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Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

Ein bislang nur wenig verstandenes chemo¬sensorisches Zellsystem stellen Spermien dar, die im weib¬lichen Genital¬trakt komplexe Gemische ganz verschiedener Liganden wahr-nehmen müssen, um ihre für eine erfolgreiche Befruchtung essentiellen Aufgaben erfüllen zu können. Dazu gehören u. a. ein sekundärer Reifungsprozess (Kapazitierung), die Weg¬findung zur Eizelle im Eileiter und die Akrosom¬reaktion zur enzymatischen Auflösung der Glyko¬protein¬matrix (Zona pellucida) der Oocyte. Die Sensor¬moleküle auf der Oberfläche des Spermiums, die eine Erkennung bestehender Konzentrations-gradienten von Amino¬säuren, Kohlen¬hydraten, Hormonen, von verschiedensten Ionen und Protonen im luminalen Milieu des weiblichen Genital¬trakts sowie der Kohlenhydrat-reichen Zona pellucida ermöglichen, sind jedoch trotz ihrer Bedeutung für eine erfolgreiche Fertilisation weitgehend unbekannt. Geschmacks¬rezeptoren repräsentieren spezialisierte Erkennungs¬moleküle, die in Sinnes-zellen der Zunge die präzise Detektion eines breiten Spektrums chemisch sehr diverser Geschmacks¬stoffe ermöglichen, welche auffällige Ähnlichkeiten mit den potentiellen Liganden in der wässrigen Umgebung von Spermien im weiblichen Genital¬trakt aufweisen. Interessanterweise werden diese Rezeptorproteine aber nicht nur in Geschmacks¬sinneszellen, sondern auch in chemosensorischen Zellen einer Vielzahl extra-oraler Gewebe exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb mit Hilfe biochemischer, molekular- und zell-biologischer Techniken sowie mit reproduktions¬biologischen Methoden und unter Verwendung Geschmacks¬rezeptor-defizienter Mäuse der Frage nachgegangen, ob Rezeptor¬moleküle des Geschmacks¬systems als Kandidaten für chemische Sensor-moleküle von Spermien in Betracht kommen. Dabei wurde ein Detektions¬molekül für saure Geschmacksstoffe, der PKD2L1, immun-cyto¬chemisch im Hoden der Maus und in reifen murinen Spermien nach¬gewiesen. Funktionell könnte dieser im Flagellum von Spermien exprimierte Ionenkanal an der Registrierung der verschiedenen Protonen¬konzentrationen im Milieu des weib¬lichen Genital¬trakts beteiligt sein. Weiterhin konnte eine Expression von gustatorischen GPCRs der Tas1r-Familie (süß/umami) und Tas2r-Familie (bitter), in männ¬lichen Reproduktions¬organen und in reifen Spermien gezeigt werden. Zudem wurden Hinweise auf die Expression der gustatorischen G Protein α Untereinheit Gustducin, die in Geschmacks¬sinnes¬zellen an der Signal¬transduktion dieser beiden Rezeptor¬familien beteiligt ist, im männlichen Reproduktions¬system erbracht. Im Einzelnen konnten mit der RT-PCR-Technik Transkripte von 28 der insgesamt 35 Mitglieder der großen Familie der murinen Bitter¬rezeptoren (Tas2rs) aus Hoden-gewebe amplifiziert werden. Die Bedeutung der Expression von Bitter¬rezeptoren für die Reproduktion wurde exemplarisch anhand einer Gen-defizienten Maus für den Tas2r131 unter¬sucht. Bei dieser Knockin-Maus¬linie war die kodierende Rezeptor¬sequenz durch eine GFP-Expressions¬kassette ersetzt worden, so dass das Maus¬modell gleich-zeitig auch eine Bestätigung der Expression des Tas2r131 in späten Keim¬zell¬stadien der Spermato¬genese ermöglichte. Bei der Fertilitätsanalyse Tas2r131-defizienter Tiere waren unter Labor-Zucht¬bedingungen keine Veränderungen in der Anzahl der Nach¬kommen pro Wurf oder der Zeitspanne zwischen den Würfen feststellbar. Allerdings wiesen Tas2r131-defiziente Männ¬chen signifikant mehr epididymale Spermien auf als Wildtyp-Tiere. Darüber hinaus war bei Verpaarungs¬studien mit hetero¬zygoten Männchen eine Genotyp-Verschiebung zugunsten des Tas2r131 [-] Allels zu registrieren. Dieser Phänotyp könnte darauf hindeuten, dass der Tas2r131 eine funktionelle Rolle bei Tas2r-abhängigen Auswahlprozessen verschiedener Spermien¬populationen spielt, bei denen sich z. B. durch eine Regulation der Apoptose im Verlauf der Keimzell¬bildung (Spermatogenese) oder auch durch eine Beeinflussung z. B. der Weg¬findung im weiblichen Genitaltrakt ein Selektions¬vorteil für Tas2r131-defiziente Spermien ergeben könnte. Aus der Familie der Tas1-Rezeptoren, deren drei Mitglieder als Heterodimere für die Erkennung von süßen Stimuli und dem Geschmack von Mononatrium¬glutamat („umami“) verant¬wort¬lich sind, konnten in RT-PCR-Experimenten die beiden Unter-einheiten des Umami-Rezeptors, der Tas1r1 und Tas1r3, aus Hodengewebe der Maus amplifiziert werden. Mit Hilfe Subtyp- und Spezies-spezifischer Antikörper konnte gezeigt werden, dass beide Rezeptor¬proteine im Akrosom und in distinkten Abschnitten des Flagellums von murinen und humanen Spermien exprimiert werden. Die funktionelle Rolle des Umami-Rezeptors wurde mit Hilfe einer Tas1r1-defizienten mCherry Reportermauslinie unter¬sucht, die unter optimalen Zuchtbedingungen ebenfalls keine Fertilitäts¬einschränkungen erkennen ließ. Im Hoden dieser Tas1r1-defizienten Tiere waren jedoch morpho¬logische Veränderungen des Keim¬epithels und eine signifikant erhöhte Apoptose¬rate zu registrieren, die allerdings keine verminderte Anzahl reifer Spermien oder Störungen der Morphologie oder Motilität dieser Zellen zur Folge hatte. Stimulierungsexperimente mit isolierter Zona pellucida, dem physiologischen Auslöser der Akrosomreaktion, haben zudem gezeigt, dass keine Ein¬schränkungen bei Spermien Tas1r1-defizienter Tiere fest¬zustellen waren. Allerdings wiesen Tas1r1-defiziente Spermien eine signifikant höhere Rate an spontaner Akrosom¬reaktion auf, die in unkapazitierten Zellen mit signifikant erhöhten basalen Konzentrationen der second messenger cAMP und Ca2+ einherging. Durch eine Reduzierung der intra¬zellulären Konzentrationen dieser Botenstoffe, die elementare Aufgaben des Spermiums im Verlauf des sequentiellen Prozesses der Fertilisation regulieren, könnten Tas1-Rezeptoren somit durch eine basale Rezeptor-aktivität oder durch eine Liganden-induzierte Rezeptor¬stimulation sicherstellen, dass Spermien im weiblichen Genitaltrakt in einem Ruhezustand erhalten werden, bevor sie in Kontakt mit der Eizelle kommen können. Insgesamt kann dieser Nachweis einer funktionellen Expression von Geschmacks-rezeptoren in Spermien zu einem besseren Verständnis der Regulations¬mechanismen zentraler Spermien¬funktionen beitragen und langfristig möglicherweise auch repro-duktions¬medizinische Perspektiven zur gezielten positiven bzw. negativen Manipulation von Spermien und damit zur Behandlung männlicher Infertilität bzw. zur Entwicklung nicht-hormoneller Verhütungsmittel für den Mann eröffnen.

In vorliegender prospektiver Arbeit konnten koagulase-negative Staphylokokken und anaerobe Propionibakterien als die häufigsten Vertreter der Normalflora auf der Bindehaut von insgesamt 190 vaginal- und per Kaiserschnitt geborenen Neugeborenen in den beiden Krankenhäusern Asunción (Paraguay) und Clorinda (Nord-Argentinien) aufgezeigt werden. Der Untersuchungszeitraum lag in Asuncion zwischen dem 01. August und dem 06. Oktober, in Clorinda zwischen 15. September und dem 14. Oktober 2002. Hinsichtlich der untersuchten Antibiotika-Resistenzspektren von aus Neugeborenenaugen isolierten Staphylokokken stehen hohe Sensibilitätsraten bezüglich in der Studienregion noch wenig eingesetzter Substanzen wie Fluorchinolone, sowie eine Vollsensibilität gegenüber Imipenem und Vancomycin, ausgeprägtem Resistenzverhalten bezüglich Penicillinen gegenüber. Eine äußerst wichtige Feststellung in vorliegender Arbeit ist der fehlende Nachweis von Neisseria gonorrhoeae in den Augen von Neugeborener sowie in den Proben aus dem unteren Genitaltrakt untersuchter Mütter. Der fehlende Chlamydiennachweis im unteren Genitaltrakt der 81 untersuchten schwangeren Patientinnen weist auf eine niedrige Prävalenzraten dieser Mikroorganismen in untersuchtem Studienkollektiv hin, eine Tatsache, deren endgültige Bestätigung jedoch noch auf weitere Studien in der Zukunft angewiesen ist. Aus letzteren Aspekten könnte ein Verzicht auf den Einsatz von Silbernitratlösung als Prophylaxe von ophthalmia neonatorum (Prophylaxe nach Credé) gerechtfertigt werden, eine Maßnahme, welche innerhalb der letzten zehn Jahre durch den Einsatz alternativer antibiotisch wirksamer Substanzen bereits an Bedeutung verloren hat. Der Vorteil jener Alternativpräparate ist die deutlich geringere lokale Reizung des Auges nach Verabreichung im Vergleich zu hohen Raten von Silbernitrat-induzierten chemischen Konjunktividen. Der Einsatz von Povidon-Jod als eine wirksame, neue Form der Prophylaxe sollte jedoch in weiteren Studien in unserer Studienregion klinisch noch weiter untersucht werden.