beiden Subpopulationen gleich stark vorhanden. Bei den wenigen Funktionseinheiten der größeren und Rh123high Population handelt es sich vor allem um angiogenetische Faktoren, was auf eine limitierte Differenzierungseigenschaft der Rh123high Subpopulation und die enge Beziehung zwischen Blut- und Endothelzellen („Hämangioblast“) hinweist. Ein Nachweis für die Plastizität der Stammzellen innerhalb der von uns etablierten Zelllinien wurde dadurch erbracht, dass die zellsortierten Subpopulationen Rh123low und Rh123high nach dem Sortierexperiment getrennt rekultiviert wurden, wobei das Wachstum der Rh123low Subpopulation deutlich langsamer war als das der Rh123high Subpopulation. Nach zwei Wochen wurden die zellsortierten Subpopulationen erneut einer Rh123 Färbung unterzogen, wobei sich wiederum das ursprüngliche Verhältnis zwischen den Rh123low und Rh123high Subpopulationen einstellte. So kann man aus der Transdifferenzierung der Zelllinien von Rh123low in Rh123high und umgekehrt die Plastizität der hier untersuchten adulten Stammzelllinien ableiten. Die Ergebnisse sollen zum grundlegenden Verständnis der Biologie adulter (nicht embryonaler) Stammzellen beitragen und damit die Möglichkeit schaffen, adulte Stammzellen bzw. deren Subpopulationen gezielt für einen reparativen Gewebe- und Organersatz zu verwenden. Dabei liefern sie die Basis für weitergehende Untersuchungen zum besseren Verständnis der physiologischen und regenerativen Vorgänge, z.B. auch bei Alterung oder bei gesteigerter Funktion. Darüber hinaus kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse durch weitere Untersuchungen möglicherweise besser verstanden werden, ob es gelingen kann das Potential adulter Stammzellen zur therapeutischen Gewebereparation, z.B. zur Verhinderung oder Verringerung einer Narbenbildung, zu nutzen.

Das epitheliale Adhäsionsmolekül EpCAM wird insbesondere in gesunden Adenoepithelien exprimiert, nicht aber in den mukösen Plattenepithelien der oberen Atem- und Verdauungswege. Aus diesen Geweben hervorgehende Plattenepithelkarzinome dagegen zeigen eine Überexpression von EpCAM. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen zudem, dass die Plattenepithelkarzinome der Kopf-Hals-Region EpCAM außerdem in einer hyperglykosilierten Proteinvariante exprimieren, die das Ergebnis posttranskriptioneller Modifikation ist. So konnte gezeigt werden, dass in gesundem und in malignem Gewebe tatsächlich unterschiedliche Glykosilierungsformen von EpCAM vorliegen: In gesundem Gewebe wird EpCAM als unglykosiliertes Protein von 37 kDa exprimiert. Das aus Tumorgewebe stammende EpCAM hingegen war in den untersuchten Karzinomzelllinien aus SCCHN, Mamma- und Kolon und in den Gewebsproben aus Patienten mit SCCHN und mit Kolonkarzinomen hyperglykosiliert. Dabei zeigten die Karzinome ein heterogenes Bild mit unterschiedlichen Variationen und Kombinationen der verschiedenen Glykosilierungsformen. Gesundes EpCAM-positives Schilddrüsenepithel und auch gesunde Kolon- und Magenschleimhaut dagegen exprimierten vorwiegend unglykosilierte Formen von EpCAM. Innerhalb von Probenpaaren aus SCCHN und autologem Schilddrüsengewebe war EpCAM in den meisten Fällen (81,5 %) in der Karzinomprobe stärker glykosiliert als im gesunden Epithel, eine analoge Verteilung der Glykosilierungsmuster zeigten die Probenpaaren aus gesunder und neoplastisch veränderter Kolon- und Magenschleimhaut. In epithelialen Neoplasien wird EpCAM eine essentielle Bedeutung für die Karzinogenese zugeschrieben. Gleichzeitig dominieren in SCCHN und in anderen Karzinomen hyperglykosilierte Proteinvarianten von EpCAM, die in gesunden Epithelien nicht oder kaum anzutreffen sind. Man könnte daher vermuten, dass zwischen der posttranslationalen Hyperglykosilierung von EpCAM und den funktionellen Eigenschaften des tumorassoziierten Antigens in Karzinomzellen ein enger Zusammenhang besteht. Weitere Untersuchungen wären notwendig, um die molekulare Struktur und funktionelle Bedeutung der hyperglykosilierten Proteinvarianten von EpCAM in Karzinomen zu klären. Die Identifizierung karzinomspezifischer Epitope auf dem Glykoprotein EpCAM wäre Voraussetzung für die Entwicklung spezifischer Antikörpern, die hyperglykosiliertes EpCAM auf Karzinomzellen erkennen. Ziel wäre eine Immuntherapie mit EpCAM von hoher Karzinomspezifität und somit ein hoher therapeutischer Wirkungsgrad bei geringerer Toxizität. Für Patienten mit SCCHN könnte dies insbesondere bei minimal residual disease zu einer Verbesserung der bisher ungünstigen Prognose führen.

6.1. Die PH-Domäne als Paratop Die Pleckstrin-homologe (PH-) Domäne des humanen Cytohesin-1 besteht aus einem Proteingerüst sowie vier längeren Loops. Von diesen weisen drei in eine Richtung und bilden eine komplexe, flexible Oberflächenstruktur aus. Sollte man diese Oberflächenstruktur durch Mutation der Loops als Bindungstasche (Paratop) für Epitope von Schlüsselmolekülen etablieren können, wäre ein breiter Einsatz der PH-Domäne als Wirkstoff oder spezifisches Nachweisreagenz interessant, zumal sie sich in E. coli mit hohen Ausbeuten cytoplasmatisch löslich exprimieren läßt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die drei Loops verändern lassen, ohne daß die PH-Domäne ihre Struktur verliert; von daher eignet sich die PH-Domäne als Proteingerüst. Sie wurde insgesamt in 29 Aminosäurepositionen mit einem neuartigen Verfahren gewichtet randomisiert, indem an jeder Position die Wildtyp-Aminosäure bevorzugt wird. In Anbetracht der Zahl randomisierter Positionen sollte damit gegenüber einer ungewichteten Randomisierung kein Verlust an Komplexität für die Bibliothek zu befürchten sein, durch den möglichen Erhalt lokaler und nicht lokaler Wechselwirkungen aber die Zahl stabiler (damit exprimierbarer und selektierbarer) Mutanten deutlich erhöht werden. Die Randomisierung erfolgte dabei mit drei Oligodesoxynukleotiden, die in den randomisierten Positionen jeweils eine definierte Basenverteilung aufweisen. Zur Klonierung einer Bibliothek wurden sie im dazu entwickelten Verfahren der „asymmetrischen PCR-Reaktion“ eingesetzt und daraufhin zu einem in drei Segmenten randomisierten DNA-Fragment assembliert. Mit dieser Strategie konnten 6 · 107 Mutanten erzeugt werden. (Aus deutlich kleineren Bibliotheken anderer Proteine ließen sich bereits bindende Mutanten isolieren.) Die randomisierten Mutanten der PH-Domäne wurden im phage-display-Verfahren zur Selektion gegen drei Zielsubstanzen eingesetzt. Danach konnten ausschließlich Deletionsmutanten und Mutanten mit stop-Codons nachgewiesen werden, die keine Expression von PH-Domänen erlauben. Zurückgeführt wird dieses Ergebnis auf die schlechten Transporteigenschaften der PH-Domäne bei der Translokation in das Periplasma von E. coli, weshalb nicht auf bindende Paratope aus der Bibliothek selektiert werden konnte. Nach Verbesserung der Translokationseigenschaften von PH-Domänen sollte sich das phage-display-Verfahren zur Selektion bindender Mutanten fortsetzen lassen. 6.2. Die PH-Domäne als Substrat für Translokationen Die im phage-display-Verfahren eingesetzten M13-Bakteriophagen assemblieren in der inneren Membran von E. coli. Dies setzt die Translokation der mit dem g3-Protein fusionierten PH-Domäne in das Periplasma voraus. Die geringe periplasmatische Expression bei mehrheitlich aberranten Prozessierungen im Bereich des Signalpeptids und die geringe Darstellung auf der Phagenoberfläche veranlaßten zur Translokationsoptimierung der PH-Domäne. Während der allgemeine sekretorische Transportmechanismus von E. coli durch die beteiligten Membranproteine strukturell und funktionell gut verstanden ist, sind die Eigenschaften und Voraussetzungen für die Translokation von Substratproteinen (mit Signalpeptid als Präprotein bezeichnet) bislang weniger gut charakterisiert. Der „translokationskompetente“ Zustand beschreibt die Präproteine nur phänomenologisch. Für die schlechte Translokation wurden mehrere biochemische und biophysikalische Eigenschaften der PH-Domäne in Betracht gezogen und verschiedene Mutanten hergestellt, die demzufolge eine verbesserte Translokationseigenschaft aufweisen sollten. Dabei erwies sich weder die Verringerung der thermodynamischen Stabilität noch das engineering ausgewählter, spezifischer Sequenzelemente als translokationsbegünstigend. Wird dagegen durch Einführung neuer N- und C-Termini sowie der Verbrükkung der ursprünglichen Termini mit einem Linker die Topologie verändert, können bei zwei dieser sogenannten Circularpermutanten bis zu 30-fach höhere Expressionsausbeuten im Periplasma erzielt werden. Die Circularpermutation wurde damit erstmalig erfolgreich im rationalen Proteindesign angewendet. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, daß die Mutanten der PH-Domäne vor der Translokation in einem nativ-ähnlichen Zustand gefaltet vorliegen und zur Translokation entfaltet werden müssen. Das in dieser Arbeit vorgeschlagene „Kräftemodell“ erklärt die verbesserte Translokation der Circularpermutanten CP X.6. gegenüber dem Wildtyp. Danach ist die maximale Kraft zur Entfaltung des Proteins die translokationslimitierende Größe, was sich mit Hilfe von Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie weiter untersuchen ließe. Wie sich die Mutationen an der PH-Domäne bei weiteren Transportprozessen auswirken, wurde beim mitochondrialen Import analysiert. Die untersuchten Mutanten zeigten unabhängig von ihrer thermodynamischen Stabilität und ihrer periplasmatischen Expression eine Unterbrechung des Imports. Ursache dafür ist eine Peptidsequenz von 27 Aminosäuren, die sich mit Hilfe der Circularpermutanten eindeutig identifizieren läßt. Sie führt bei der Circularpermutante CP 2.6. zu einer stabilen Expression im Intermembranraum und beim Wildtyp sowie bei der Circularpermutante CP 2.7. zu einem Verharren in der inneren Membran. Bei Mitochondrien konnte zuvor noch nie eine importunterbrechende Peptidsequenz nachgewiesen werden. Sie sollte sich zur stabilen Expression von Proteinen im Intermembranraum einsetzen lassen. In der (modellierten) Raumstruktur der PH-Domäne interagieren 19 der 27 Aminosäuren in einem Faltblatt/turn/Faltblatt-Motiv. Sie könnten als stabile Subdomäne den Import unterbrechen. Diese Interpretation ergänzt ein Modell zur Translokation von Präproteinen, wonach das Präprotein vom Intermembranraum schrittweise durch die innere Membran (bzw. den TIM-Komplex) in die Matrix diffundiert und dort arretiert wird. Dadurch wird die Rückdiffusion verhindert. Die Unterbrechung des weiteren Imports währt solange, bis aufgrund des thermodyamischen Gleichgewichts die Peptidsequenz vor der Membran entfaltet vorliegt und dann in die Matrix diffundieren kann. Ergänzende Experimente zum mitochondrialen Import sind in Vorbereitung. In dieser Arbeit konnte die PH-Domäne mit ihren Mutanten somit als Substrat für die Untersuchung von Transportprozessen etabliert werden. Die zukünftige Anwendung dieser Mutanten auf weitere Transportsysteme liegt dabei auf der Hand. Die Bibliothek randomisierter PH-Domäne wird in Kooperation mit anderen Arbeitskreisen zur Selektion spezifisch bindender und inhibierender Mutanten eingesetzt.

Die Lyme Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Infektionskrankheit des Menschen auf der Nordhemisphäre. Der Erreger Borrelia burgdorferi s. l. wird in drei humanpathogene Arten, B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii unterteilt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Struktur von Borrelia afzelii am Beispiel des Stamms PKo, dem Hautisolat eines Patienten, mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden untersucht. Raster- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen an Borrelien des B. afzelii Stammes PKo wurden zur Aufklärung der Ultrastruktur der Borrelienzelle unter in vitro Kultur- Bedingungen durchgeführt. In Abhängigkeit vom Kulturalter zeigen die Borrelien starke strukturelle Veränderungen, die rasterelektronenmikroskopisch gut zu untersuchen sind. Während der log-Phase nimmt die Anzahl der Schraubenwindungen zu und somit auch die Länge der Borrelien. Gegen Ende der log- Phase verlieren die Borrelien ihre typische Schraubengestalt. Im Lichtmikroskop (Dunkelfeld) kann man gleichzeitig einen Verlust der Beweglichkeit beobachten. Allerdings bedeutet der Verlust der Beweglichkeit nicht wie bisher angenommen gleichzeitig den Tod der Borrelien, da sich nach dem Überimpfen in frisches Kulturmedium wieder bewegliche schraubenförmige Borrelien bilden. Die Untersuchungen zur Ultrastruktur der Borrelienzelle wurden an Borrelien aus der log-Phase der Kultur durchgeführt. Die Borrelienzellen sind zu diesem Zeitpunkt 10–20 µm lang und besitzen 3–9 Schraubenwindungen. Ultradünnschnitte zeigen, daß die Borrelien aus einem Protoplasmazylinder bestehen, der von einer 4 nm dünnen Zellmembran begrenzt wird. An ihn schließt sich im Abstand von 5 nm die Zellwand an. Die Borrelienzellen sind von einer äußeren Membran umgeben, die den periplasmatischen Raum umschließt. Diese Membran ist zu einem Tunnel aufgewölbt in dem die Endoflagellen liegen. An jedem Zellende befinden sich 7–9 Flagellenansatzstellen, die in der Längsachse der Borrelienzelle angeordnet sind. Jede der Flagellen inseriert nur an einem Zellende. Im mittleren Bereich der Borrelienzelle kommt es zu einer Überlappung der Flagellen der beiden Zellenden. Die Überlappungsregion ist jedoch nur undeutlich abzugrenzen. Auf Grund dieser Untersuchungen konnte ein detailliertes, maßstabsgetreues Modell einer Borrelienzelle rekonstruiert werden. Ein weiteres Untersuchungsziel war die Aufklärung der Lokalisation wichtiger immundominanter Proteine. Mit Hilfe von Immun-Gold-Markierungen konnte durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie gezeigt werden, daß die Proteine p17 (Osp17), p35 (Osp35) und p58 (Osp58) auf der Oberfläche der äußeren Membran der Borrelienzelle lokalisiert sind. Durch die Optimierung der Markierungsmethode konnte das Signal so weit gesteigert werden, daß die gleichmäßige Verteilung dieser Proteine über die gesamte Zelloberfläche dargestellt werden konnte. Auf Grund ihrer Lokalisation auf der Oberfläche der Borrelienzelle kommen diese Proteine grundsätzlich als Vakzinekandidaten in Frage. Die Lokalisation typspezifischer und konservierter Epitope der beiden immunologisch heterogenen Oberflächenproteine OspA und OspC konnte durch Immun-Gold-Markierungen mit Hilfe typspezifischer und breitreaktiver monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden. Typspezifische und konservierte Epitope beider Proteine befinden sich auf der Oberfläche der äußeren Membran. Die Lokalisation breitreaktiver Epitope von OspA und OspC auf der Oberfläche der Borrelienzelle läßt den Einsatz dieser Proteine als Impfantigene auch im europäischen Raum erfolgversprechend erscheinen. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt kokkoide Morphotypen der Borrelienzelle zu erzeugen. Durch die Inkubation von Borrelien in Aqua dest. gelingt es innerhalb weniger Minuten auf reproduzierbare Weise diese Formvarianten der Borrelien zu erzeugen. Mittels Vitalfärbungen konnte gezeigt werden, daß es sich bei den kokkoiden Morphotypen um lebende Formvarianten der Borrelienzelle handelt. Diese Formvarianten sind nicht kultivierbar. Nach dem Überführen in Kulturmedium sind nach 4–5 Tagen nur noch schraubenförmige Borrelienzellen zu beobachten. Bei den kokkoiden Morphotypen handelt sich um eine kugelförmige Anschwellung der äußeren Membran in der sich der Protoplasmazylinder in engen Windungen aufrollt. Der vom aufgerollten Protoplasmazylinder umgebene Raum ist weitgehend strukturlos. Die Flagellen befinden sich auf der von der äußeren Membran abgewandten Seite es Protoplasmazylinders. Die Rekonstruktion von Serienultradünnschnitten ergab, daß diese kokkoiden Morphotypen jeweils von einer einzelnen Borrelienzelle gebildet werden; Protoplasmazylinder, Zellwand und äußere Membran bleiben intakt. Darüber hinaus konnte am Beispiel von Osp17, Osp35 und OspC gezeigt werden, daß die Oberflächenproteine der schraubenförmigen Borrelienzelle auch bei den kokkoiden Morphotypen auf der Oberfläche lokalisiert sind. Diese drei Proteine sind auch auf den kokkoiden Morphotypen gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt. Allerdings kommt es bei der Bildung der kokkoiden Morphotypen im Vergleich zu den schraubenförmigen Borrelienzellen zu einer deutlichen Reduktion der Oberfläche. Diese Formvarianten besitzen somit nur eine reduzierte Angriffsfläche für die Antikörper des Wirts. Sie stellen also möglicherweise Formen dar, die es den Borrelien ermöglichen dem Abwehrsystem des Wirts auszuweichen. Außerdem wurde die Adhäsion von Borrelien zweier unterschiedlicher Spezies an humane Astrozyten untersucht. Dafür wurde außer dem bereits erwähnten B. afzelii Stamm PKo der B. garinii Stamm PBi eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein Isolat aus dem Liquor eines Patienten. In einem über 24 Std. Zeitdauer durchgeführten Koinkubationsversuch konnte mittels Lichtmikroskopie gezeigt werden, daß beide Stämme an die Astrozyten adhärieren. Borrelien des B. afzelii Stamms PKo adhärieren jedoch insgesamt weit häufiger als solche des B. garinii Stamms PBi. Bei den rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigte sich, daß eine Vielzahl von Borrelien beider Stämme mit den Zellausläufern am Rand der Astrozyten und auf deren Oberfläche in Kontakt treten. Die Fähigkeit der Borrelien an die Astrozyten zu adhärieren spielt möglicherweise eine Rolle beim Übertritt von der Blutbahn ins Gehirn. Eine deutlich Reaktion der Astrozyten auf den Kontakt mit den Borrelien in Form von Oberflächenveränderungen ist nicht zu erkennen. Bei beiden Stämmen können im Rahmen der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen Borrelien gefunden werden, die in die Zellen eindringen. Dieses Eindringen kann mit Hilfe von Ultradünnschnitten durch die Koinkubationspräparate im TEM bestätigt werden. Hierbei konnten Borrelien sowohl in Vesikeln, als auch frei im Zytoplasma derAstrozyten gefunden werden. Die intrazellulär liegenden Borrelien waren auch nach 24 Std. noch intakt. Es sind keine Degenerationsformen zu erkennen. Durch das Eindringen in die Astrozyten gelingt es den Borrelien möglicherweise über längere Zeit im Wirt zu überdauern.

The regulatory immediate-early (IE) protein pp89 of murine cytomegalovirus induces CD8+ T lymphocytes that protect against lethal murine cytomegalovirus infection. The IE1 epitope is the only epitope of pp89 that is recognized by BALB/c cytolytic T lymphocytes (CTL). Using synthetic peptides, the optimal and minimal antigenic sequences of the IE1 epitope have been defined. To evaluate the predictive value of data obtained with synthetic peptides, recombinant vaccines encoding this single T-cell epitope were constructed using as a vector the hepatitis B virus core antigen encoded in recombinant vaccinia virus. In infected cells expressing the chimeric proteins, only IE1 epitope sequences that were recognized as synthetic peptides at concentrations lower than 10(-6) M were presented to CTL. Vaccination of mice with the recombinant vaccinia virus that encoded a chimeric protein carrying the optimal 9-amino-acid IE1 epitope sequence elicited CD8+ T lymphocytes with antiviral activity and, furthermore, protected against lethal disease. The results thus show for the first time that recombinant vaccines containing a single foreign nonameric CTL epitope can induce T-lymphocyte-mediated protective immunity.