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Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die histochemischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der Leber des Rindes mit modernen morphologischen Methoden näher zu untersuchen. Dabei sollte zugleich festgestellt werden, ob und in wie weit sich diese zwischen den einzelnen Leberlappen (Lobi hepatici) unterscheiden. Das Untersuchungsmaterial stammte von, als frei von pathologischen Befunden beurteilten Lebern frisch geschlachteter Rinder. Daraus wurden Präparate für konventionell lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen hergestellt. Als Grundlage für die konventionell lichtmikroskopischen Studien dienten Hämatoxylin-Eosin-, Masson-Goldner, Alcianblau 8GX- sowie PAS-gefärbte Schnitte. Bei den immunhistochemischen Analysen wurde der Nachweis von Zytokeratin 5, 8, 14, 18 und 19 sowie von Vimentin verfolgt. Bei den glykohistochemischen Untersuchungen kamen 14 verschiedene Lektine pflanzlicher Herkunft, deren Bindungsverhalten im Lebergewebe fluoreszenzmikroskopisch erfasst wurde zum Einsatz. Die ultrastrukturelle Analyse des Lebergewebes erfolgte transmissionselektronenmikroskopisch. Die Auswertung begann mit der konventionellen Lichtmikroskopie. Bereits die Analyse der HE-gefärbten Schnitte legte nahe, dass sich die Lobi hepatici mikroanatomisch nicht unterscheiden, was sich im Zuge der weiteren Analysen bestätigte. Die Färbung mit Alcianblau 8GX zeigte zudem zum einen das Vorkommen von Mastzellen im Bindegewebe der Rinderleber an und deutete zum anderen auf die Synthese und Sekretion von sauren Mucopolysacchariden, durch die insbesondere am Beginn des extralobulären Teils des Gallengangssystems gelegenen Epithelzellen hin. In der mit und ohne Amylasevorbehandlung durchgeführten PAS-Reaktion erwiesen sich darüber hinaus die Läppchenzentren als die Speicher des Leberglykogens, wobei deren Umfang in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation großen Schwankungen unterlag. Im Zuge der immunhistochemischen Studien konnte Zytokeratin 5 überhaupt nicht, und die Zytokeratine 8, 14, 18 und 19 nur in den Gallengangsepithelzellen nachgewiesen werden, wobei die einzelnen Zytokeratine nicht in allen Bereichen des Gallengangssystems, sondern nur in ganz bestimmten, für das jeweilige Zytokeratin individuell spezifischen Abschnitten deutlich in Erscheinung traten. Dieses Zytokeratin-Nachweismuster erlaubte unter Einbeziehung anatomischer, topographischer und morphologischer Gesichtspunkte eine Gliederung des Gallengangssystems in die überwiegend CK 8-positiven, zentralen Ductuli biliferi, die hauptsächlich CK 14-positiven, peripheren Ductuli biliferi sowie die, für die Verbindung zwischen dem intra- und extralobuären Teil des Gallengangssystems verantwortlichen, primär CK 18-positiven Ductus interlobulares biliferi kleinerer bis mittlerer Größe, und die von CK 19 dominierten Ductus interlobulares biliferi besonders großen Durchmessers. Diese sich unter Berücksichtigung des Zytokeratin-Nachweismusters ergebende Gliederung des intrahepatischen Gallengangssystems, spiegelte, mit Blick auf die Eigenschaften der einzelnen Zytokeratine, zugleich auch die embryologische Entwicklung des lichtmikroskopisch sichtbaren Teils des Gallenganssystems, beginnend mit den zentralen Ductuli biliferi bis hin zu den größten, am weitesten entwickelten Ductus interlobulares biliferi wieder. Das Auftreten der normalerweise außer für Basalzellen mehrschichtiger Epithelien nur noch für Zellarten mit mindestens bipotentem Potential typischen CK-14- Expression in den einschichtigen Gallengangsepithelien, ließ vermuten, dass auch die bovinen Gallengangsepithelzellen wenigstens zu einem gewissen Grad über bipotentes Potential verfügen. Vimentin war im gesamten Bindegewebe sowie im Endothel aller Blutgefäße nachweisbar. Im Rahmen der glykohistochemischen Untersuchungen zeigten das Endothel, insbesondere der Arterien und Sinusoide, im Vergleich zu den übrigen Strukturen des Lebergewebes den stärksten Besatz mit verschiedenartig gestalteten Glykanen. Dies war angesichts der zahlreichen Funktionen der Endothelzellen, wie etwa Aufrechterhaltung der Gewebestabilität, Mitwirkung an immunologischen Prozessen, Schaffung eines Gleichgewichtszustands zwischen Koagulation und Antikoagulation sowie Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, deren Erfüllung nur aufgrund der umfangreichen Glykokalix möglich ist, nicht überraschend. Darüber hinaus wurde eindeutig ersichtlich, dass die Zuckerketten der arteriellen, venösen und sinusoidalen Endothelzellen jeweils ganz individuell spezifische, sich von denen der anderen Gefäßarten gänzlich unterscheidende Glykane tragen, was sich darauf zurückführen ließ, dass die verschiedenen Gefäßarten verschiedene Aufgaben bevorzugt wahrnehmen. Neben den Endothelzellen stellten sich auch die Hepatozyten als Träger von verhältnismäßig vielen, verschiedenartig gestalteten Glykane dar, wobei sich deren Präsenz nicht nur auf die Glykokalix beschränkte, sondern sie auch im Golgi-Apparat, sowie im Zytoplasma selbst nachgewiesen werden konnten. Im letzten Fall bestand der Verdacht, dass es sich aufgrund des, durch die rein auf Con A begrenzte Bindungsaffinität angezeigten, hohen Mannosereichtums der Kohlenhydratstrukturen um die Glykane von lysosomalen Enzymen und von, vom Hepatozyten synthetisierten und zur Sekretion vorgesehenen Glykoproteinen und -lipiden handelte. Bei den Gallengangsepithelzellen als weiterer Zellart, die über relativ zahlreiche, verschiedenartig strukturierte Glykane verfügt, traten diese ebenfalls nicht nur als Bestandteil der Glykokalix, sondern auch im Zytoplasma in Erscheinung. Die im Zytoplasma beobachteten, ebenfalls nur Con A-positiven und damit stark Mannose reichen Glykane ließen vermuten, dass auch die Gallengangsepithelzellen neben lysosomalen Enzymen zum Export vorgesehene Makromoleküle produzieren. Als derartige Makromoleküle kamen die bereits in der Färbung mit Alcianblau 8GX nachgewiesenen, sauren Mucopolysaccaride in Betracht. Sie könnten als Gallebeimengung ähnlich wie Phospholipide die Löslichkeit des zur Kristallisation neigenden Cholesterols erhöhen. Die, mit der Größenzunahme der Gallengänge korrelierende, zunehmende Reaktionsfreudigkeit der Epitheloberfläche implizierte eine, mit dem Übergang vom iso- zum hochprismatischen Epithel einhergehende, durch den Einbau weiterer Kohlenhydratmoleküle gekennzeichnete Weiterdifferenzierung der epithelialen Glykokalix. Sie dürfte durch Rezeptor-Liganden spezifische Erkennung zur Reabsorption vorgesehener Stoffe wesentlich an der, insbesondere im Anfangsteil des Gallengangssystems stattfindenden Modifikation der Primär- zur Sekundärgalle beteiligt sein. Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen, deren Schwerpunkt auf die Parenchymzellen sowie den Disse Raum gelegt wurde, stand der Speziesvergleich im Vordergrund. Dabei zeichnete sich die Leber des Rindes durch Hepatozyten mit sehr spärlichem Mikrovillibesatz, Endothelzellen mit besonders kräftigen, trabekulären von einer kontinuierlichen Basalmembran unterlagerten Fortsätzen, Ito-Zellen mit ebenfalls sehr starken Ausläufern und wenigen, aber sehr großen Fettropfen sowie einem, von Kollagenfibrillen und Mikrofilamenten nahezu völlig freien, Disse Raum aus.

Der akute Myokardinfarkt stellt in den Industrienationen immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Auch nach Wiedereröffnen des Gefäßes führt eine prolongierte myokardiale Ischämie zur Ausbildung eines Infarktareals. Neben der irreversiblen Schädigung der Myozyten während der Ischämie kommt es auch zu dem so genannten Reperfusionsschaden, dieser kann aber, zumindest tierexperimentell, durch eine entsprechende Therapie verringert werden. Wir konnten bereits zeigen, dass die retrograde Applikation von embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, von murinen Embryonen Tag 7,5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) eine Kardioprotektion über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Reduktion der Infarktgöße war über einen PI3K-AKT Signaltransduktionsweg vermittet. In der hier vorliegenden Studie haben wir uns mit dem Einfluss von Thymosin β4 auf die eEPC vermittelte Kardioprotektion beschäftigt. Methoden: In vitro wurden neonatale ventrikuläre Myozyten der Ratte einer Hypoxie (4 h) und Reoxygenation (1 h) ausgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden mittels Trypan-Blau-Exklusion identifiziert. Des Weiteren wurden neonatale ventrikuläre Endothelzellen der Ratte auch einer Hypoxie (18 h) und Reoxygenation (4 h) ausgesetzt und die Apoptoserate mittles TUNEL-Färbung analysiert. Embryonale EPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion wurden während Hypoxie kokultiviert oder Thymosin β4 Protein wurde dem Medium zugesetzt. In Schweinen (n= 9 pro Gruppe) wurde am Tag 1 mittels LAD-Verschluß (1 h) ein Infarkt induziert. 5x106 eEPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion oder Thymosin β4 Protein wurden nach 55 min Ischämie in die anteriore interventrikulare Herzvene retroinfundiert. Nach 24 h Reperfusion wurden die globale und regionale Myokardfunktion (Sonomikrometrie) sowie die Infarktgröße bestimmt. Darüber hinaus wurde die Inflammation mittels Myeloperoxidase Analyse im Gewebe untersucht. Ergebnisse: Die „short hairpin“ Ribonukleinsäure (shRNA) Transfektion führte zu einer verringerten Thymosin „messanger“ RNA Expression in „real time“ Polimerase Kettenreaktions-Untersuchungen (rt-PCR). In Zellkultur war der Anteil überlebender neonataler Kardiomyozyten in Anwesenheit von eEPCs signifikant erhöht, wenn diese Zellen Thymosin β4 exprimierten. Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte eine deutlich geringere Apoptoserate der neonatalen Endothelzellen, die mit eEPCs kokultiviert wurden, es sei denn die Thymosin β4 Expression wurde durch Transfektion der shRNA reduziert. Die Applikation von Thymosin β4 Protein zeigte bei beiden Zellarten ein ähnliches Ergebnis wie die Kokultivierung mit den eEPCs. In vivo waren nach 24 h zahlreiche Zellen im ischämischen Areal nachweisbar. Die Anzahl der Zellen war durch die Reduktion der Thymosin β4 Expression nicht beeinträchtigt. Die regionale Applikation der eEPCs reduzierte die Infarktgröße signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, wohingegen die Thymosin β4 shRNA Transfektion der eEPCs diesen Effekt inhibierte. Auch hier zeigte die retrograde Applikation des Thymosin β4 Proteins eine kardioprotektive Wirkung, die ähnlich ausgeprägt war wie die der eEPCs. Die Analyse der TUNEL-positiven Zellen zeigte eine deutliche Reduktion der Apoptoserate nach Retroinfusion der eEPCs oder des Thymosin β4 Protein, auch hier verloren die eEPCs ihre protektiven Eigenschaften nach der Transfektion mit Thymosin β4 shRNA. Die Inflammation im Ischämieareal, ein wichtiges Kennzeichen für die Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens, konnte durch die Verabreichung von eEPCs und auch Thymosin β4 Protein signifikant reduziert werden. Die Reduktion der Thymosin β4 Expression verhinderte wiederum diesen kardioprotektiven Effekt. Diese Untersuchungen zeigen, dass embryonale endotheliale Vorläuferzellen den Ischämie/Reperfusionsschaden zu einem frühen postischämischen Zeitpunkt verringern. Der kardioprotektive Effekt dieser Zellen ist zumindest teilweise Thymosin β4 abhängig, da eine analoge Protektion durch die lokale Applikation von Thymosin β4 Protein erreicht werden kann. Generell zeigt diese Arbeit, dass neben dem direkten Einsatz von Vorläuferzellen und Stammzellen zur Behandlung des Reperfusionsschadens diese Zellen auch genutzt werden können, um mögliche Kandidatenproteine zur Kardioprotektion nach akutem Myokardinfarkt zu identifizieren und somit eine effektive Therapie des Reperfusions-schadens beim Menschen zu ermöglichen.

Unsere Untersuchungen zeigen erstmalig eine Vierfach-Immunfluoreszenz auf humanen mesenchymalen Stammzellen. Dieses Verfahren ermöglicht es, die Zellen auf Einzelzellebene zu analysieren und die Lokalisation der nachgewiesenen Antigene zu untersuchen. Die markierten Proteine Fibronectin, Kollagen I, Kollagen IV und CD 44 gehören dabei zum typischen Expressionsmuster von mesenchymalen Stammzellen. Durch die Kombination von Filtersets und dem Einsatz des spektralen Bildanalyseprogramms SpectraView (ASI, Israel) gelang es selbst Wellenlängen, die näher als 20nm beieinander lagen, voneinander zu unterscheiden. Bei der Auswertung bestätigte sich, dass hMSC aus einem heterogenen Zellpool bestehen. Dies zeigte sich unter anderem in der unterschiedlichen Expression des Markers Kollagen IV. Erweitert man nun das Färbeprofil um zusätzlichen Marker, so können diese Zellen auf Einzelzellebene eingehender untersucht und von anderen Zellarten und Vorläuferstufen abgegrenzt werden. Die in dieser Arbeit neu für diese Applikation etablierte Methode stellt einen erfolgsversprechenden Ansatz zur Identifikation und Charakterisierung von humanen mesenchymalen Stammzellen dar.

EBV ist ätiologisch eng mit verschiedenen malignen Erkrankungen des Menschen verbunden Die meisten Erkenntnisse über die Funktionen viraler Proteine, die z. B. bei der B-Zell-Trans-formation eine Rolle spielen, stammen aus Zellkulturexperimenten, denen allerdings die Komponenten und die Komplexität eines lebenden Organismus fehlen, weswegen ein Tiermodell wünschenswert ist. Eine Möglichkeit nähere Informationen über die Machbarkeit eines Tiermodells zu bekommen, führt über die genetische Manipulation von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) der Maus. Dazu wurde die genetische Information des Epstein-Barr Virus direkt in EBNA1-positive ES-Zellen der Maus einbracht und die Aufrechterhaltung des Gesamtgenoms als extrachromosomales Plasmid nachgewiesen werden. Die ES-Zellen wurden dann in vitro zu B-Zellen differenziert, um den transformierenden Phänotyp dieses Virus in murinen B-Zellen zu analysieren. Sowohl in den ES-Zellen als auch in den in vitro differenzierten B-Zellen wurde eine Expression der Gene LMP1 und LMP2A gefunden, nicht aber eine Expression des Gens EBNA2. Dieses Expressionsmuster ist charakteristisch für die Latenz II des Virus. Die viralen EBNA-Promotoren waren in beiden Zellarten aktiv, aber eine genaue Analyse ergab Hinweise auf Probleme bei der Transkription bzw. bei der mRNA-Prozessierung. Dies ist vermutlich der Grund für das Fehlen einer EBNA2-Genexpression.

Die Zellkernarchitektur beschreibt die räumliche Anordnung der linearen Gensequenz im dreidimensionalen Zellkern. Die Beobachtung einer geordneten räumlichen Strukturierung und radialen Verteilung der Gene und Chromosomen legt nahe, daß die Zellkernarchitektur Basis und Ausdruck von höheren Organisations- und Regulationsmechanismen ist. Chromosomen liegen im Interphasezellkern in definierten umschriebenen Regionen, sogenannten Chromosomenterritorien vor. Aus früheren Untersuchungen weiß man um die Gendichte-korrelierte radiale Anordnung dieser Chromosomenterritorien. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Frage, inwieweit die Gendichte eines subchromosomalen DNA-Bereiches (also eines Teilabschnittes eines Chromosoms) die Position dieses DNA-Abschnittes in Bezug auf das Chromosomenterritorium und den Interphasezellkern beeinflußt. Mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an 2D- und 3D-fixierten Zellkernen (2D/3D-FISH) und Epifluoreszenz- bzw. konfokaler Mikroskopie wurden spezifische subchromosomale Bereiche unterschiedlichen Gengehalts der Chromosomen 1 und 12 differentiell dargestellt. Beide Chromosomen zeichnen sich durch eine distinkte Gliederung in sehr genarme und sehr genreiche Areale aus. Als DNA-Sonden wurden fluoreszenzmarkierte Pools aus exakt kartierten BAC-Klonen von Chromosom 1 und 12 eingesetzt, die entweder einer R- oder G-Bande oder alternativ einem chromosomalen Abschnitt hoher oder niedriger Gendichte zugeordnet waren. Um mögliche andere, von der Gendichte unabhängige Einflüsse auf die radiale Verteilung subchromosomaler Bereiche wie z.B. die Kerngestalt zu identifizieren, wurden die Versuche an drei unterschiedlichen menschlichen Zellarten, Lymphozyten, Fibroblasten und Coloncarcinomzellen der Zellinie SW480, sowohl während der S-Phase als auch nach Verlassen des Zellzyklus in der G0-Phase durchgeführt. Die quantitative Evaluation der Anordnung und der radialen Verteilung der DNA-Segmente in Bezug auf das Chromosomenterritorium bzw. auf den Kern erfolgte an 3D-Rekonstruktionen von lichtoptischen Serienschnitten mittels zweier unabhängiger computergestützter Auswertungsprogramme. Es konnte gezeigt werden, daß in den annähernd runden Lymphozyten radiale Verteilungsunterschiede in Korrelation zur Gendichte gegeben sind: Genarme Bereiche des Chromosoms 12 ordnen sich unabhängig vom Zellzykluszeitpunkt in Bezug auf den geometrischen Mittelpunkt des Interphasekerns peripherer an als genreiche. Dieser Befund stützt die Hypothese, daß genreiche Regionen von Chromosomen eher zum Zellkernmittelpunkt hin präsentiert, genarme dagegen in die Peripherie verlagert werden. In der S-Phase konnte eine ebensolche radiale Verteilung auch in Bezug auf das Chromosomenterritorium gefunden werden. Hier wird die genarme DNA schwerpunktmäßig an den Rand des Territoriums verschoben. Anders verhält es sich bei den adhärent wachsenden, flachen humanen Fibroblasten. Hier konnte kein signifikanter Unterschied in der dreidimensionalen, räumlichen Anordnung genarmer und genreicher DNA-Abschnitte gefunden werden, und zwar weder in Bezug auf den Kern noch auf das Territorium. SW480-Tumorzellen sind rundliche bis ellipsoide Zellen. Ähnlich den Lymphozyten zeigen sie klare radiale Anordnungsunterschiede von Bereichen des Chromosoms 12, sortiert nach der Gendichte. Allerdings sind diese Unterschiede weniger stark ausgeprägt als bei den Lymphozyten. So konnte nur in Bezug auf das Chromosomenterritorium ein signifikanter radialer Verteilungsunterschied gefunden werden. In Bezug auf den Kern sieht man eine deutliche, aber statistisch nicht signifikante Tendenz, genarmes Chromatin in die Peripherie zu verlagern. Insgesamt belegen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, daß das Prinzip der Korrelation von Gendichte und radialer Verteilung grundsätzlich auch für subchromosomale Bereiche gilt. Es läßt sich jedoch feststellen, daß bei der radialen Verteilung von Chromosomenabschnitten weitere, noch nicht bekannte Faktoren eine Rolle spielen und sie nicht ausschließlich durch die Gendichte bestimmt wird.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Literatur aus vielen aktuellen Forschungsarbeiten zur Entwicklung der Oligodendrozyten und der dabei einwirkenden Faktoren während der embryonalen und frühen postnatalen Phase gesammelt und kritisch ausgewertet. Die Neuronen und Gliazellen des ZNS entstehen im sich entwickelnden Neuralrohr aus multi- bzw. pluripotenten neuroepithelialen Stammzellen. Dabei ist die Genese dieser unterschiedlichen Zellarten einer strengen zeitlichen Regulation unterworfen: zunächst bildet sich die Radialglia aus, die als Leitschiene für die Neuronenmigration fungiert. Nachfolgend entwickeln sich Neuronen, Astrozyten und zuletzt die Oligodendrozyten. Die Ursprungsorte dieser myelinbildenden Zellen sind die ventrikulären bzw. subventrikulären Zonen im ventralen Neuroepithel. Die Hochregulation von Sonic hedgehog, einem Signalprotein, welches von der mesodermalen Chorda dorsalis bzw. der Prächordalplatte exprimiert wird, spielt dabei eine entscheidende Rolle. Es bedingt sowohl die dorsoventrale Segmentierung des Neuralrohres als auch die Entstehung der ersten Oligodendrozyten-Precursorzellen in Interaktion mit einer Vielzahl anderer Einflussfaktoren. Von ihren Ursprungsorten aus besiedeln die Zellen die gesamte weiße und, in geringerem Maße, auch die graue Substanz des ZNS. Dabei müssen teilweise beträchtliche Distanzen überwunden werden. Auch hier ist wiederum das ungestörte Zusammenspiel vieler Faktoren, z. B. Moleküle der extrazellulären Matrix, Zelladhäsionsmoleküle und sekretorische Proteine, erforderlich, um eine physiologische Verteilung der Oligodendrozyten-Vorläuferzellen zu gewährleisten. Zeitgleich entwickeln sich die Precursorzellen über eine Reihe von Differenzierungsstadien weiter bis hin zum reifen, myelinproduzierenden Oligodendrozyten. Über den Nachweis stadienspezifischer Markermoleküle lassen sich die verschiedenen Phasen unterscheiden. Die Differenzierungs- und Proliferationsvorgänge unterliegen ebenfalls der Kontrolle vieler Regulationsmechanismen. Untersuchungen aus jüngerer Zeit zeigten u.a. die Fähigkeit von bereits determinierten Oligodendrozyten-Precursorzellen auf, sich unter bestimmten Bedingungen zu Stammzellen zurück zu entwickeln. Außerdem fanden sich in jüngsten Studien Hinweise auf eine wesentlich engere Verflechtung von Gliazellen und Neuronen als bislang angenommen.

Durch den Transfer tumorspezifischer T-Zellen können solide Tumore nicht nur in Tieren, sondern auch im Menschen erfolgreich behandelt werden. Dudley et al. konnten kürzlich nach dem autologen Transfer stimulierter tumorinfiltrierender Lymphozyten (TIL) nach vorheriger non-myeloablativer Konditionierung in zwei von zwölf Patienten mit Melanomen eine Tumorregression erreichen (Dudley et al. 2002). Änliche Erfolge konnten Chang et al. bei der Behandlung von fortgeschrittenen Nierenkarzinomzellen erzielen (Chang et al. 2003). Sie vakzinierten Patienten mit Calmette-Guérin Bacillus versetzten Tumorzellen und ernteten anschließend die T-Zellen aus den angrenzenden Lymphknoten der Vakzinierungsregion. Nach autologem Transfer der vorwiegend CD8+ T-Zellen, welche in vitro mit anti-CD3 stimuliert wurden, sprach die Therapie bei neun von 34 Patienten an. Die Mechanismen der T-zellvermittelten Tumorregression sind aber bis heute noch unklar. Gegenstand dieser Arbeit war es daher Faktoren zu untersuchen, welche eine Rolle bei der Regression von D5-Melanomlungenmetastasen durch den adoptiven Transfer CD4+/CD8+ T-Zellen aus Tumorvakzin drainierenden Lymphknoten (TVDLN) nach Vakzinierung mit D5G6 (einem GM-CSF transduzieren D5-Subklon) spielen. Hierzu wurden D5-Zellen in vitro mit Zytokinen, welche von Effektor T-Zellen (TE) produziert werden, stimuliert. Wir konnten zeigen, dass D5-Tumorzellen die als proapoptotisch geltenden Rezeptoren TNF-R I sowie Fas nach IFN-g-Stimulation exprimieren. Die Inkubation mit den Liganden dieser Rezeptoren TNF-a, LT-a und FasAb bewirkt keine Apoptoseinduktion. Gleichzeitige Inkubation dieser Liganden führt nur zu einer Apoptoserate von 25% in D5. Mögliche Gründe der relativen Apoptoseresistenz von D5 könnten die intrazellulären Apoptoseinhibitionsproteine c-IAP I, c-IAP II und Survivin sein, welche wir in D5 nachweisen konnten. Da nach adoptivem Transfer tumorspezifischer TE Makrophagen die pulmonalen Tumormetastasen infiltrieren, untersuchten wir, ob TE Chemokine exprimieren. Unsere Untersuchungen ergaben, dass TE die Chemokine MIP-1a, MIP-1b und RANTES tumorspezifisch exprimieren. Nach Stimulation von D5-Tumorzellen mit den Zytokinen TNF-a und IFN-g, welche von TE tumorspezifisch exprimiert werden, wird die Chemokin-mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig in D5 exprimiert. Auch die Koinkubation von D5 mit TE induziert die Expression der mRNA von KC, MCP-1, IP-10 und Mig. Deutlich erhöhte KC und MCP-1 Proteinkonzentrationen wurden im Überstand von D5-Tumorzellen mittels ELISA nach TNF-a Stimulation gegenüber unstimulierten und IFN-g stimulierten D5-Zellen festgestellt. Um zu prüfen, ob die von D5 gebildeten Substanzen auch tatsächlich chemotaktisch auf Makrophagen wirken, führten wir einen chemotaktischen Assay durch. Wir konnten zeigen, dass es zu einer signifikanten Steigerung der Anzahl migrierter Makrophagen in Richtung D5- Tumorzellen nach deren Stimulation mit IFN-g und TNF-a kommt. Da wir in TE die Expression von TNF-a-mRNA und die Sekretion von IFN-g tumorspezifisch nachweisen konnten, besteht Grund zur Annahme, dass in vivo TE in der Lage sind Tumorzellen zur Chemokinbildung anzuregen, was zu einer Invasion von Makrophagen in die Tumorregionen führt. Dass Makrophagen möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Tumorregression spielen, deckt sich auch mit der Beobachtung von Feinmesser et. al., welche mit einer peritumorösen Injektion von Multikinen (Zytokin-/Chemokinmischung) Kopf und Halstumore behandelten (Feinmesser et al. 2003). Nach dieser Therapie zeigte sich in den Tumorregionen der erfolgreich behandelten Patienten im Gegensatz zu Non-Respondern eine hohe Anzahl migrierter und aktivierter Makrophagen. Wir fanden mit den Ergebnissen unserer Studie erstmals Hinweise darauf, dass im murinen Melanommodell B16BL6-D5 nicht ausschließlich die direkte T-zellabhängige Zytotoxizität zur Tumorregression führt, sondern dabei weitere Zellarten wie Makrophagen/Monozyten involviert sind, welche mittels tumorspezifischer Chemokine rekrutiert werden. Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zur Erforschung der Mechanismen T-zellvermittelter Tumorregression. Die Kenntnisse dieser Mechanismen haben entscheidende Bedeutung bei der Entwicklung neuer, effektiver Behandlungskonzepte gegen solide Tumore.

In der vorliegenden Arbeit wurden 45 Nebenhoden von klinisch gesunden Katern im Alter zwischen fünf Monaten und zehn Jahren im Hinblick auf Morphologie, Ultrastruktur und Histochemie untersucht. Es wurden zehn verschiedene immunhistologische Reaktionen auf verschiedene Proteine bzw. Hormonrezeptoren durchgeführt. Der Nebenhoden des Katers entspricht in seinem anatomischen Aufbau dem anderer Tierarten. Durch das Auftreten verschiedener Zellarten, unterschiedlicher Epithelhöhe und der Länge des Zellbesatzes sowie Form und Lage des Nukleus kann der Epididymidis des Katers in fünf verschieden Segmente unterteilt werden. Die Ductuli efferentes bilden mit Segment 1 und 2 den Nebenhodenkopf, Segment 3 und 4 entsprechen dem Corpus epididymidis und der Nebenhodenschwanz besteht aus Segment 5. Die Ductuli efferentes besitzen zilienbesetzte und zilienlose Zellen, die in verschiedenen Färbungen und immunhistologischen Reaktionen auch unterscheiden. Das Epithel des Ductus epididymidis des Katers besteht aus Hauptzellen, Basalzellen und Lymphozyten, sowie Apikalzellen in Segment 2 und 5. Neben den genannten Zellarten bzw. ihrer Kerne oder des Zytoplasmas wurden bei den immunhistologischen Reaktionen Spermien, luminale Epithelzellen, Muskulatur, Gefäße und die Basallamina beurteilt. VEGF (“Vascular endothelial growth factor“) ist immunhistochemisch nur schwach nachweisbar, dafür zeigt sich der VEGF-Rezeptor deutlich positiv, vor allem in den Zellkernen der Hauptzellen von Nebenhodenkopf und –schwanz. GHR (“Growth hormone receptor“) reagiert in Kernen der Hauptzellen und Apikalzellen des gesamten Nebenhodens, sowie deren Zytoplasma. Außerdem ist es in den Gefäßen und der Muskulatur nachweisbar. Vimentin kommt im Zytoplasma der Ductuli efferentes sowie in Muskulatur, Interstitium, Gefäßen und Basallamina des Ductus epididymidis vor. Cytokeratin färbt das Zytoplasma der Ductuli efferentes und der Hauptzellen in Segment 1 und 5 an. Laminin kommt vorwiegend in der Muskulatur, den Gefäßen und der Basallamina, in geringer Menge auch im Zytoplasma der Hauptzellen vor. a-SMA (“Smooth muscle actin“) zeigt sich ausschließlich in den glatten Muskelzellen der Ductuli efferentes, des Nebenhodenganges und der Gefäße, ohne regionale Unterschiede. Androgen-Rezeptor ist in den Kernen aller Hauptzellen, vorwiegend aber von Segment 1 bis 4 sowie im Interstitium nachweisbar. Östrogen-Rezeptor a reagiert dagegen nur in den Kerne der Ductuli efferentes und färbt in Segment 4 und 5 den Zellbesatz und die Spermien an. Progesteron-Rezeptor reagiert im gesamten Nebenhodengang positiv im Interstitium, den Gefäßen und den luminalen Spermien. Außerdem färbt es den Zellbesatz von Segment 2 bis 5 an.

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin, die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation, Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion, Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht, dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“) Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3 Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998), ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“- (Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war, dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert, wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten führen.

Zusammenfassung Trotz beträchtlicher Fortschritte in der antibiotischen Behandlung bakterieller Erkrankungen blieb der Krankheitsverlauf und die Sterberate der bakteriellen Meningitis, insbesondere der Pneumokokkenmeningitis, innerhalb der letzten Jahre unverändert. Mit der Erkenntnis, daß das Ausmaß der intrakraniellen Entzündung positiv mit dem Verlauf der Erkrankung korreliert, gewann die Frage nach der Rolle der Leukozyten im Rahmen des Krankheitsgeschehens zunehmend an Bedeutung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, die Bedeutung von Granulozyten, Monozyten und des Zusammenspiels dieser beiden Zellarten im Rahmen der pathophysiologischen Abläufe während der experimentellen Pneumokokkenmeningitis aufzudecken. Insbesondere wurden Veränderungen in den Parametern intrakranieller Druck, Liquorpleozytose und Blut-Hirnschrankenstörung in der Frühphase und im fortgeschrittenen Stadium der Meningitis untersucht. Hierfür kamen zwei Tiermodelle zur Anwendung: 1) Frühphase der Erkrankung: Hierbei wurde narkotisierten Ratten durch intrazisternale Injektion von Hitze-abgetöteten Pneumokokken (HKP) eine Meningitis induziert. Anschließend wurden über einen Zeitraum von sechs Stunden kontinuierlich Blutdruck, intrakranieller Druck und Temperatur überwacht. Eine Stunde vor Versuchsende erhielten die Tiere 1 ml Evans-blau zur Quantifizierung der Blut-Hirnschrankenstörung intravenös injiziert. Nach Ablauf des Beobachtungszeitraums wurden Liquorproben zur Bestimmung der Zellzahl und Evans-blau-Konzentration und Gehirnproben zur histologischen Aufarbeitung gewonnen. 2) Fortgeschrittenes Stadium der Erkrankung (Spätphase): In diesem Modell wurde die Meningitis mittels transkutaner Injektion von Streptococcus pneumoniae Serotyp 3 in die Cisterna magna ausgelöst. 24 Stunden nach Injektion wurden auch bei diesen Tieren die Leukozytenzahl und Evans-blau Konzentration im Liquor bestimmt sowie Gehirnproben zur weiteren Aufarbeitung gewonnen. Um die Beteiligung der Granulozyten an den pathophysiologischen Veränderungen während der Früh- bzw. Spätphase der bakteriellen Meningitis untersuchen zu können, wurden die Versuchstiere mit einem gegen polymorphkernige Leukozyten gerichteten Antikörper (Rabbit Anti-Rat-PMN-Antikörper) vorbehandelt, wodurch eine nahezu vollständige Depletion der Granulozyten erreicht wurde. Um ebenso die durch Monozyten bedingten Auswirkungen während der Frühphase der Pneumokokkenmeningitis feststellen zu können, wurde eine weitere Gruppe mit λ-Carrageenan vorbehandelt, einer Substanz, deren toxische Wirkung auf mononukleäre Zellen bekannt ist. In einer dritten Gruppe schließlich wurden beide Wirkstoffe in Kombination miteinander verabreicht. Für die Frühphase der Pneumokokkenmeningitis ergaben sich folgende Ergebnisse: 1) Die intrazisternale Gabe von Hitze-abgetöteten Pneumokokken führte im Verlauf von sechs Stunden bei den Ratten zu einem Anstieg des intrakraniellen Drucks, der Liquorleukozytenzahl und zur Störung der Blut-Hirnschrankenfunktion. 2) Die Depletion neutrophiler oder monozytärer Zellen bewirkte bei den Versuchstieren eine signifikante Reduktion der Liquorpleozytose und des intrakraniellen Druckanstieges. Gemessen an der Evans-blau-Extravasation wiesen diese Tiere auch eine geringere Funktionsstörung der Blut-Hirnschranke auf. 3) Bei den zweifach-depletierten Tieren waren diese Ergebnisse noch ausgeprägter. Sie zeigten bzgl. des intrakraniellen Druckanstieges, der Liquorpleozytose und Blut-Hirnschrankenfunktion keinen wesentlichen Unterschied zu unbehandelten Kontrolltieren. Für das fortgeschrittene Stadium der Meningitis zeigte sich folgendes: Nach Depletion granulozytärer Zellen ließ sich auch hier eine deutliche Reduktion des intrakraniellen Druckanstieges, der Liquorpleozytose und der Blut-Hirnschrankenstörung erreichen. Allerdings war diese Reduktion weitaus schwächer ausgeprägt als in den vorangegangenen Untersuchungen. Derzeit liegen noch keine Langzeituntersuchungen zur Wirkdauer des gegen polymorphkernige Leukozyten gerichteten Antikörpers vor. Daher ist nur zu vermuten, daß möglicherweise ein zunehmender Wirkverlust des Antikörpers während des Experiments für diese Diskrepanz verantwortlich sein könnte. Unterstützung findet diese Annahme durch den eindeutig höheren prozentualen Anteil neutrophiler Zellen in Differentialblutbildern von Langzeitversuchen verglichen mit denjenigen der Kurzzeitversuche. Da mit Carrageenan vorbehandelte Tiere zum Teil erhebliche Blutdrucksenkungen im Laufe des Experimentes aufwiesen, war es nicht möglich, diese Substanz in den Langzeitversuchen einzusetzen. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, daß Granulozyten, aber auch Monozyten eine essentielle Rolle im Hinblick auf die Ursachen pathophysiologischer Veränderungen während der Früh- und vermutlich auch der späteren Phase der Pneumokokkenmeningitis spielen. Andere Methoden zur Depletion monozytärer Zellen sollten künftig angewendet werden, um die Auswirkungen einer Monozyten-Depletion auf die fortgeschrittene Phase der Pneumokokkenmeningitis genauer untersuchen zu können. Es kommen verschiedene Mechanismen in Betracht, wie Granulozyten und Monozyten zu diesen Veränderungen führen können: 1) Neutrophile sind als Produzenten gewebezerstörender Faktoren bekannt. Ihr Waffenarsenal umfaßt eine Vielzahl toxischer Metabolite, darunter freie Sauerstoffradikale, Stickstoffmonoxid und Enzyme wie Matrix-Metalloproteinasen. In vorangegangenen Studien wurde bereits die Relevanz dieser Mediatoren für die bakterielle Meningitis belegt (z.B. Pfister et al., 1990 a,b; Koedel et al., 1995; Paul et al., 1998). Ohne Mithilfe anderer Mitglieder des Immunsystems sind Neutrophile nicht fähig zwischen fremden und wirtseigenen Antigenen zu unterscheiden; ihre „Waffen“ richten sich in diesem Fall auch gegen den eigenen Wirt. Frühere Studien zeigten, daß im Liquorraum von einem Komplementmangel ausgegangen werden muß und somit hier der zellulären Abwehr die nötige Unterstützung fehlt, um das richtige Ziel der Zerstörung preiszugeben. 2) Monozyten/Makrophagen gelten als Hauptproduzenten von IL-1 und anderen Chemokinen, die als chemotaktisches Signal für Neutrophile dienen. Sie stellen damit unverzichtbare Komplizen und Vorläufer für granulozytäre Zellen dar, da sie wesentlich an deren Immigration in den Subarachnoidalraum beteiligt sind. Ferner könnten mononukleäre Zellen durch ihre Freisetzung von Glutamat direkt an den auftretenden Schäden beteiligt sein.

Vor einigen Jahren wurde in der entzündlichen Haut neben den Langerhans-Zellen die Existenz einer weiteren Art dendritischer Zellen, der sogenannten Inflammatorischen Dendritischen Epidermalen Zellen (IDEC) herausgearbeitet. Über Herkunft, Verwandtschaft zu anderen Zellarten und Funktion der IDEC ist bislang wenig bekannt. Um die Abstammung der IDEC zu erforschen und ihre Rolle in der entzündlichen Haut neben jener der Langerhans-Zellen besser zu verstehen, sollte der Mannoserezeptor auf diesen beiden dendritischen Zellen in der Haut gesucht und die ihnen zur Verfügung stehenden Endozytose-Mechanismen ermittelt werden. In gesonderten Experimenten sollte die Phagozytosefähigkeit der Langerhans-Zellen und der IDEC geprüft werden. Als Kontrollzellen dienten Monozyten und MoDC´s, von welchen bereits Daten bekannt sind. Es wurden APAAP-Färbungen an histologischen Schnitten gesunder und entzündlicher Haut unter Verwendung des spezifischen Antikörpers D547 zur Identifizierung des Mannoserezeptors auf den Langerhans-Zellen und den IDEC vorgenommen. In der durchflußzytometrischen Immunphänotypisierung wurden die jeweiligen Zellen mit dem rezeptorspezifischen Antikörper D547 gefärbt. In durchflußzytometrischen Versuchen wurde die Pinozytose mittels Lucifer Yellow nachgewiesen. Zur Untersuchung der Rezeptor-vermittelten Endozytose wurden die Zellen mit Dextran-FITC inkubiert. Durch Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels Mannan wurde die Rezeptor-vermittelte Endozytose von der Pinozytose abgegrenzt. Die Phagozytose der Zellen wurde unter Verwendung von opsonisierten E.coli untersucht. Durch die immunhistologische Färbung und die Phänotypisierung jeweils mit dem Antikörper D547 konnte gezeigt werden, daß sich der Mannoserezeptor nicht auf den Langerhans-Zellen der normalen und der entzündlichen Haut befindet und nur auf den IDEC nachgewiesen werden kann. Er war in der Phänotypisierung der Monozyten nicht, auf den MoDC´s dagegen deutlich zur Darstellung zu bringen. Die Pinozytose konnte bei allen Zelltypen dargestellt werden. Weiterhin konnte unter Verwendung von Dextran-FITC und Hemmung des Mannoserezeptors durch Mannan gezeigt werden, daß Monozyten keine, MoDC´s dagegen eine deutliche Rezeptorvermittelte Endozytose aufweisen. Langerhans-Zellen besitzen die Fähigkeit zur Rezeptor-vermittelten Endozytose nicht, MoDC´s hingegen nehmen mannosylierte Antigene rezeptorgebunden in sich auf. Die Ergebnisse ergeben mit denjenigen der Phänotypisierung ein Konzept, welches sagt, daß Langerhans-Zellen keinen Mannoserezeptor tragen, IDEC jedoch ebenso wie die MoDC´s den Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche exprimieren und ihn zur Endozytose benutzen. Ferner konnte gezeigt werden, daß Blutmonozyten opsonisierte E.coli phagozytieren. MoDC´s nahmen keine E.coli in sich auf. Ebenso konnte gezeigt werden, daß Langerhans-Zellen aus normaler und entzündlicher Haut keine Phagozytose-Aktivität entfalten. Auch IDEC phagozytierten E.coli nicht. Langerhans-Zellen und IDEC konnten weiter voneinander abgegrenzt werden. Die Expression des Mannoserezeptors auf den IDEC und ihre Präsenz ausschließlich in entzündlichen Hautläsionen läßt vermuten, daß sie den in der Antigenpräsentation äußerst effizienten unreifen dendritischen Zellen zuzuordnen sind und ihnen eine Rolle in der Genese des atopischen Ekzems und in der Abwehr pathogener Organismen von entzündeter Haut zukommt. Die Ähnlichkeit der IDEC mit den MoDC´s nicht nur in der Rezeptor-vermittelten Endozytose legt die Abstammung dieser Zellen von Blutmonozyten und die Verwandtschaft mit MoDC´s und nicht mit den Langerhans-Zellen nahe. Die Expression des Mannoserezeptors und die Phagozytose-Fähigkeit der Zellen erwiesen sich als voneinander unabhängig. Dies erscheint wesentlich, da eine Funktion des Mannoserezeptors bei der Phagozytose bekannt ist.