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Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Das Cad-System von Escherichia coli gehört zu den pH-induzierbaren Aminosäure-Decarboxylase- Systemen. Der Aktivator des Cad-Systems ist der membrangebundene Transkriptionsregulator CadC. CadC ist gleichzeitig Sensor für die Umweltreize pH und Lysin, und Effektorprotein, das die Expression des cadBA-Operons induziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden der molekulare Mechanismus der transkriptionellen Aktivierung des cadBA-Operons durch CadC und verschiedene Modelle für die Aktivierung eines membranintegrierten Transkriptionsaktivators untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Footprint-Analysen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons die zwei CadC-Bindestellen Cad1 (erstreckt sich von bp -150 bis -112, relativ zum Transkriptionsstart des cadBA-Operons) und Cad2 (bp -89 bis -59) identifiziert werden. DNA-Bindeexperimente in vitro zeigten, dass CadC mit einer höheren Affinität an Cad1 als an Cad2 bindet. Die Affinität von CadC zu Cad1 und Cad2 wurde durch unterschiedliche pH-Werte oder durch Lysin und Cadaverin nicht signifikant beeinflusst. Die Analyse der Bindestellen Cad1 und Cad2 in vivo ergab, dass das Vorhandensein beider Bindestellen für die Induktion der cadBA-Expression durch Lysin und einen niedrigen externen pH-Wert essentiell ist. Desweiteren wurde die Repression des cadBA-Operons unter nicht-induzierenden Bedingungen durch den globalen Repressor H-NS untersucht. Deletionsanalysen der regulatorischen Region des cadBA-Operons indizierten zwei H-NS-Bindestellen stromaufwärts der CadC-Bindestellen. Rechner-gestützte Sequenzanalysen legten die Existenz von zwei weiteren H-NS-Bindestellen nahe, die mit den CadC-Bindestellen und der -35/-10-Region von PCad überlappen. In hns- Deletionsstämmen war die cadBA-Expression sowohl unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen signifikant erhöht. Für die Aktivierung des cadBA-Operons war CadC essentiell. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum Oligomerisationszustand von CadC indizierten, dass CadC Tetramere ausbildet. Die periplasmatische Domäne war für die Oligomerisierung von CadC essentiell. Die Tetramere traten sowohl unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen auf. Daher scheint eine Aktivierung von CadC durch eine Oligomerisierung von CadC-Monomeren, die durch Umgebungsbedingungen wie den pH-Wert und die Lysin-Konzentration moduliert wird, unwahrscheinlich. Basierend auf den oben angeführten Daten wurde ein Modell für die transkriptionelle Aktivierung des cadBA-Operons entwickelt. Demzufolge bildet H-NS unter nicht-induzierenden Bedingungen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons einen Repressionskomplex. Unter induzierenden Bedingungen bindet CadC als Tetramer zunächst an die Bindestelle Cad1, wodurch die anschließende Bindung an Cad2 erleichtert und stabilisiert wird. Durch die Bindung von CadC wird der H-NS vermittelte Repressionskomplex aufgelöst, wodurch eine Interaktion der RNA-Polymerase mit der -35/-10-Region von PCad und die cadBA-Transkription ermöglicht werden. Verschiedene membranintegrierte Transkriptionsfaktoren in eukaryontischen Zellen werden durch eine Regulierte Proteolyse (RP) aktiviert. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum molekularen Mechanismus des membran-integrierten Transkriptionsaktivators CadC ergaben bisher keine Hinweise darauf, dass CadC unter induzierenden Bedingungen durch einen Mechanismus ähnlich den der Regulierten Proteolyse aktiviert wird. Um die Funktion der Transmembrandomäne und der periplasmatischen Domäne für die Aktivierung von CadC genauer zu analysieren, wurden verschiedene C-terminal verkürzte CadC-Derivate hinsichtlich ihrer Funktionalität untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine Membranassoziation oder -integration von CadC für die Induktion der cadBA-Expression notwendig war. Desweiteren war die periplasmatische Domäne für die CadC-Aktivierung essentiell. In Zusammenarbeit mit dem Department für Physik der LMU München wurde ein in silico Modell für die Regulation der cadBA-Expression erstellt. Zur Überprüfung des Modells wurde die Expression des Cad-Systems während einer simulierten Magen-Passage in vivo analysiert. Die experimentellen Daten stimmten mit dem Modell sehr gut überein. Das Modell ist also in der Lage, die in vivo-Daten zu abzubilden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der genauen physiologischen Funktion des Cad-Systems. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Cad-System eine wichtige Funktion für die Säureresistenz von E. coli bei extremen Säurestress bei pH-Werten

Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.