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Apoptose glatter Gefäßmuskelzellen spielt eine wichtige Rolle sowohl im Rahmen der Pathogenese der Atherosklerose als auch der Restenose nach Ballonangioplastie. Zu Beginn der Arbeit war bekannt, dass glatte Gefäßmuskelzellen in Abhängigkeit von der Zelldichte auf bestimmte Substanzen wie z.B. PDTC oder Lovastatin mit Apoptose reagieren. Bei hoher Zelldichte konnte keine Apoptose induziert werden. Ziel der Arbeit war es, die apoptoseinduzierenden Substanzen PDTC und Lovastatin zu charakterisieren und verantwortliche Mechanismen der Apoptoseprotektion zu identifizieren. Dazu wurden glatte Gefäßmusklezellen in hoher Dichte kultiviert und konditioniertes Medium gewonnen. Dieses konditionierte Medium induzierte Proliferation in glatten Gefäßmuskelzellen und vermittelte einen Schutz vor Apoptose. Durch Immunpräzipitation und Western Blot konnte eindeutig gezeigt werden, dass die verminderte Apoptoseempfindlichkeit glatter Gefäßmuskelzellen in hoher Dichte durch eine autokrine Produktion von FGF-2 vermittlelt wird.

Langzeitverlaufuntersuchung des Sirolimus-Stent über 6 Monate mit angiographischen und sonographischen Methoden

Hintergrund und Fragestellung Eines der schwerwiegenden Probleme der interventionellen Kardiologie stellte bislang die koronare Restenose im Stent dar. Erst durch die Einführung eines Rapamycin- freisetzenden-Stents konnte die Restenoserate erheblich gesenkt werden. Trotz dieses therapeutischen Erfolges sind die transkriptionellen pathophysiologischen Mechanismen der Neointimahyperplasie, die zu über 90% für den Lumenverlust nach koronarer Stentimplantation verantwortlich ist, sowie deren Beeinflussung durch Rapamycin nur teilweise verstanden. Methodik Die vorliegende Arbeit untersuchte deshalb in einem humanen Organkulturmodell auf genregulatorischer Ebene die molekularen Mechanismen, die der Neointimaformation im Menschen zu Grunde liegen, sowie die Beeinflussung dieser Mechanismen durch eine Behandlung mit Rapamycin. Ergebnisse Es konnte gezeigt werden, dass (1) die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit maximalen Veränderungen 21 Tage nach Ballondilatation; (2) die inflammatorische Komponente zu den frühen Zeitpunkten eine wichtigere Rolle spielt während Proliferation und Apoptose die späteren Veränderungen in der Genexpression dominieren; (3) die Ballonangioplastie ein Genexpressionsprofil induziert, welches die Rekrutierung und Aktivierung sowohl inflammatorischer als auch hämatopoetischer Vorläuferzellen erleichtert; (4) Rapamycin die Induktion eines solchen pro-adhäsiven, proinflammatorischen Genexpressionsmusters als auch die Induktion von HPC-stimulierenden Genen verhindert. Diskussion Eine zeitlich gestaffelte Genexpressionsanalyse menschlicher Arterien nach Ballonangioplastie ist bisher nicht veröffentlicht worden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass die Veränderungen in der Genexpression einem zeitlichen Muster folgen mit einer maximalen Alteration nach 21 Tagen und nur wenigen ausschließlich nach 56 Tagen regulierten Genen. Somit lässt sich schlussfolgern, dass eine spätere Restenose die Folge einer frühen, gestörten Wundheilung ist. Diese Auffassung wird durch die beeindruckende Verminderung der In-Stent-Restenose durch Rapamycin-freisetzende Stents unterstützt, da diese Stents etwa 80% der totalen Medikamentendosis innerhalb der ersten 30 Tage freisetzen. Während die Proliferation bekanntermassen eine wichtige Rolle für die Neointimaformation spielt, wurde die Bedeutung inflammatorischer Prozesse, welche zur Rekrutierung von Leukozyten und hämatopoetischen Vorläuferzellen führen, erst später vermehrt beschrieben. Die koordinierte Induktion eines in dieser Arbeit nachgewiesenen proinflammatorischen Genexpressionsmusters stellt eine beeindruckende Rationale für eine umfangreiche Rekrutierung von Leukozyten nach Ballondilatation dar. Zytokine wie IL-8, EMAP-II, NAP-2 oder GCP-2 waren nach Angioplastie vermehrt exprimiert und verstärken die Migration von Granulozyten. Die mechanisch induzierte Aktivierung dieses Genexpressionsmusters begünstigt somit die Leukozytenrekrutierung und dadurch auch die Restenose, da die Dichte inflammatorischer Zellen in der Neointima mit dem Ausmass der Restenose korreliert. Als weiterer Mechanismus der Neointimaformation wurde kürzlich die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen im Tiermodell nachgewiesen. Es war jedoch bisher nicht bekannt, ob sich diese Beobachtungen auf den Menschen übertragen lassen. Im Organkulturmodell zeigte sich nach Angioplastie die vermehrte Expression von einigen mit hämatopoetischen Vorläuferzellen assoziierten Genen. Dies weist daraufhin, dass diese Mechanismen auch im Menschen eine Rolle spielen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des Makrolidantibiotikums Rapamycin auf die transkriptionellen Mechanismen nach Ballonangioplastie untersucht. Zunächst spiegelten sich die bekannten antiproliferativen Effekte von Rapamycin in einer deutlich verminderten Expression von wachstumsassoziierten Genen wie verschiedenen Transkriptionsfaktoren und Kinasen wie JAK1 oder AKT1 wieder. Darüberhinaus führte die Rapamycinbehandlung zu einer koordinierten Hemmung der CXC Chemokine 6-8 (GCP-2, β- Thromboglobulin, IL-8) und von EMAP-II, welche alle eine wichtige Rolle in der Adhäsion, der Migration und der Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten spielen. Folglich könnte eine durch Rapamycin veminderte Rekrutierung und Aktivierung dieser Zellen ein wesentlicher Mechanismus in der Reduktion der Neointimaformation sein. Zusätzlich unterstützt diese Arbeit die Hypothese, dass Rapamycin auch direkte Effekte auf hämatopoetische Vorläuferzellen hat. Im Organkulturmodell führte eine Rapamycinbehandlung zur veminderten Expression verschiedener Gene wie des Oncostatin M Rezeptors beta und JAK1, welche das Wachstum immaturer, noch differenzierender Zellen in der Gefässwand fördern. Es lässt sich zusammenfassen, dass Rapamycin neben seiner anti-proliferativen Wirkung nach Ballonangioplastie tiefgreifende hemmende Effekte auf das pro-inflammatorische Genexpressionsmuster und auf Promotoren hämatopoetischer Vorläuferzellen verübt. Somit zeigt diese Arbeit erstmals eine Rationale auf, wie Rapamycin auch im Menschen die Rekrutierung hämatopoetischer Vorläuferzellen in die Gefässwand verhindern könnte. Dies vermag möglicherweise seine hohe Effektivität in der Reduzierung der Restenose erklären.

Perkutane Interventionsverfahren stellen ein etabliertes und wichtiges Behandlungskonzept der Arteriosklerose dar. Ihr Ergebnis wird getrübt durch hohe Restenoseraten nach z.B. Ballon-Angioplastie. Wesentlich für die Ausbildung und den Grad einer postinterventionellen Restenose ist die Reendothelialisierung der zerstörten Intima, weshalb es von besonderem Interesse ist, intrazelluläre Signalübertragungswege, welche nach Zerstörung eines Endothelzellmonolayers in den überlebenden Zellen ablaufen, zu untersuchen, um potentielle Angriffspunkte z.B. für eine pharmakologische Modulation der Endothelzellantwort nach Angioplastie zu finden. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Signalübertragungswege an einem Modell zur Verletzung vaskulärer Endothelzellmonolayer in vitro untersucht. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf Untersuchung des an der Regulation der Zellproliferation beteiligten Transkriptionsfaktors und Proto-Oncogens AP-1 bzw. dessen mRNA-Vorstufe c-fos. An humanen vaskulären Endothelzellen (HUVEC) wurde in Zellkultur mittels Northern-Blot Analysen und Electrophoretic mobility shift assays untersucht, ob c-fos und AP-1 nach Endothelzellverletzung exprimiert bzw. aktiviert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Endothelzellverletzung im vorliegenden Modell eine starke Expression von c-fos sowie die Aktivierung des korrespondierenden Transkriptionsfaktors AP-1 bewirkt. Diese Aktivierung wird gesteuert durch einen Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration sowie unter Beteiligung negativ regulierender G-Protein, der Proteinkinase C sowie von Protein-Tyrosinkinasen. Keine Beteiligung konnte nachgewiesen werden für MAPKinasen, Proteinkinase A sowie die CamKinasen. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern in Zusammenschau mit publizierten Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen wichtige Erkenntnisse für eine weiterführende Untersuchung der Signalübertragungswege in huamnen Endothelzellen nach z.B. perkutaner Angioplastie und führen in Zukunft zu neuen Ansatzpunkten für die Pharmakotherapie vaskulärer Läsionen, z.b. durch drug-eluting Stents.

Die Patienten wurden nach Koronarintervention mit Stentimplantation über einen Zeitraum von 5 Jahren (1995-2000) analysiert. Die häufigste Indikation für die Stentimplantation bei der in-Stent Restenose war ein "ungenügende Primärergebnis". Die Nachangiographierate von 74% liegt im Bereich von klinischen Studien. Hierbei fand sich eine Häufigkeit einer ersten in-Stent Restenose von 30,7%, der zweiten in-Stent Restenose von 50% und der dritten in-Stent Restenose von 52,2%. Für ein konservatives Vorgehen entschied man sich bei 25,6% der Patienten mit ersten in-Stent Restenose, 41,7% der zweiten in-Stent Restenose und 42,8% der dritten in-Stent Restenose. Eine koronare Bypassoperation wurde in 5,6% der Patienten mit erster in-Stent Restenose, 13,8% der Patienten mit zweiter in-Stent Restenose und 14,3% der Patienten mit dritter in-Stent Restenose durchgeführt. Bei Mehrgefäßerkrankung nimmt die in-Stent Restenosehäufigkeit zu.

Sowohl für die Inhibierung der Apoptose zur Plaquestabilisierung, wie auch für eine selektive Induktion von Apoptose in Zellen der Neointima zur Restenose-prävention ist ein besseres Verständnis der Apoptoseregulation in glatten Gefäßmuskelzellen erforderlich. In dieser Arbeit wurden glatte Gefäßmuskelzellen aus Media und Neointima der Ratte im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit auf Statinbehandlung untersucht. Diese Zellen repräsentieren ein gut charakterisiertes und breit verwendetes Modell. Die Ergebnisse basieren auf Versuchen mit Zellkulturen und können als Grundlage für Versuche mit menschlichen Zellen und/oder weitere Tierexperimente betrachtet werden. Man kann Folgendes zusammenfassen: A). Statine induzieren in vitro Apoptose sowohl in Media als auch in Neointima glatter Gefäßmuskelzellen. Diesen Effekt beobachtet man nur bei den lipophilen Statinen Lovastatin, Simvastatin und Fluvastatin. Das hydrophile Pravastatin zeigt keinen Effekt. Die Apoptoseinduktion in glatten Gefäßmuskelzellen aus der Media war gering bei serumfreien Bedingungen. B). Die Neointima Zellen sind im Vergleich zu den Media Zellen sowohl bei serumhaltigen, als auch unter serumfreien Bedingungen deutlich empfindlicher auf Apoptoseinduktion durch Statine. C). Eine mögliche Erklärung für die beobachteten Unterschiede könnte in der niedrigeren Expression des antiapoptotischen Proteins cIAP-1 in Neointima Zellen liegen. Dank der Ergebnisse dieser Versuche könnten neue effektive Strategien zur Prävention der Restenose nach Ballonangioplastie entwickelt werden, z.B. durch die lokale Anwendung lipophiler Statine mittels entsprechender Stentbeschich-tung.

Im Klinikum Heilbronn wurden von Ende 1994 bis Anfang 2000 bei 167 Patienten, 207 Stenosen interventionell angegangen und einer Rot-ablation mit anschließender PTCA zugeführt. Für eine Subgruppe von 62 Patienten wurden zusätzlich umfangreiche anamnestische Daten erhoben. Nach mehreren Monaten erfolgte eine angiographische Nachkontrolle bei 134 Patienten (83,8%) mit 164 Stenosen (82,0%), wobei der Kontrollabstand 3,8 * 0,7 Monate betrug. Keiner der Patienten verstarb in diesem Zeitraum oder musste sich einer Bypass-Operation unterziehen Die angiographische Primärerfolgsquote betrug 93,2%. Durch die Rotablation und die anschließenden PTCA kam es in 16,9% zu angiographischen Ereignissen (Dissekate, Vasospasmen, Gefäßverschlüsse). Wegen technischer Komplikationen konnte der Primäreingriff bei sieben Stenosen nicht erfolgreich durchgeführt werden (3,4%). In 6,6% der Fälle kam es zu klinischen Komplikationen (Myokardinfarkte, Bypass-Operationen, Perikardergüsse, Tod). Bei 70 der nachangiographierten Patienten (52,2%) kam es zu einer Restenose. Für die Intervention mit dem Rotablator lässt sich aus unseren und den Ergebnissen anderer Studien ableiten, dass sich komplexe Stenosen für die Behandlung nicht unbedingt als erfolgsmindernd erweisen, wie dies für die PTCA gilt. Es gibt Hinweise, dass sich durch die Auswahl eines unterdimensionierten Bohrkopfes und eine kurze Passagedauer mit dem Rotablator das Risiko von Komplikationen vermindern lässt. Durch dieses Vorgehen findet eine langsame Verringerung der Stenose statt, wodurch ein gleichmäßiger Partikelabstrom gewährleistet ist. So lassen sich sowohl Mikrokavitationen als auch übermäßiger Partikelabrieb, die beide als mögliche Ursachen distaler Embolisationen dis-kutiert werden, reduzieren. Ideal scheint ein Bohrkopf-Gefäßquotient von 0,7-0,8 zu sein. Zusätzlich beeinflusst eine vorhergehende Rotabla-tion die Ergebnisse der nachfolgenden PTCA im Sinn einer „faciliated angioplasty“ möglicherweise positiv. In unserem Kollektiv fällt die im Vergleich zu anderen Studien mit nur sechs Myokardinfarkten sehr niedrige Rate an ischämischen Komplikationen auf (3,6%). Als Grund dafür könnte die konsequente Anwendung der im vorigen Abschnitt beschriebenen Verfahren sein. Außerdem haben die gute Hydratation mit der Verbesserung der Rheologie und das auch intraoperativ fortgeführte strenge spasmolytische Regime sicher eine wichtige Rolle gespielt. Hinsichtlich der Restenosierung konnte der Rotablator die Erwartungen nicht erfüllen. Die Rate der erneuten Stenosierungen entspricht der der PTCA oder ist in manchen Studien sogar noch höher. Der in der Litera-tur beschriebene Zusammenhang zwischen initialem Lumengewinn/ Gefäßdurchmesser und einem guten Langzeitergebnis scheint auch für unser Kollektiv zuzutreffen, denn bei der Gruppe der Restenosierungen war der initiale Lumengewinn signifikant niedriger, als bei der Gruppe mit guten Langzeitergebnissen. So wurde bei den späteren Restenosen lediglich eine Reduktion auf 36% erzielt, während bei der Gruppe der Langzeiterfolge nur eine 30% Reststenosierung zurückblieb (p