Podcasts about die genotypisierung

Die chronische Parodontitis und weitere chronisch entzündliche Erkrankungen, wie Morbus Crohn, stellen komplexe multifaktorielle Krankheiten dar. Obwohl pathogene Bakterien und verschiedene Umweltfaktoren bei der Pathogenese der Parodontitis mitwirken, können diese nur einen Teil der Variabilität innerhalb von definierten Populationen der Erkrankung erklären. So spielen genetische Faktoren eine wichtige Rolle bei der Entstehung einer chronischen Parodontitis. In dieser Arbeit wurden die Polymorphismen rs11584383, rs11465804, rs2274910, rs9286879, rs3737240, rs13294, rs2476601 und rs3024505 ausgewählt, die alle auf dem Chromosom 1 liegen und zuvor als Suszeptibilitätsgene für Morbus Crohn und andere entzündliche chronische Krankheiten in genomweiten Assoziationsstudien identifiziert wurden. Die DNA von 352 Patienten mit einer chronischen Parodontitis und 587 gesunden Individuen, alle kaukasischer Herkunft, wurde untersucht. Die Genotypisierung erfolgte mittels der MALDI TOF MS Technik. Für den Polymorphismus rs2274910 konnte eine signifikante Assoziation mit der chronischen Parodontitis festgestellt werden, die sich risikoverstärkend auf die Pathogenese einer chronischen Parodontitis auswirken könnte. Der rs2274910 befindet sich in der Intron Region vom proteinkodierenden Omentin-1-Gen. Bei Omentin-1 handelt es sich um ein Adipokin, welches eine entscheidende Rolle in der Immunantwort sowie in der Regulation des Stoffwechsels spielt. Omentin-1 wird mit Diabetes mellitus Typ 2 sowie Adipositas in Verbindung gebracht, beides Krankheiten die mit einer chronischen Parodontitis assoziiert sind. Für die übrigen 7 Polymorphismen konnte keine Assoziation mit der chronischen Parodontitis nachgewiesen werden. In der Haplotypanalyse war ebenfalls keine Allelkombination mit der chronischen Parodontitis assoziiert.

ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010]. In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren. In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005]. Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist. Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet. Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert. Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005). Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben.

Über einen Zeitraum von 1,5 Jahren wurden von 1013 Schaf-, 503 Ziegen- und 555 Rindern Blutproben aus 100 bayerischen Betrieben gezogen und auf das Vorhandensein von Pestivirus-Antikörpern bzw. BVDV/ BDV untersucht. Zum Antikörpernachweis wurden kommerziell erhältliche ELISAs verwandt: Ein indirekter ELISA (Svanovir BDV-Ab-ELISA, Svanova) und ein Blocking-ELISA (Priocheck BVDV-Ab-ELISA, Prionics) für Seren kleiner Wiederkäuer und ein weiterer indirekter ELISA (Svanovir BVDV-Ab-ELISA, Svanova) für Rinderseren. Weiterhin wurden 325 Pestivirus-Isolate aus bayerischen Rindern mittels Multiplex real time RT-PCR (Cador BVDV Type 1 / 2 BDV RT-PCR, Qiagen) typisiert. Die Einzeltierprävalenz betrug bei Schafen 8,2% und bei Ziegen 1,2%. Bezogen auf 91 schafhaltende Betriebe lag die Prävalenz bei 12,0%, in einem von 17 Betrieben wurden Pestivirusantikörper bei Ziegen gefunden. Mit Kreuzneutralisationstesten wurden die Antikörper typisiert: Bei den Schafseren waren 24,1% BVDV-1-, 1,2% BVDV-2-, 4,8% BVDV-1- oder 2- und 48,2% BDV-spezifisch. Die BDV-spezifischen Seren stammten alle aus einem Betrieb. Die verbleibenden 21,7% konnten wegen nur geringer Titerunterschiede zu den SNT-Stämmen nicht typisiert werden. Alle sechs Ziegenseren stammten aus einer Herde, sie wiesen jeweils den höchsten Titer gegen BVDV-2 auf, in zwei Fällen mit einem mehr als vierfachen Abstand zu BVDV-1 und BDV. Eine signifikant höhere Anzahl an seropositiven kleinen Wiederkäuern (p= 0,003) stammte aus Betrieben mit Rinderhaltung. BVDV-Infektionen von Rindern zu kleinen Wiederkäuern wurden beobachtet, wohingegen keine Hinweise für die Übertragung von Pestiviren von kleinen Wiederkäuern zu Rindern oder für die Persistenz von BVDV in kleinen Wiederkäuern vorhanden waren. Die Genotypisierung der 325 Pestivirus-Isolate aus Rindern lieferte folgendes Ergebnis: 91,4% erwiesen sich als BVDV-1 und 8,6% als BVDV-2, BDV wurde nicht gefunden. Anhand von 128 Schafseren mit neutralisierenden Antikörpern wurden Sensitivitäten von 81% für den indirekten ELISA und 94% für den Blocking-ELISA bestimmt. Die Spezifitäten lagen jeweils bei 93% and 100% (N=200 SNT-negative Seren).

Es ist anzunehmen, dass genetische Faktoren einen Großteil der kognitiven Fähigkeiten eines Menschen beeinflussen. Hereditätsschätzungen gehen von etwa 50% aus. Einzelne Polymorphismen innerhalb verschiedener Gene können dabei Auswirkungen auf die kognitive Leistungsfähigkeit haben. In dieser Arbeit wurden die Polymorphismen rs913964 und rs1330581 innerhalb des GAD2-Gens auf eine Assoziation mit Intelligenz untersucht. Das GAD2-Gen, welches für das Enzym Glutamatdecarboxylase 65 codiert, wird insbesondere in Nervenzellen des Gehirns exprimiert. Die von der Glutamatdecarboxylase 65 synthetisierte gamma-Aminobuttersäure, GABA, stellt den wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Zentralnervensystem dar und übernimmt bedeutende Aufgaben bei der Entwicklung des Nervensystems sowie bei der Weiterleitung und Regulierung von sensorischen und motorischen Signalen. Verschiedene Ergebnisse aus Tierversuchen sowie neurologische und psychiatrische Erkenntnisse lassen auf eine bedeutende Rolle der Glutamatdecarboxylase 65 im Hinblick auf GABAerge, synaptische Vorgänge im menschlichen Gehirn schließen. Eine Beteiligung des Enzyms an der Entwicklung kognitiver Fähigkeiten beim Menschen kann somit in Erwägung gezogen werden. Für Polymorphismen im GAD1-Gen, das für eine andere Isoform der Glutamatdecarboxylase codiert, wurden bereits Assoziationen zu unterschiedlichen kognitiven Phänotypen erstellt. Mit 286 neuropsychiatrisch gesunden, deutschstämmigen Probanden aus München wurde der Hamburg-Wechsler-Intelligenztest für Erwachsene – Revision 1991 durchgeführt. Die Genotypisierung der Polymorphismen erfolgte mit Hilfe eines SNP-Microarrays. Für den Polymorphismus rs913964 wurde bei den Untertests Rechnerisches Denken und Figurenlegen ein Zusammenhang mit der Allelverteilung nachgewiesen. Dem G-Allel konnten dabei jeweils bessere Ergebnisse zugeschrieben werden als dem A-Allel. Für den Untertest Rechnerisches Denken zeigte die Assoziation einen signifikanten Unterschied und für den Untertest Figurenlegen einen Trend. Die Analyse des Polymorphismus rs1330581 erbrachte einen Trend für die Assoziation der Genotypverteilung mit Werten des Handlungs-IQs und einen signifikanten Unterschied für die Rohwerte aus dem Untertest Bilderordnen. Dabei schnitten Personen mit dem heterozygoten Genotyp A/G besser ab als solche mit den homozygoten Genotypen A/A und G/G. Personen mit dem Genotyp G/G erzielten die schlechtesten Leistungen. Zudem konnte, ähnlich wie für den Polymorphismus rs913964, ein deutlicher Trend für die Assoziation der Allelverteilung mit den Ergebnissen aus dem Untertest Rechnerisches Denken ermittelt werden. G-Allelträger erzielten hierbei bessere Ergebnisse als A-Allelträger. Die Assoziation zweier Polymorphismen im GAD2-Gen mit kognitiven Leistungen in einer deutschen Stichprobe weist somit auf eine Mitbeteiligung dieses Gens an der Ausbildung von Intelligenz hin. Beide analysierten Polymorphismen liegen auf Introns innerhalb des GAD2-Gens. Folglich handelt es sich hierbei um keine funktionellen Polymorphismen. Als denkbare Ursachen für eine quantitative oder funktionelle Veränderung der Glutamatdecarboxylase 65 kommen verändertes Spleißen, die mögliche Lage in Linkage Disequilibrium zu einem bisher nicht untersuchten, funktionellen Polymorphismus oder ein unterschiedlicher Expressionsgrad durch Beeinflussung der DNA-Bindungsaffinität zu regulatorischen Proteinen in Frage. Ein Mangel oder eine Fehlfunktion von GAD65 würde in Folge einer reduzierten GABA-Synthese bzw. -Freisetzung zu einer gestörten Feinregulation der inhibitorischen Signalübertragung an sensorischen und motorischen Schaltstellen führen. Die postnatale Reifung der Gehirnwindungen, die neuronale Migration, die Zelldifferenzierung und die Synaptogenese sind ebenfalls abhängig von GAD65 bzw. GABA. Veränderungen der Expression oder der Funktion des Enzyms könnten somit Auswirkungen auf die kognitiven Fähigkeiten haben.