Podcasts about mauslinie

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010]. In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren. In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005]. Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist. Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet. Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert. Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005). Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben.

Die mitochondriale Thioredoxinreduktase (Txnrd2) stellt als ubiquitär exprimiertes Selenoprotein ein wichtiges redox-aktives Enzymsystem zum Schutz vor oxidativem Stress dar. In einem Txnrd2-defizienten Mausmodell stellte sich eine embryonale Letalität am Tag E13.0 heraus. Hingegen zeigte sich in einem pankreasspezifischen Txnrd2-knockout ab der vierten Woche post partum eine spontan entstehende Pankreaserkrankung, die sich innerhalb einen Jahres zu einer fibrotischen exokrinen Pankreashypotrophie entwickelte. Dieses pankreasspezifische Modell, das durch Kreuzung einer Ptf1a-Cre transgenen Linie mit einer Mauslinie, deren Txnrd2 von loxP Sequenzen flankiert ist, generiert wurde, wird derzeit umfassend untersucht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Generierung und Testung zweier Targetingvektoren zur Etablierung eines Mausmodells, das die Überexpression der murinen Txnrd2 in unterschiedlichen Organsystemen erlaubt. Dies geschieht im Hinblick auf die Generierung eines genetischen rescue des Txnrd2-Phänotyps im bestehenden pankreasspezifischen knockout-Modell zur Klärung der Fragestellung, ob durch das Wiedereinschalten der Txnrd2 Veränderungen oder gar eine Reversibilität des beobachteten Phänotyps möglich sind.

Mon, 16 Apr 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14315/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14315/1/Werthat_Florian.pdf Werthat, Florian

Die Kontrolle von selbstreaktiven T-Zellen durch Toleranzmechanismen ist ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems zur Vermeidung von Autoimmunkrankheiten. Man vermutet, dass Kreuzpräsentation von körpereigenen Ag in Abwesenheit einer Entzündung einen Mechanismus darstellen könnte, periphere CD8+ T-Zell-Toleranz zu induzieren. Durch Kreuzpräsentation werden von Dendritischen Zellen (DC) Antigene (Ag), die nicht von DC selbst exprimiert werden (exogene Ag), im Kontext von MHC Klasse I an CD8+ T Zellen präsentiert. Apoptotisches Material, welches von eigenen Geweben stammt, könnte dabei als Quelle für Selbstantigene dienen. Man hat kürzlich die Wichtigkeit der kleinen Rho-GTPase Rac1 für die Phagozytose apoptotischen Materials entdeckt. Um die Rolle von Kreuzpräsentation in der peripheren Toleranzinduktion durch DC in vivo zu untersuchen, wurde eine transgene Maus konstruiert, in der Rac1 DC-spezifisch inhibiert ist (CD11c-Rac1(N17) Tg+). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde diese Mauslinie zunächst näher charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die CD11c-Rac1(N17) Tg+ Maus einen Defekt in der Kreuzpräsentation von löslichem Protein aufzeigt. Dabei war der Effekt unabhängig von der Art der Ag-Aufnahme. Die Präsentation endogener Ag in Form von Viren oder die Präsentation löslicher Peptide war indes normal. Durch Verwendung von OVA-Alexa Fluor 647 und DQ-OVA konnte festgestellt werden, dass in transgenen DC die Menge aufgenommenen OVA-Proteins reduziert und die Menge prozessierten OVA-Proteins normal bis leicht reduziert ist. Kerksiek et al. zeigten außerdem eine verminderte Phagozytose von zellassoziierten Ag durch transgene DC. Es ist insgesamt anzunehmen, dass eine verminderte Kreuzpräsentation zumindest zum Teil auf einem Defekt in der Ag-Aufnahme beruht, evtl. auch auf einen Defekt im Prozessierungsablauf. Eine reduzierte Ag-Präsentation von löslichen Ag durch transgene DC an CD4+ T-Zellen konnte ausgeschlossen werden. Diese Ergebnisse zeigen zusammenfassend, dass die CD11c-Rac1(N17) Tg+ Maus ein geeignetes Werkzeug darstellt, um die Rolle von Kreuzpräsentation in vivo zu studieren. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde weiterhin gezeigt, dass Kreuzpräsentation ein wichtiger Prozess ist, um periphere Toleranz zu induzieren und aufrechtzuerhalten. In einem Mausmodell für autoimmunen Diabetes (Rip-mOVA), löste die verminderte Kreuzpräsentation von membrangebundenem Ovalbumin (mOVA) im Pankreas Diabetes aus. Es wurde zwar weniger Proliferation der OT-I T-Zellen in doppeltransgenen Mäusen (Rac/Rip) als in Rip-mOVA Mäusen beobachtet, diese noch vorhandenen OT-I Zellen waren jedoch wegen verminderter Kreuztoleranz nicht anerg, wie es in Rip-mOVA Mäusen zu sehen war. Das führte nach Immunisierung mit HSV-OVA schließlich zur Zerstörung der -Inselzellen und damit zur Auslösung von Diabetes. Versuche, in denen T-Zellen von CD11c-Rac1(N17) Tg+ Mäusen in Rezipienten mit Thy1.1 Hintergrund transferiert wurden, deuten auch darauf hin, dass in CD11c-Rac1(N17) Tg+ Mäusen die Ausübung peripherer Toleranz inhibiert ist. Es sollte weiterhin gezeigt werden, ob die potentiell autoreaktiven CD8+ T-Zellen der transgenen Mauslinie ausreichen, um Autoimmunität in Form einer Transplantat-gegen-Empfänger Krankheit (GVHD) auszulösen. In Abwesenheit von CD4+ T-Zellen blieben (auch) die (Kontroll-) Versuchstiere gesund. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass eine effektive Kreuzpräsentation auf die CD4+ T-Zell Hilfe angewiesen ist. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, wie essentiell die ständige Kreuzpräsentation von exogenen Selbstantigenen für die Kontrolle von Autoimmunreaktionen ist.

Zyklonukleotid-aktivierte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) spielen eine Schlüsselrolle im Seh- und Riechprozess. Der olfaktorische CNG-Kanal besteht aus den Untereinheiten CNGA2, CNGA4 und CNGB1b. Sowohl CNGA4 als auch CNGB1b können in heterologen Expressionssystemen nur zusammen mit CNGA2 funktionelle Kanäle bilden. Sie werden auch als modulatorische Untereinheiten bezeichnet, da sie dem CNG-Kanal charakteristische Eigenschaften verleihen. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von CNGB1b im Riechprozess anhand einer CNGB1-defizienten Mauslinie (CNGB1KO-Maus) untersucht werden. CNGB1KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen ein deutlich eingeschränktes Riechvermögen. Dieses äußerte sich in verringertem Körpergewicht, schlechterem Abschneiden in einem Riechtest und einem veränderten Elektroolfaktogramm (EOG). EOGs von CNGB1KO-Mäusen zeigten verglichen mit WT-Mäusen ein verzögertes Einsetzen, eine verkleinerte Amplitude und eine verlangsamte Rückbildung der Duftantwort. Als Ursache für die verzögert einsetzende Reizantwort konnte eine verringerte Sensitivität des CNG-Kanals gegenüber zyklischen Nukleotiden ausgemacht werden. Die verkleinerte Amplitude im EOG konnte durch eine verringerte Menge an Kanalprotein erklärt werden, was einen um Faktor zehn verminderten CNG-Strom zur Folge hatte. Das verlangsamte Abklingen der Duftantwort konnte auf ein Fehlen der Calcium-Calmodulin-abhängigen Inaktivierung des CNG-Stroms zurückgeführt werden. Eine Interaktion von CNGA2 und CNGA4 in CNGB1-defizienten Neuronen wurde durch Co-Immunpräzipitation nachgewiesen. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurde gezeigt, dass CNGA2 und CNGA4 zwar assemblierten, nicht aber in die Zilienmembran der ORNs transportiert wurden. Vielmehr wurde der CNGA2/CNGA4-Kanal in subziliären Zellkompartimenten zurückgehalten. Der Versuch, die Translokation in das Zilium durch Hemmung des proteolytischen Abbaus der CNG-Untereinheiten zu ermöglichen, war nicht erfolgreich, was auf eine streng reglementierte Qualitätskontrolle in olfaktorischen Rezeptorneuronen schließen ließ. Morphologisch unterschied sich das olfaktorische System von CNGB1KO-Mäusen verglichen mit dem Wildtyp durch eine Reduktion der Schichtdicke des olfaktorischen Epithels sowie einen verkleinerten Bulbus olfactorius. Neurone des Bulbus olfactorius von CNGB1-defizienten Mäusen waren bezüglich ihrer Duftantwort nicht von Wildtyp-Neuronen zu unterscheiden. Für die Bedeutung der CNGB1b-Untereinheit kann festgehalten werden, dass sie dem olfaktorischen CNG-Kanal charakteristische Eigenschaften wie erhöhte Empfindlichkeit gegenüber zyklischen Nukleotiden, die Fähigkeit zur Calcium-Calmodulin-abhängigen Inaktivierung und kontrolliertes Single Channel Flickering verleiht. Zudem spielt die CNGB1b-Untereinheit zusammen mit CNGA4 eine essentielle Rolle für den Transport des CNG-Kanals in die Zilienmembran der ORNs. Darüber hinaus ist CNGB1b unentbehrlich für eine normale Entwicklung des olfaktorischen Systems.

BRUCE (BIR repeat-containing ubiquitin-conjugating enzyme) ist ein konserviertes, 528 kDa großes, peripheres Membranprotein des trans-Golgi-Netzwerks und ein strukturell neuartiges Ubiquitin-Konjugationsenzym (UBC) der Maus. Zusätzlich zu der am C-Terminus befindlichen UBC-Domäne enthält BRUCE im N-terminalen Bereich ein BIR (baculovirus inhibitor of apoptosis repeat)-Motiv, die charakteristische Domäne aller BIRPs (BIR-domain containing proteins). Die meisten dieser Proteine haben anti-apoptotische Eigenschaften und werden deshalb in der IAP (inhibitor of apoptosis proteins)-Familie zusammengefasst. Auch BRUCE konnte in vitro als Inhibitor apoptotischer Prozesse beschrieben werden. Um die Funktion von BRUCE in vivo zu untersuchen, wurde eine BRUCE-defiziente Mauslinie etabliert und im Rahmen dieser Arbeit phänotypisch charakterisiert. Die vollständige Inaktivierung des BRUCE-Gens führte zu einer Verzögerung des embryonalen Wachstums sowie zum perinatalen Tod der Knockout-Organismen. BRUCE wird in fast allen embryonalen Geweben exprimiert, deutlich sichtbare morphologische Veränderungen in Folge seiner Deletion traten jedoch hauptsächlich im extra-embryonalen Gewebe der Plazenta auf. Nach störungs-freier Initiierung der Organogenese zeigte sich mit zunehmender Reifung der Plazenta eine Verzögerung der Ausbildung des Labyrinthsystems sowie eine deutliche Reduktion der Spongiotrophoblast-Schicht. Dieses Entwicklungsdefizit kann Ursache einer stark eingeschränkten Effizienz der Nähr- und Sauerstoffversorgung des Embryos sein und sowohl zu Wachstumsretardierung als auch zu perinataler Letalität der transgenen Organismen führen. Die morphologischen Veränderungen im Gewebe wurden nicht, wie ursprünglich angenommen, durch eine erhöhte Apoptoserate der Zellen hervorgerufen. Stattdessen konnten in den defekten plazentalen Geweben drastische Veränderungen in Proliferationsverhalten und Differenzierungsstatus der Trophoblast-Zellen beobachtet werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Auswirkungen des BRUCE-Verlusts auf den Modellorganismus zeigen einerseits die essentielle Bedeutung von BRUCE für die Entwicklung sowie den funktionellen Erhalt der Plazenta und damit für die gesamte Embryonalentwicklung der Maus. Andererseits geben die Ergebnisse Hinweise darauf, dass dieses ungewöhnliche Enzym möglicherweise eine überlebensnotwendige regulative Funktion der Inhibition Apoptose-induzierter oder nicht-apoptotischer Caspase-Aktivität bei Proliferations- und/oder Differenzierungs-ereignissen bestimmter Zelltypen besitzt.

Nierenerkrankungen stellen aufgrund ihres häufig chronischen Verlaufs einen langen Leidensweg für den Patienten und einen nicht zu vernachlässigenden Kostenpunkt für das Gesundheitswesen dar. Die Erforschung der Faktoren, die in der Progression von Nierenerkrankungen eine Rolle spielen, ist daher nicht nur von wissenschaftlichem, sondern auch von volkswirtschaftlichem Interesse. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erstellung eines Tiermodells, in dem die Veränderungen im Zuge der progressiven Glomerulosklerose auf Proteom- und Transkriptomsebene optimal charakterisiert werden können. Dafür wurde die Überexpression von bovinem Wachstumshormon, die reproduzierbar zu einer gut charakterisierten Kaskade von Nierenveränderung führt, in transgenen Mäusen gewählt. Zur Elimination der eventuell störenden genetischen Variabilität wurde das Modell auf dem Inzuchtstamm FVB erstellt, der keine spontanen Nephropathien aufweist. Als Promoter wurde der ubiquitär aktive cβa Promoter gewählt, wodurch zirkulierende GH-Konzentrationen in der Größenordnung von 2-4 µg/ml erreicht wurden. Um die Eignung der neuen transgenen Mauslinie für weitere Analysen zu evaluieren, wurden die auftretenden klinischen, klinisch-chemischen, makroskopisch-pathologischen und histologischen Veränderungen eingehend charakterisiert. Die GH-Überexpression führte zu einem deutlich rascheren Gewichtsanstieg unter Aufhebung des Geschlechtsdimorphismus und zu einer stark verringerten Lebenserwartung. Histologisch zeigten sich in der Niere das erwartete Spektrum renaler Alterationen, das weitgehend den in anderen GH transgenen Mauslinien beobachteten Alterationen gleicht. Anhand der histologischen Befunde und der klinisch chemischen Anzeichen einer Nierenfunktionseinschränkung, kann die progressive Nephrosklerose am ehesten als Todesursache angesehen werden. Zusammenfassend wurde mit der cβa-bGH transgenen Mauslinie zum ersten Mal ein Modell für chronisch progredientes Nierenversagen auf dem Inzuchtstamm FVB etabliert. Aufgrund der genetischen Uniformität und der in dieser Arbeit beschriebenen klinischen und histologischen Veränderungen erscheint dieses neue Modell hervorragend geeignet, um Pathomechanismen des chronischen Nierenversagens mit holistischen Untersuchungsansätzen (Transcriptomics, Proteomics) auf molekularer Ebene zu charakterisieren.

Cyclic nucleotide-gated (CNG) channels are important mediators in the transduction pathways of rod and cone photoreceptors and olfactory receptor neurons. Native CNG channels are composed of homologous A and B subunits. In heterologous expression systems, B subunits alone cannot form functional CNG channels, but they confer a number of channel properties when coexpressed with A subunits. To investigate the importance of the CNGB subunits in vivo, we deleted the CNGB1 gene in mice by gene targeting and homologous recombination. In the absence of CNGB1 in the rods, only trace amounts of the CNGA1 subunit were found in the rod outer segment. In electroretinograms (ERGs) CNGB1 KO-mice showed no rod-mediated responses. The rods also showed a slow-progressing degeneration caused by apoptotic death and concurred by retinal gliosis. Cones were primarily unaffected, but they started to degenerate after 6 months. At the age of about one year, CNGB1 KO-animals were lacking both rods and cones. Our results show that CNGB1 is a crucial determinant of native CNG channel targeting. As a result of the lack of rod CNG channels, CNGB1 KO-mice develop a retinal degeneration that resembles human retinitis pigmentosa.

In der Biomedizin haben Tiermodelle eine unentbehrliche Bedeutung erreicht. In den letzten Jahren wurde eine Methode zur Generierung von Tiermodellen eingeführt, welche auf willkürlichen genetischen Manipulationen mittels der mutagenen Substanz ENU basiert. Hierbei wurden relevante Mausvarianten ausschließlich aufgrund ihres Phänotyps selektiert und zur Gründung einer neuen Mauslinie verpaart. Da es sich hierbei um einen hypothesenfreien Ansatz handelt, wurde für die Verhaltensphänotypisierung ein komplexer Versuchsaufbau gewählt, welcher es erlaubte, eine Vielzahl von Verhaltensdimensionen in einem Test zu untersuchen. Aufgrund der schnellen und zuverlässigen Untersuchungsmöglichkeiten schien das mHB besonders gut geeignet als Hochdurchsatzverfahren im Rahmen des ENU-Projektes. Mit dieser Methode wurde eine dominante Mausvariante identifiziert, welche sich durch eine beeinträchtigte Objekterkennung von wt Tieren unterschied. Basierend auf diesem F1-Tier wurde die RO-Linie gegründet. Im Laufe der vorliegenden Arbeit wurde die RO-Linie über sieben Generationen gezüchtet und im mHB verhaltenscharakterisiert, um vor allem die Penetranz und Stabilität des Phänotyps über mehrere Generationen zu untersuchen. Dabei wurde gezeigt, dass RO-Mäuse einen sehr selektiven Verhaltensphänotyp darstellten, der sich ausschließlich in der Objekterkennung von wt-Tieren differenzieren ließ. Die Penetranz des Phänotyps lag mit 46% in einem idealen Bereich für einen dominanten Vererbungsgang. Zur weiteren Analyse des Verhaltensphänotyps von RO-Mäusen wurden diese in zwei selektiven Verhaltenstests, dem Objekterkennungstest und einem räumlichen Lerntest, untersucht. Während sich der Verhaltensphänotyp in dem selektiven Objekterkennungstest bestätigte, wurde in dem komplexen räumlichen Lerntest kein Unterschied zwischen RO--und wt-Mäusen beobachtet. Folglich konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Linien in hippokampusabhängigen Aufgabestellungen nicht voneinander unterschieden. Durch immunhistologische als auch elektrophysiologische Untersuchungen sind Hirnareale im kortikalen Temporallappen definiert, welche zur Wahrnehmung und zur Verarbeitung der Informationen während eines Objekterkennungstests aktiviert werden. Auf dieser Kenntnis basierend wurde die c-Fos Expression nach einem Objekterkennungstest von RO-Tieren und wt-Mäusen untersucht. Die Resultate zeigten, dass bei RO-Tieren eine erhöhte sensorische Aktivität ausgelöst wurde, jedoch war in der Hirnregion zur Verarbeitung und Speicherung dieser Informationen weniger neuronale Aktivität zu erkennen. Folglich könnte die beeinträchtigte Fähigkeit zur Objekterkennung auf einen Unterschied der Tiere bei der Verarbeitung von Gedächtnisinhalten zurückzuführen sein. Zur Untersuchung der klinischen Relevanz der RO-Mäuse als Tiermodell wurde eine pharmakologische Validierung mit dem Acetylcholinesterasehemmer Metrifonate in einem selektiven Objekterkennungstest durchgeführt. Dabei wurde durch die Behandlung mit Metrifonate eine signifikante Verbesserung der Objektdiskriminierung bei RO-Tieren erreicht. Somit ist die RO-Linie als valides klinisches Tiermodell einzustufen. Als erster Versuch zur Ermittelung des manipulierten Gens sollte mittels einer Kopplungsanalyse die chromosomale Region der Mutation im Genom ausfindig gemacht werden. Dafür wurden Mikrosatellitenmarker über das komplette Genom verteilt und nach einer gekoppelten Vererbung mit dem Phänotyp in Form eines rekombinanten Locus abgesucht. Soweit wurde noch keine signifikante Kopplung zwischen dem Phänotyp und einem der genetischen Marker gefunden. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Abstände zwischen den Mikrosatelliten zu groß gewählt waren. Eine zweite Erklärung wäre, dass der Verhaltensphänotyp nicht auf einer genetischen Grundlage basierte.

Die Eph-Familie von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Liganden, die Ephrine, sind die größte Gruppe von axonalen Zielführungsmolekülen. Die membrangebundenen Ephrine und ihre Rezeptoren sind jedoch nicht ausschließlich für die Etablierung neuronaler Konnektivität, sondern auch für Entwicklungsvorgänge außerhalb des Nervensystems wie die Ausbildung des Blutgefäßsystems und die Steuerung von Zellmigration von Bedeutung. Als charakteristisches Merkmal dieser Molekülfamilie kann jeder einzelne Rezeptor durch eine Vielzahl verschiedener Ephrine aktiviert werden, was eine starke funktionelle Redundanz zur Folge hat. Konventionelle knock-out Experimente liefern daher nur ein unvollständiges Bild von der Funktion dieser Proteine, da eine genetische Deletion von Einzelmolekülen zumindest partiell von anderen Vertretern der Eph-Familie kompensiert werden kann. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine transgene Mauslinie etabliert, welche im gesamten Nervensystem ein sezerniertes, Antikörper-ähnliches Fusionsprotein, einen sog. Rezeptorkörper, exprimiert. In dieser Mauslinie sollte der Rezeptorkörper alle Ephrine der sog. A-Subfamilie zugleich binden und neutralisieren, und damit die funktionelle Redundanz der A-Ephrine überwinden. Hierzu wurde in einem ersten Schritt der Rezeptorkörper kloniert, in Zellinien exprimiert und hinsichtlich seiner Funktionalität charakterisiert. In einem zweiten Schritt wurde nun das Mikrotubuli bindende Protein Tau gegen die cDNA des Rezeptorkörpers ersetzt (sog. knock-in), und nach Keimbahntransmission des rekombinanten Allels wurde durch Rückkreuzung gegen den Inzuchtstamm C57BL/6 eine congenische Mauslinie erzeugt. In dieser Mauslinie wurde der Rezeptorkörper mit dem räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von tau exprimiert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden einige Eigenschaften der knock-in Mauslinie charakterisiert. Die vollständige Deletion des Tau-Proteins sowie die pan-neuronale Expression des Rezeptorkörpers wurden mit Hilfe von Northern-Transfer, mRNA in-situ Hybridisierung, RT-PCR sowie mit Western-Transfer und immunhistochemischen Experimenten belegt. Tiere mit dem rekombinanten Allel waren fertil, zeigten keine Hinweise für eine erhöhte prä- oder postnatale Letalität, und das äußere Erscheinungsbild der Mäuse war weitgehend unauffällig. Eine erste Analyse der Hirnanatomie mit Hilfe klassischer histologischer Färbemethoden lieferte keine Hinweise auf starke, offensichtliche morphologische Veränderungen. Mit einem Immunassay wurde die Gewebekonzentration des Rezeptorkörpers zu verschiedenen embryonalen und postnatalen Entwicklungsstufen quantifiziert. Auf subzellulärer Ebene wurde mittels immuncytochemischer Färbungen dissoziierter Neuronen demonstriert, daß der Rezeptorkörper nicht auf das Soma der Zellen beschränkt, sondern auch in Nervenfortsätzen lokalisiert war. Die Analyse der Mauslinie auf spezifische Veränderungen im dritten Teil der Arbeit konzentrierte sich auf sensorische Projektionen in Peripherie und Rückenmark, sowie auf physiologische Aspekte des visuellen Systems und Blutgefäße. In neugeborenen Tieren wurden keine offensichtlichen Veränderungen der topographischen Projektionen von Spinalganglien in das Rückenmark detektiert. In der Peripherie wurde in dem knock-in hingegen eine signifikante Zunahme von Nervenverzweigungen in verschiedenen Strukturen beobachtet, die bei der Innervierung von Extremitäten sowie bei Interkostalnerven zwischen dem 12. und dem 14. Tag der Embryonalentwicklung (E12-14) besonders ausgeprägt war. Die Untersuchung der Blutgefäße im zentralen Nervensystem adulter Mäuse mit Hilfe von Korrosionsausgüssen ließ in der Mutante keine offensichtlichen Veränderungen erkennen. Mit Hilfe der in Anwendung auf Mäuse neuartigen Technik „Intrinsic Signal Optical Imaging“ wurde die Repräsentation der Retina im Primären Visuellen Cortex juveniler und adulter Mäuse untersucht. Zentraler Befund dieser Experimente war eine Verzerrung der retinotopen Karte in dem knock-in, die in jungen Mäusen erheblich stärker war als in adulten Tieren.