Podcasts about epifluoreszenz

Die Zellkernarchitektur beschreibt die räumliche Anordnung der linearen Gensequenz im dreidimensionalen Zellkern. Die Beobachtung einer geordneten räumlichen Strukturierung und radialen Verteilung der Gene und Chromosomen legt nahe, daß die Zellkernarchitektur Basis und Ausdruck von höheren Organisations- und Regulationsmechanismen ist. Chromosomen liegen im Interphasezellkern in definierten umschriebenen Regionen, sogenannten Chromosomenterritorien vor. Aus früheren Untersuchungen weiß man um die Gendichte-korrelierte radiale Anordnung dieser Chromosomenterritorien. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Frage, inwieweit die Gendichte eines subchromosomalen DNA-Bereiches (also eines Teilabschnittes eines Chromosoms) die Position dieses DNA-Abschnittes in Bezug auf das Chromosomenterritorium und den Interphasezellkern beeinflußt. Mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an 2D- und 3D-fixierten Zellkernen (2D/3D-FISH) und Epifluoreszenz- bzw. konfokaler Mikroskopie wurden spezifische subchromosomale Bereiche unterschiedlichen Gengehalts der Chromosomen 1 und 12 differentiell dargestellt. Beide Chromosomen zeichnen sich durch eine distinkte Gliederung in sehr genarme und sehr genreiche Areale aus. Als DNA-Sonden wurden fluoreszenzmarkierte Pools aus exakt kartierten BAC-Klonen von Chromosom 1 und 12 eingesetzt, die entweder einer R- oder G-Bande oder alternativ einem chromosomalen Abschnitt hoher oder niedriger Gendichte zugeordnet waren. Um mögliche andere, von der Gendichte unabhängige Einflüsse auf die radiale Verteilung subchromosomaler Bereiche wie z.B. die Kerngestalt zu identifizieren, wurden die Versuche an drei unterschiedlichen menschlichen Zellarten, Lymphozyten, Fibroblasten und Coloncarcinomzellen der Zellinie SW480, sowohl während der S-Phase als auch nach Verlassen des Zellzyklus in der G0-Phase durchgeführt. Die quantitative Evaluation der Anordnung und der radialen Verteilung der DNA-Segmente in Bezug auf das Chromosomenterritorium bzw. auf den Kern erfolgte an 3D-Rekonstruktionen von lichtoptischen Serienschnitten mittels zweier unabhängiger computergestützter Auswertungsprogramme. Es konnte gezeigt werden, daß in den annähernd runden Lymphozyten radiale Verteilungsunterschiede in Korrelation zur Gendichte gegeben sind: Genarme Bereiche des Chromosoms 12 ordnen sich unabhängig vom Zellzykluszeitpunkt in Bezug auf den geometrischen Mittelpunkt des Interphasekerns peripherer an als genreiche. Dieser Befund stützt die Hypothese, daß genreiche Regionen von Chromosomen eher zum Zellkernmittelpunkt hin präsentiert, genarme dagegen in die Peripherie verlagert werden. In der S-Phase konnte eine ebensolche radiale Verteilung auch in Bezug auf das Chromosomenterritorium gefunden werden. Hier wird die genarme DNA schwerpunktmäßig an den Rand des Territoriums verschoben. Anders verhält es sich bei den adhärent wachsenden, flachen humanen Fibroblasten. Hier konnte kein signifikanter Unterschied in der dreidimensionalen, räumlichen Anordnung genarmer und genreicher DNA-Abschnitte gefunden werden, und zwar weder in Bezug auf den Kern noch auf das Territorium. SW480-Tumorzellen sind rundliche bis ellipsoide Zellen. Ähnlich den Lymphozyten zeigen sie klare radiale Anordnungsunterschiede von Bereichen des Chromosoms 12, sortiert nach der Gendichte. Allerdings sind diese Unterschiede weniger stark ausgeprägt als bei den Lymphozyten. So konnte nur in Bezug auf das Chromosomenterritorium ein signifikanter radialer Verteilungsunterschied gefunden werden. In Bezug auf den Kern sieht man eine deutliche, aber statistisch nicht signifikante Tendenz, genarmes Chromatin in die Peripherie zu verlagern. Insgesamt belegen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, daß das Prinzip der Korrelation von Gendichte und radialer Verteilung grundsätzlich auch für subchromosomale Bereiche gilt. Es läßt sich jedoch feststellen, daß bei der radialen Verteilung von Chromosomenabschnitten weitere, noch nicht bekannte Faktoren eine Rolle spielen und sie nicht ausschließlich durch die Gendichte bestimmt wird.

In der vorliegenden Arbeit sollten Störungen der zerebralen Mikrozirkulation insbesondere im Hinblick auf die Aktivierung von Leukozyten-Endothelinteraktionen nach der globalen zerebralen Ischämie untersucht werden. Darüber hinaus sollte die Rolle der beiden Mediatoren Platelet-activating factor und Bradykinin bei der Aktivierung der Leukozyten-Endothelinteraktionen aufgeklärt werden. Es sollte dabei auch der Einfluss der Mikrozirkulationsstörungen und der beiden Mediatoren Platelet-activating factor und Bradykinin auf das neurologische Defizit und den ischämischen Hirnschaden berücksichtigt werden. Mit untersucht wurde das therapeutische Potenzial von PAF- und Bradykinin-Rezeptorantagonisten in Hinblick auf die zerebrale Ischämie. Die globale zerebrale Ischämie mit einer Dauer von 15 Minuten wurde an 153 mongolischen Wüstenrennmäusen (Gerbil) durch Verschluss beider Aa. carotides communes induziert. Vor und bis zu drei Stunden nach der Ischämie wurden Aufnahmen der oberflächlichen kortikalen Mikrozirkulation mit der intravitalen Epifluoreszenz-mikroskopie durch ein transdurales Schädelfenster angefertigt. Die Tiere atmeten spontan in Halothan-Maskennarkose, der arterielle Blutdruck wurde kontinuierlich überwacht und die Körpertemperatur mit einer Heizplatte bei 37,0 ̊C gehalten. Mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC-Dextran (MG 150 000) wurden die Gefäße kontrastiert, Rhodamin 6 G diente zur in vivo Anfärbung von Leukozyten. Die Analyse der intravital-mikroskopischen Bilder erfolgte off-line mit einem Computer-unterstützten Bildverarbeitungssystem. Als Parameter wurden die Leukozyten-Endothelinteraktionen, die Durchmesser von Arteriolen und Venolen und die funktionelle Kapillardichte quantitativ beurteilt. Zusätzlich konnte die zerebrale mikrovaskuläre Perfusion durch Messung der arterio-venösen Transitzeit bestimmt werden. Während einer Beobachtungszeit von vier Tagen wurde täglich das neurologische Defizit mit einem Neuroscore und danach histomorphologisch der ischämische Hirnschaden erfasst. Der PAF-Rezeptorantagonist WEB 2170 wurde in zwei verschiedenen Dosierungen, 2 und 20 mg/kg KG, 15 Minuten vor Induktion der Ischämie intravenös injiziert. Der Bradykinin B1-Rezeptorantagonist B 9858, der B2-Rezeptorantagonist CP 0597 und der kombinierte B1/B2-Rezeptorantagonist B 9430 wurden jeweils als Bolus von 18 μg/kg KG 15 Minuten vor der Ischämie i.v. injiziert, gefolgt von einer kontinuierlichen subkutanen Infusion mittels osmotischer Minipumpe in einer Dosierung von 300 ng/kg/min bis zum Ende des Versuchs am Tag vier nach der Ischämie. Aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit können folgende Schlüsse gezogen werden: Die postischämische Hypoperfusion, die für die Reperfusion nach der globalen zerebralen Ischämie charakteristisch ist, ist weder Folge einer arteriolären Vasokonstriktion noch Folge des Verschlusses von Kapillaren. Nach dem Ende der Okklusion beider Aa. carotides communes ist die Perfusion der kortikalen Kapillaren weitgehend erhalten, das “no-reflow”-Phänomen tritt nach der globalen zerebralen Ischämie mit einer Dauer von 15 Minuten nicht auf. Das Rollen von Leukozyten wurde durch den PAF-Antagonisten nicht beeinflusst. Die Applikation von WEB 2170 mit einer Dosis von 20 mg/kg KG verminderte selektiv die feste Adhärenz von Leukozyten am venolären Endothel in der frühen Reperfusionsphase nach der globalen zerebralen Ischämie. Die Vasomotorik und die zerebrale Durchblutung sind weder unter physiologischen Bedingungen noch während der Reperfusion nach der globalen Ischämie durch den Mediator PAF reguliert. Das neurologische Defizit nach der Therapie mit dem PAF-Antagonisten entspricht dem der Kontrolltiere. Auch der Untergang selektiv vulnerabler Nervenzellen konnte durch die Therapie nicht vermindert werden. Bradykinin vermittelt sowohl das Rollen als auch die feste Adhärenz von Leukozyten am Gefäßendothel. Die selektive Blockade des B1- oder des B2-Rezeptors reduzierte die Leukozyten-Endothelinteraktionen im gleichen Ausmaß. Die kombinierte Blockade beider Bradykininrezeptoren hatte keinen zusätzlichen hemmenden Effekt. Bei Antagonisierung des B2-Rezeptors war der Durchmesser pialer Arteriolen während der frühen Reperfusionsphase um bis zu 27 % reduziert. Daraus lässt sich schließen, dass die Aktivierung des B2-Rezeptors durch Bradykinin nach der globalen Ischämie zur arteriolären Vasodilatation führt. Die Mortalität der Tiere war bei der selektiven Blockade des B1-Rezeptors und bei der kombinierten Blockade beider Rezeptoren signifikant erhöht. Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung des Bradykinin B1-Rezeptors in der Reperfusionsphase nach der globalen Ischämie neuroprotektiv wirkt. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch weitgehend unklar, eine Erklärung kann derzeit nicht angeboten werden. Die Entzündungsreaktion nach der globalen zerebralen Ischämie bei der mongolischen Wüstenrennmaus trägt nicht zur Entwicklung des sekundären Hirnschadens bei, ein Zusammenhang zwischen dem Ausmaß der Leukozyten-Endothelinteraktionen und dem neurologischen Defizit oder der Überlebensdauer liegt nicht vor. Die Hemmung der postischämischen Entzündungsreaktion nach der globalen zerebralen Ischämie (z.B. nach kardiopulmonaler Reanimation) beim Menschen erscheint daher wenig sinnvoll. Beide in den Experimenten untersuchten Mediatoren, PAF und Bradykinin, tragen zur Aktivierung der Leukozyten-Endothelinteraktionen bei. Die Antagonisierung beider Mediatoren hat eine teilweise Reduzierung, allerdings nicht eine vollständige Hemmung der Leukozyten-Endothelinteraktionen zur Folge. Weiterführende Untersuchungen an dem von uns verwendeten Modell, z.B. mit der Antagonisierung weiterer Mediatoren (Endothelin, Cytokine) oder der Blockade von Adhäsionsmolekülen (Selektine, Integrine), sollten die Aufklärung des Wechselspiels der zahlreichen potenziellen Mechanismen der Aktivierung von Leukozyten nach der globalen zerebralen Ischämie möglich machen. Darüber hinaus ist der Vergleich der dargestellten Daten mit Ergebnissen aus Experimenten mit einer fokalen, länger andauernden Ischämie wichtig, um die Kenntnisse über die postischämischen Störungen der Mikrozirkulation erweitern zu können. Erst die vollständige Klärung der komplexen und multifaktoriellen pathophysiologischen Prozesse, die bei der zerebralen Ischämie ablaufen, wird eine effektive Therapie des ischämischen Hirnschadens möglich machen.

Ziel dieser Arbeit war es ein serologisches Testystem für die Beantwortung ökologischer Fragestellungen zur Denitrifikation zu etablieren. Für den in situ-Nachweis der Expression des denitrifizierenden Enzymsystems in Bakterien wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen die Cu-haltige dissimilatorische Nitritreduktase (Cu-dNIR) entwickelt. Die für die Produktion der Antikörper benötigte Cu-dNIR wurde mit Hilfe zweier Ansätze präpariert. Der erste Ansatz, die Kombination verschiedener Säulenchromatografien und Reinigung über eine Polyacrylamid-Matrix, erlaubte das Enzym aus einem Bodenisolat von Ochrobactrum anthropi mit einer Ausbeute von 2,5 µg/g Zellen (Feuchtgewicht) zu gewinnen. In einem zweiten Ansatz wurde die Cu-dNIR aus Alcaligenes faecalis S6 nach Fusion mit einem 6 x His-tag in E. coli exprimiert und anschließend über eine spezifische Affinitätsmatrix aufgereinigt. Hiermit konnte eine Ausbeute von 4,5 mg/l [2,25 mg/g Zellen (Feuchtgewicht)] Bakterienkultur gewonnen werden. Mit der Cu-dNIR der beiden Präparationsansätze wurden Mäuse immunisiert und nach drei Zellfusionen 41 verschiedene Hybridomalinien etabliert, deren sezernierte Antikörper in einem ersten Screening im Chemolumineszenz-ELISA mit der für die Immunisierung benutzten CudNIR reagierten. Hieraus wurden über weitere Screeningschritte im Western-Blot zwei Antikörper zur genaueren Charakterisierung ausgewählt: Ein sehr spezifischer Antikörper (mAkdNIR1a), der ausschließlich die zur Immunisierung eingesetzte Cu-dNIR aus Ochrobactrum anthropi 1a erkennt; und ein zweiter Antikörper (mAkdNIR29) mit einem breiteren Reaktionsspektrum für Cu-dNIRs aus Bakterien unterschiedlicher phylogenetischer Herkunft. Beide Antikörper zeigten keine Kreuzreaktionen mit alternativen dissimilatorischen Nitritreduktasen des cd1-bzw. Sirohäm-Typs aus Pseudomonas aeruginosa bzw. E. coli. Die im Chemolumineszenz-ELISA bestimmte Sensitivität für mAkdNIR1a liegt bei 2 ng Cu-dNIR. Mit mAkdNIR29 konnte rekombinante Cu-dNIR bis 5 ng nachgewiesen werden. Mit dem Antikörper mAkdNIR29 konnte eine Differenzierung zwischen Reinkulturen von Alcaligenes faecalis S6, die unter denitrifizierenden bzw. nicht denitrifizierenden Bedingungen gewachsen waren, im Western Blot gezeigt werden. Weiterhin wurde der zeitliche Verlauf der Expression von Cu-dNIR in Ochrobactrum anthropi nach Shift vom aeroben in anaerobes Milieu mittels Immunofluoreszenz mit makdNIR29 auf Einzelzellniveau verfolgt. Das Maximum der Expression wurde nach 7 h erreicht. Der Verlauf der Expressionsstärke folgt der Zunahme der N2O-Produktion pro Zeiteinheit bezogen auf die Zellzahl. Die Expressionsrate der Cu-dNIR ist am stärksten während der exponentiellen Wachstumsphase. Die beiden anti-dNIR-Antikörper konnten in Kombination mit Epifluoreszenz-und Laserscanning- Mikroskopie erfolgreich zur in situ-Detektion der Expression von Cu-dNIR durch Immunofluoreszenz in Reinkulturen und Umweltproben eingesetzt werden. Der Antikörper mAkdNIR1a wurde wegen seiner Spezifität zum Nachweis von Cu-dNIR-induzierten Bakterien an Wurzeln von Weizenpflänzchen eingesetzt, die zuvor mit Ochrobactrum anthropi inokuliert worden waren. Mit dem Antikörper mAkdNIR29 wurden Cu-dNIR-induzierte Bakterien in Klärschlammproben aus zwei verschiedenen Kläranlagen detektiert. Ein Protokoll zur simultanen Markierung von denitrifizierenden Zellen von Ochrobactrum anthropi 1a mit dem Antikörper mAkdNIR1a und einer rRNS-gerichteten Oligonukleotidsonde wurde entwickelt. Immunofluoreszenzmarkierungen mit mAkdNIR29 ermöglichten die Trennung von Cu-dNIRinduzierten und Cu-dNIR-nicht-induzierten Zellen von O. anthropi mittels Durchflusszytometrie in zwei klar abgegrenzte Populationen.