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In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung unterschiedlicher Strahlendosen auf verschiedene Kultivierungsformen der Bronchialschleimhaut und eine Lungenkarzinomzelllinie untersucht werden. Untersuchungen zur Wirkung ionisierender Strahlen auf normales Bronchialepithel sind eher selten, obwohl die Affektion von tumorfreiem umgebendem Gewebe eine wichtige Rolle bezüglich der Nebenwirkungen einer Radiotherapie spielt. Gerade im palliativen Bereich, in dem die endoluminale Bestrahlung von Bronchus-Stenosen einen wichtigen Faktor für die Verbesserung der Lebensqualität darstellt, ist durch den engen Kontakt der Strahlenquelle zum gesunden Bronchialepithel eine Strahlenauswirkung gegeben. Die bisherige Datenlage legt eine relativ hohe Strahlentoleranz des Bronchialepithels nahe. Ob sich diese Ergebnisse bestätigen lassen, sollte anhand verschiedener Bronchial-Epithel-Kultivierungsformen untersucht werden. Primäres Ziel der Untersuchung war die Frage, ob die Art der Kultivierung einen Einfluss auf die Effektivität ionisierender Strahlen hat und ob Tumorzellen eine andere Reaktion zeigen. Die verwandten Modelle waren: - BEAS-2B Zelllinien - Primärkulturen aus Patientenmaterial - dreidimensionale Organkulturen - EPLC-32M1 Tumorzelllinien Als „handelsübliche“ Bronchialepithel-Zelllinie zur Monolayer-Kultivierung wurden die BEAS-2B-Zellen verwendet, hier handelt es sich um immortalisierte, humane bronchoepitheliale Zelllinie, die mit einem Adenovirus 12-SV40 Virus-Hybrid transfiziert war. Zwar sind viele Eigenschaften der normalen Bronchialschleimhaut in diesem Modell vorhanden, aber auch genetische Abweichungen wie Veränderungen des Chromosomensatzes sind beschrieben. Mit zunehmender Passagezahl können die Zellen auch eine kanzerogene Wirkung zeigen. Zum direkten Vergleich wurden Primärkulturen aus Patientenmaterial gewonnen, welche als Monolayer kultiviert wurden. Problematisch war hier die schwierige Kultivierbarkeit. Die dreidimensionalen Organkulturen stellen vom Aufbau her eine in vivo-nahe Kulturform dar. Zentrum der Organkultur ist ein bindegewebiger Kern, welcher von einem respiratorischen Epithel umgeben ist. Morphologisch ist das kultivierte Epithel nicht von dem in vivo zu unterscheiden. Als Tumormodell wurde eine EPLC-32M1 Zelllinie verwandt, die wie die BEAS-2B Linie und die Primärkulturen als Monolayer wachsen. Hier handelt es sich um eine squamöse Karzinom Zelllinie, deren Ursprungsgewebe ein Plattenepithelkarzinom der Lunge war. Die Ähnlichkeit zum Primärtumor ist nur noch gering ausgeprägt. Bekannterweise gehört das Plattenepithelkarzinom der Lunge zu den nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen, welche im Vergleich zu Kleinzellern nur eine geringe Strahlensensitivität aufweisen. Als Parameter für die Zellschädigung wurde die Lactatdehydrogenase verwandt, ein zytoplasmatisches Enzym, welches bei Zellmembranläsionen freigesetzt wird. Mit der LDH steht ein klinisch häufig eingesetzter, etablierter Parameter zu Detektion von Zellschäden zur Verfügung. Hier konnte eine Bestimmung im Kulturmedium erfolgen, wodurch Verlaufsbeobachtungen ohne Beeinflussung der Kulturen möglich waren. Ferner wurde die Zellzahlen nach Bestrahlung ermittelt, um eine Aussage über das Zellüberleben machen zu können. Zusammenfassung der Ergebnisse: - Die Organkulturen und Primärkulturen zeigten nach einer Latenz von 48 Stunden nach der Bestrahlung eine gesteigerte LDH-Aktivität, die hier gleichzeitig ihr Maximum erreichte. - Bei der BEAS-2B Linie kam es innerhalb der ersten 24 Stunden zu einem deutlichen LDH-Anstieg. - Tumorzellen zeigten ein gänzlich anderes Verlaufsmuster bezüglich der LDH. Hier kam es nach 3 Tagen zu einem kontinuierlichen Anstieg. - Die Zellzahlen im Organkulturmodell wiesen 4 Tage nach Bestrahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen auf. - Bei den Primärkulturen und den BEAS-2B Zellen fand sich in den bestrahlten Gruppen eine signifikant, nicht dosisabhängig erniedrigte Zellzahl. - Im Tumorzell-Modell war dosisabhängig eine Zellzahlminderung in den bestrahlten Gruppen zu beobachten. Schlussfolgerungen: Sowohl vom LDH-Verhalten, als auch von den Ergebnissen der Zellzahlbestimmung zeigten sich die dreidimensionalen Organkulturen wenig anfällig für die Wirkung ionisierender Strahlen. Nachdem dieses Modell die in vivo-Situation gut wiederspiegelt, unterstützen die Ergebnisse die Daten, welche eine hohe Strahlentoleranz von Bronchialepithel nahe legen. Von den übrigen Kultivierungsformen scheinen die aus Patientenmaterial gewonnenen Primärkulturen die höchste Strahlenresistenz aufzuweisen, wahrscheinlich sind hierfür Zelleigenschaften verantwortlich, die in den gentechnisch veränderten Zelllinien nicht mehr in der Art und Weise ausgeprägt sind wie in vivo. So nehmen viele intrazelluläre Faktoren wie Zytokine, Wachstumsfaktoren, Proteinkinasen oder auch Onkogene Einfluss auf die Strahlensensibilität einer Zelle. Entscheidend scheint besonders der p53- Status zu sein. Am strahlensensitivsten zeigten sich die BEAS-2B und die EPLC-32M1 Linien. Das hängt womöglich mit der Veränderung des genetischen Materials durch die Immortalisationsprozesse und die im Vergleich höhere Proliferationsrate zusammen. Möglich ist auch eine erhöhte Strahlensensibilität aufgrund des im Vergleich zu den Organkulturen schwächer ausgeprägten Zell-Zell-Kontaktes, der fehlenden dreidimensionalen Struktur und dem geringeren Anteil differenzierter Zellen. Nicht außer Acht lassen darf man individuelle Einflüsse, welche womöglich in den von Patientenmaterial stammenden Kulturen eine Rolle spielen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass der dreidimensionale Aufbau und die hierarchische Struktur des Bronchialepithels maßgeblich die Strahlensensibilität beeinflussen. Monolayer sind zur Untersuchung von Strahlenfolgen in vivo nur sehr bedingt geeignet. Ausblick auf zukünftige Fragestellungen: Nachdem in der vorliegenden Arbeit nur eine Tumorzelllinie untersucht wurde, wäre es von Interesse, die Auswirkung ionisierender Strahlung auf verschiedene Lungenkarzinom- Zelllinien zu vergleichen, welche in vivo deutliche Unterschiede in der Strahlenempfindlichkeit aufweisen. Anbieten würde sich hier der Vergleich mit strahlensensiblen kleinzelligen Bronchialkarzinom. Möglicherweise kann auch hier eine dreidimensionale Kultivierung von Tumorzellen aus Patientenmaterial etabliert werden, um einen größeren Zell-Zell-Kontakt im Tumor-Modell zu ermöglichen. Auch wäre hier durch die fehlenden gentechnischen Veränderungen eine bessere Vergleichbarkeit mit der in vivo- Situation möglich. Auch die Untersuchung von Ko-Kulturen aus normaler Bronchialschleimhaut und verschiedenen Bronchialkarzinomzelllinien bietet die Möglichkeit, Auswirkungen von Interaktionen zwischen Normalgewebe und Tumorgewebe nach Einwirkung ionisierender Strahlen näher zu eruieren. Dieses Modell käme der Situation beim Patienten am nächsten. Interessant wäre in diesen Modellen auch die Überprüfung weiterer Zelltod-Parameter. So könnten hier verschiedene Apoptosemarker wie zum Beispiel die Nukleosomen im Überstand verschiedener Ko-Kulturmodelle bestimmt werden, um eine bessere Aussage über das Ausmaß der Zellschädigung zu erhalten. Im Kontext mit der Untersuchung von Nukleosomen scheint auch die Bestimmung von Calcium eine sinnvolle Ergänzung darzustellen. Hier bieten sich verschiedene Möglichkeiten an, das Verhalten von Zellkulturen nach Bestrahlung, gerade hinsichtlich einer möglichen Resistenzbildung zu untersuchen.

Hintergrund und Fragestellung Eines der schwerwiegenden Probleme der interventionellen Kardiologie stellte bislang die koronare Restenose im Stent dar. Erst durch die Einführung eines Rapamycin- freisetzenden-Stents konnte die Restenoserate erheblich gesenkt werden. Trotz dieses therapeutischen Erfolges sind die transkriptionellen pathophysiologischen Mechanismen der Neointimahyperplasie, die zu über 90% für den Lumenverlust nach koronarer Stentimplantation verantwortlich ist, sowie deren Beeinflussung durch Rapamycin nur teilweise verstanden. Methodik Die vorliegende Arbeit untersuchte deshalb in einem humanen Organkulturmodell auf genregulatorischer Ebene die molekularen Mechanismen, die der Neointimaformation im Menschen zu Grunde liegen, sowie die Beeinflussung dieser Mechanismen durch eine Behandlung mit Rapamycin. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass (1) die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit maximalen Veränderungen 21 Tage nach Ballondilatation; (2) die inflammatorische Komponente zu den frühen Zeitpunkten eine wichtigere Rolle spielt während Proliferation und Apoptose die späteren Veränderungen in der Genexpression dominieren; (3) die Ballonangioplastie ein Genexpressionsprofil induziert, welches die Rekrutierung und Aktivierung sowohl inflammatorischer als auch hämatopoetischer Vorläuferzellen erleichtert; (4) Rapamycin die Induktion eines solchen pro-adhäsiven, proinflammatorischen Genexpressionsmusters als auch die Induktion von HPC-stimulierenden Genen verhindert. Diskussion Eine zeitlich gestaffelte Genexpressionsanalyse menschlicher Arterien nach Ballonangioplastie ist bisher nicht veröffentlicht worden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit einer maximalen Alteration nach 21 Tagen und nur wenigen ausschließlich nach 56 Tagen regulierten Genen. Somit lässt sich schlussfolgern, dass eine spätere Restenose die Folge einer frühen, gestörten Wundheilung ist. Diese Auffassung wird durch die beeindruckende Verminderung der In-Stent-Restenose durch Rapamycin-freisetzende Stents unterstützt, da diese Stents etwa 80% der totalen Medikamentendosis innerhalb der ersten 30 Tage freisetzen. Während die Proliferation bekanntermassen eine wichtige Rolle für die Neointimaformation spielt, wurde die Bedeutung inflammatorischer Prozesse, welche zur Rekrutierung von Leukozyten und hämatopoetischen Vorläuferzellen führen, erst später vermehrt beschrieben. Die koordinierte Induktion eines in dieser Arbeit nachgewiesenen proinflammatorischen Genexpressionsmusters stellt eine beeindruckende Rationale für eine umfangreiche Rekrutierung von Leukozyten nach Ballondilatation dar. Zytokine wie IL-8, EMAP-II, NAP-2 oder GCP-2 waren nach Angioplastie vermehrt exprimiert und verstärken die Migration von Granulozyten. Die mechanisch induzierte Aktivierung dieses Genexpressionsmusters begünstigt somit die Leukozytenrekrutierung und dadurch auch die Restenose, da die Dichte inflammatorischer Zellen in der Neointima mit dem Ausmass der Restenose korreliert. Als weiterer Mechanismus der Neointimaformation wurde kürzlich die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen im Tiermodell nachgewiesen. Es war jedoch bisher nicht bekannt, ob sich diese Beobachtungen auf den Menschen übertragen lassen. Im Organkulturmodell zeigte sich nach Angioplastie die vermehrte Expression von einigen mit hämatopoetischen Vorläuferzellen assoziierten Genen. Dies weist daraufhin, dass diese Mechanismen auch im Menschen eine Rolle spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des Makrolidantibiotikums Rapamycin auf die transkriptionellen Mechanismen nach Ballonangioplastie untersucht. Zunächst spiegelten sich die bekannten antiproliferativen Effekte von Rapamycin in einer deutlich verminderten Expression von wachstumsassoziierten Genen wie verschiedenen Transkriptionsfaktoren und Kinasen wie JAK1 oder AKT1 wieder. Darüberhinaus führte die Rapamycinbehandlung zu einer koordinierten Hemmung der CXC Chemokine 6-8 (GCP-2, β- Thromboglobulin, IL-8) und von EMAP-II, welche alle eine wichtige Rolle in der Adhäsion, der Migration und der Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten spielen. Folglich könnte eine durch Rapamycin veminderte Rekrutierung und Aktivierung dieser Zellen ein wesentlicher Mechanismus in der Reduktion der Neointimaformation sein. Zusätzlich unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass Rapamycin auch direkte Effekte auf hämatopoetische Vorläuferzellen hat. Im Organkulturmodell führte eine Rapamycinbehandlung zur veminderten Expression verschiedener Gene wie des Oncostatin M Rezeptors beta und JAK1, welche das Wachstum immaturer, noch differenzierender Zellen in der Gefässwand fördern. Es lässt sich zusammenfassen, dass Rapamycin neben seiner anti-proliferativen Wirkung nach Ballonangioplastie tiefgreifende hemmende Effekte auf das pro-inflammatorische Genexpressionsmuster und auf Promotoren hämatopoetischer Vorläuferzellen verübt. Somit zeigt diese Arbeit erstmals eine Rationale auf, wie Rapamycin auch im Menschen die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen in die Gefässwand verhindern könnte. Dies vermag möglicherweise seine hohe Effektivität in der Reduzierung der Restenose erklären.

Widerstandsarterien spielen eine wichtige Rolle bei der Durchblutungsregulation. Bisher konnte der wichtigste endotheliale Dilatator in diesen Gefäßen, EDHF, nicht eindeutig identifiziert werden, da pharmakologische Inhibitoren unspezifische Nebenwirkungen aufwiesen. Die spezifische Inhibition von Enzymen mittels Antisensetechnik konnte in intakten Arterien nicht durchgeführt werden, da diese nur über einen kurzen Zeitraum funktionell intakt erhalten werden konnten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Organkulturmodell entwickelt, in dem erstmalig die endothelabhängigen EDHF- und NO-vermittelten Dilatationen über 48 h vollständig erhalten werden konnten. Zusätzlich entwickelten die kultivierten Arterien einen mit dem frisch isolierter Arterien vergleichbaren Spontantonus und zeigten eine myogene Reaktion, die sich in Kinetik und Ausmaß der Kontraktion nicht von den Kontrollarterien unterschied. Ebenso kontrahierten die chronisch perfundierten Arterien auf Stimulation mit Noradrenalin und dilatierten nach Applikation des NO-Donors SNP in vergleichbarem Ausmaß wie frisch isolierte Arterien. Um zu untersuchen, ob möglicherweise eine CytochromP450-Epoxygenase in der Signalkaskade des EDHF eine Rolle spielt, wurde zunächst die Expression von CYP2C8 in Widerstandsarterien mittels rtPCR und in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Da mit dem Organkulturmodell die Arterien funktionell vollständig intakt gehalten werden konnten, wurde die Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden, die gegen CYP2C8 gerichtet waren, untersucht. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die FITC-markierten Oligonucleotide sich nur in der Intima befanden und die Transfektion des Endothels eine hohe Effizienz aufwies. Die Transfektion hatte keinen Effekt auf die NA-induzierte Kontraktion, auf die durch NS1619 (KCa-Kanalöffner)- oder die SNP- vermittelte Relaxation, was zeigt, dass die Funktion des glatten Muskels durch die Transfektion unbeeinträchtigt blieb. Die EDHF-vermittelten Dilatationen wurden durch die Transfektion mit den Antisense-Oligonucleotiden um 76% und die korrespondierenden Calciumabfälle um 58 % reduziert, während die Kontrolltransfektionen mit Scrambled- oder Senseoligonucleotiden keinen Einfluss auf die EDHF-mediierten Dilatationen hatten. Die endothelialen Calciumanstiege nach Stimulation mit ACh blieben in den Antisense-transfizierten Arterien unverändert. Das bedeutet, dass die Signaltransduktion der ACh-Rezeptoren durch die Transfektion funktionell nicht beeinträchtigt wurde. Auf diese Weise konnte mit einem spezifischen Inhibitor gezeigt werden, dass CYP2C8 eine EDHF-Synthase ist oder dessen Metabolit einen permissiven Faktor für einen anderen EDHF darstellt und ein elementarer Bestandteil der EDHF-Signalkaskade ist. Zusätzlich wurden mit diesem Organkulturmodell die Auswirkungen des kardiovaskulären Risikofaktors Hochdruck durch isolierte Erhöhung des transmuralen Drucks auf 120 und 160 mmHg (SMA120 bzw. SMA160) während einer Kulturperiode (48 h) untersucht. In den funktionellen Testungen zeigten sich nach 48 h geringere Außendurchmesserwerte in SMA120 und SMA160 im Sinne eines Remodelings. Der erhöhte Perfusionsdruck führte darüber hinaus zu einer Verstärkung der Noradrenalin-vermittelten Kontraktion. Dies ist jedoch nicht durch eine Erhöhung der Calciumsensitivität der Myofilamente zu erklären, da diese im Vergleich zur Kontrolle unverändert war, sondern durch eine Verstärkung der NA-induzierten Calciumanstiege. Neben den Veränderungen in der glatten Muskulatur zeigte sich insbesondere auch eine Beeinträchtigung der Endothel-vermittelten Relaxationen. Die NO-mediierte Dilatation wurde durch die chronische Perfusion bei 120 mmHg um 38% reduziert und bei SMA160 vollständig aufgehoben. Ebenso wurde die EDHF-vermittelte Relaxation bei SMA120 um 20 % und bei SMA160 um 47% verringert und der korrespondierende Calciumabfall um 41 % reduziert. Diese Reduktion der endothelialen Dilatationen wurde nicht durch eine Erhöhung der Elastance der Arterienwand hervorgerufen, da die dosisabhängige SNP-mediierte Relaxation unbeeinträchtigt war. Zusätzlich scheint eine strukturelle Schädigung des Endothels durch den erhöhten Druck unwahrscheinlich, da mittels Rasterelektronenmikroskopie keine Schäden an der Intima dargestellt werden konnten. Die Expression des ACh-Rezeptors scheint auch nicht in dem Maße verringert zu sein, dass sich daraus die verringerten NO- und EDHF-mediierten Relaxationen erklären ließen, da der endotheliale Calciumanstieg in SMA120 im Vergleich zu SMA45 unverändert war. Daher wird die Beeinträchtigung durch den erhöhten Druck in einem nachgeschalteten Signaltransduktionsweg vermutet. Erhöhter transmuraler Druck hat in diesem Modell innerhalb von 2 Tagen schon zu einer erheblichen Beeinträchtigung der endothelialen Funktionen und zu einer verstärkten Reaktivität des glatten Muskels in Widerstandsarterien geführt. Zwar ist eine Erhöhung des transmuralen Drucks für 48 h nicht mit einem jahrelang bestehenden Hypertonus vergleichbar, jedoch könnte man die so erhobenen Befunde als Hinweis werten, dass eine frühzeitige konsequente antihypertensive Therapie sinnvoll ist, um die druckinduzierte Verstärkung der glattmuskulären Reaktivität und die Einschränkung der Endothelfunktion zu verringern und eine daraus resultierende weitere Erhöhung des Blutdruckes zu verhindern.