Podcasts about zytoskelett

Willkommen zu Folge 110 vom MS-Perspektive-Podcast. Ich habe heute Dr. Katja Akgün zu Gast und wir unterhalten uns über die Neuroimmunologie und ihre Bedeutung für die Behandlung von Menschen mit Multipler Sklerose. Vorstellung Dr. Akgün ist Fachärztin für Neurologie, Leiterin des Infusionszentrums am Zentrum für klinische Neurowissenschaften und Leiterin des neuroimmunologischen Labors am Universitätsklinikum Dresden. Sie arbeitet eng mit dem MS-Zentrum Dresden zusammen, da das Infusionszentrum ein Teil davon ist. Einmal hat sie bei mir vertretungsweise das Arztgespräch gemacht. Dabei habe ich sie gleich angesprochen, ob sie als Interviewgast vorbeikommen will und sie hat direkt zugestimmt. Heute gibt uns Dr. Akgün einen kleinen Einblick in das Thema Neuroimmunologie. Denn die Neuroimmunologie spielt eine wesentliche Rolle bei Multipler Sklerose. Zur Neuroimmunologie hatte ich auch schon Professor Harms zu Gast, der erklärt hat, welche Forschungsfelder die Berliner Charité genauer untersucht. Höre gerne in die Folge rein, wenn es dich interessiert. Worum geht es in der Folge? Mit Dr. Akgün spreche ich  darüber: Woran in Dresden geforscht wird? Was das für MS-Patienten bedeutet? Welche Studien im Gange sind? Und welche Verbesserungen sich daraus für Menschen mit MS ergeben? Es wird eine ganz spannende Folge, bei der ich dir viel Spaß wünsche. Transkript des Interviews mit Dr. med. Katja Akgün Nele: Hallo Frau Dr. Akgün, schön, dass Sie da sind, ich freue mich riesig. Erstmal ein ganz liebes „hallo“ nach Dresden. Dr. med. Katja Akgün (Dr. Akgün): Ja, hallo, vielen Dank, liebe Grüße zurück. Schön, dass das heute klappt. Nele: Sie sind viel beschäftigt, insofern ganz großes Dankeschön, das sie sich die Zeit genommen haben. Bevor wir beginnen, sagen sie bitte nochmal ganz kurz etwas was zu sich, wer sie sind, damit die Hörerinnen und Hörer eine gkleine Idee haben, wen ich heute interviewe. Vorstellung und berufliche Stationen Dr. Akgün: Ich bin Katja Akgün, gehöre zum Dresdner Team von Professor Tjalf Ziemssen. Wir arbeiten beide eng zusammen. Ich bin groß geworden in dem Team und habe dort den Bereich kennengelernt und die Liebe zum wissenschaftlichen Aspekt bezüglich der Multiplen Sklerose gefunden. Ich habe hier in Dresden studiert, komme zwar nicht direkt hier aus der Region, sondern ein bisschen mehr nördlich aus der Oberlausitz. Aber ich bin sozusagen gar nicht weit weggezogen, sondern in Dresden gelandet. Habe hier studiert und damals meine Doktorarbeit bei Professor Tjalf Ziemssen gemacht. So bin ich in das Team gekommen. Initial , wollte ich gar nicht Neurologie machen, es hat mich aber so gefangen und bis heute nicht mehr losgelassen. Deshalb habe ich recht schnell meinen Schwerpunkt in der MS und in der Neuroimmunologie gefunden. Ich lebe hier mit meinem Mann und meiner Tochter. Mein Mann kommt eigentlich aus Gießen, das ist eine „Ost-West-Liebe“ bei uns, aber sind hier fest verankert und das passt alles ganz gut. Persönliche Motivation für den Beruf Nele: War das spannende Thema bei Professor Ziemssen der ausschlaggebende Punkt oder was war Ihre Motivation, dass sie letztendlich doch in die Neurologie reingerutscht sind? Gab es einen ganz speziellen Auslöser? Dr. Akgün: Naja, es war initial so, ich hatte damals im Studium immer ganz kurze Berührungspunkte mit den Fächern. Die Neurologie kommt im Medizinstudium relativ spät dran. Ich wollte damals eine Doktorarbeit machen und wissenschaftlich arbeiten, also richtig im Labor. Das wusste ich. Ich habe gesagt „wenn ich schon eine Doktorarbeit mache, dann richtig. Da will ich eine Pipette in der Hand halten und mit Zellkultur arbeiten und alles, was das Herz begehrt in der experimentellen Wissenschaft“. Einstieg ins Team vom MS-Zentrum Dresden Dann habe ich erstmal querbeet geschaut und Herr Ziemssen war damals noch ein junger Assistenzarzt, der gerade nach Dresden gekommen war und sein Labor aufgebaut hat. Er hat Leute gesucht, die das mit ihm machen wollen und so bin ich in das Team gerutscht und habe auch erstmal primär immunologisch gearbeitet und das ging dann letztendlich immer weiter. Das waren interessante Projekte. Begonnen hat es mit meiner Doktorarbeit, dabei habe ich bereits gemerkt „mit einer Doktorarbeit ist das Feld bei Weitem nicht abgedeckt“ und dann führte letztlich eins zum anderen. Ich habe mich zwar schon immer sehr für die Immunologie interessiert, also auch andere Autoimmunerkrankungen wie Rheumatologie, Dermatologie. Solche Fächer kamen prinzipiell auch in Frage, aber mir hat mal jemand gesagt „mach das, wo dein Herz hängt und wo du glaubst, dass dich das dein Leben lang begeistern kann. Immerhin musst du es dein Leben lang machen als Job“, und da habe ich gesagt „wenn ich ehrlich bin, ist es die Neurologie mit der Neuroimmunologie“. Herr Ziemssen hat mir zudem eine super Option in seinem Team angeboten. Da wäre ich schön dumm gewesen, wenn ich eine Kehrtwende gemacht hätte. Nele: Sehr gut, begeisterte Leute, das brauchen wir. Dann macht das Forschen ihnen mehr Spaß und sie finden auch mehr heraus. Womit beschäftigt sich die Neuroimmunologie im Allgemeinen und spezifisch auf die MS bezogen? Dr. Akgün: Neuroimmunologie ist ja eigentlich ein sehr großes Thema. Letztendlich geht es ja um autoimmune Phänomene bei neurologischen Erkrankungen. Die Multiple Sklerose ist da einfach so sehr im Fokus, weil sie die Erkrankung ist, wo wir den größten Patientenstamm haben. Es gibt aber viele neuroimmunologische Erkrankungen, beispielsweise das Guillain-Barré-Syndrom. Auch die Myasthenie ist letztendlich eine autoimmun vermittelte neurologische Erkrankung. Wir bei uns im Zentrum im Dresden fokussieren uns viel auf die chronisch-entzündlich Erkrankungen des zentralen Nervensystems und da ist die Multiple Sklerose eine der größten Vertreter. Die Neuroimmunologie beschäftigt sich dann natürlich mit ganz unterschiedlichen Facetten dieser Krankheitsbilder, hinterfragt also „was ist die Pathogenese? Wie entsteht diese Erkrankung? Wie wirken Medikamente? Wie müssen vielleicht Medikamente wirken, um gezielter diese Erkrankungen therapieren zu können?“. Aber eben auch Thema Biomarker-Monitoring, das in den letzten Jahren sehr in den Fokus geraten ist. Das sind Felder, die vom neuroimmunologischen Bereich abgedeckt werden und eigentlich das klinische Setting unterstützen sollen. Was haben sie in den letzten Jahren Neues über die Entstehung der Multiplen Sklerose herausgefunden? Dr. Akgün: Man muss klar sagen, dass wir das nicht alleine machen. Das ist Teamarbeit und da geht der Trend in den letzten Jahren deutlich hin. Ich bin jetzt ungefähr zehn Jahre in der Klinik. In der Zeit gab es schon einen immensen Wandel, dass man nicht mehr alleine in seinem Labor steht, sondern ein Team vor Ort hat, aber auch kooperiert mit anderen Laboren, weil jeder seine Expertise hat und wir heute schon feststellen, dass das so komplex ist und es auf so viele neue Messtechniken ankommt, dass wir zusammenarbeiten müssen. Den Wirkmechanismen der MS auf der Spur Es ist ja bekannt und oft diskutiert, dass die MS eine T-Zellen-mediierte Erkrankung ist, also die T-Zellen eine ganz wichtige Rolle spielen. Auch die B-Zellen sind gerade in den letzten Jahren sehr in den Fokus gerückt. Man hat das früher hinten angestellt und diese Erkenntnis, dass die T- und B-Zellen da sehr viel mehr interagieren miteinander und beide Funktionen und Schlüsselfunktionen haben, das sind Erkenntnisse aus den letzten Jahren. Andere Faktoren aber auch und das ist ein Schwerpunkt gewesen, den wir bei uns im Labor maßgeblich mit begleitet haben, ist der Aspekt, dass gerade T- und B-Zellen erstmal einen Auftrag kriegen müssen, bevor sie überhaupt aktiv werden und z. B. eine autoimmune Reaktion generieren können, also eine Reaktion gegen den eigenen Körper. Das machen nämlich sogenannte antigenpräsentierende Zellen oder dendritische Zellen und man weiß heute, dass wenn man die z. B. gezielt programmiert oder auch programmieren kann, man folglich eine T-Zell-Antwort verändert. Man vermutet zum einen, dass diese antigenpräsentierenden Zellen eine maßgebliche Rolle in der Entstehung der MS spielen und das konnten wir in unserem Labor mit verschiedenen Projekten und Messungen und Gewebeuntersuchungen nachweisen. Neue Behandlungsansätze Und es gibt jetzt – diese Ansätze kommen primär aus der Onkologie – schon die Idee, dass man die vorgeschalteten Zellen gezielt programmiert und verändert, um dann T- und B-Zellen – man sagt auch antigenspezifisch – also wirklich ganz selektiv positiv beeinflussen zu können. Der Vorteil dabei ist, dass man andere Funktionen des Immunsystems unbeeinflusst lässt und damit komplett erhält. Somit bleibt die Immunkompetenz weiterhin erhalten, was bisher manchmal ein Problem von immunsupprimierenden Therapien ist. Nele: Und sicherlich dadurch auch weniger Nebenwirkungen erzeugt, oder? Je spezifischer man wird, desto weniger Nebenwirkungen treten auf. Dr. Akgün: Exakt. Genau das ist das Ziel. Nele: Okay und da schauen sie, wie sie die Zellen sozusagen umprogrammieren. Die sind falsch programmiert und sie schauen, wie sie denen charmant vermitteln können, sich für die Person mit MS günstiger zu verhalten. Dr. Akgün: Sie haben es ganz schön gesagt, dieses charmante Vermitteln ist ja das, was bedeutet, dass es weniger Kollateralschäden gibt im Organismus und das wiederum bedeutet weniger Nebenwirkungen. Daher ist der charmante Weg das, was wir uns wünschen. Nele: Sehr gut. Jetzt haben sie auch gesagt, sie führen z. B. Studien zur Wirksamkeit von Therapien bei MS durch und dass sie dafür Biomarker nutzen. Ich glaube nicht jeder weiß genau, was Biomarker sind. Könnten sie das bitte einmal kurz und simpel erklären. Was sind Biomarker? Dr. Akgün: Auch das ist wieder ein sehr großer Begriff. Ich glaube was viele sich nicht immer so vor Augen führen, ist, dass ja alles, was sie als Patient an Untersuchungen erfahren in der Routinevorstellung beim Neurologen, Biomarker sind, die erhoben werden. Ein Biomarker ist eigentlich nur ein Messwert, der uns einen Zustand gibt über eine Erkrankung. Im besten Fall ist dieser Messwert sehr spezifisch, also selektiv für die Erkrankung und ich kann ihn bei wiederholten Messungen immer wieder gleich detektieren. Biomarker können ein Abbild sein für Reaktion, ein Ansprechen z. B. auf eine Therapie oder ein Indiz für eine Verschlechterung oder Verbesserung einer Erkrankung und somit ist es ein sehr großes Feld. Es gibt viele klinische Biomarker, da wären z. B. die neurologische Untersuchung –  der EDSS. Dann haben wir das MRT, auch das ist ein Biomarker, wenn man es so will, aber das Feld wird aktuell in den Studien sehr erweitert, weil diese Laborbiomarker, also die kleinste Funktion in dem großen Ganzen in den Fokus rücken und diese klinischen Marker immens unterstützen können. Wie viele interessante Biomarker aus dem Bereich der Neuroimmunologie haben Sie gefunden und wie gut geben diese Aufschluss darüber, ob eine Therapie wirkt oder vielleicht sogar in welcher Sensitivität? Dr. Akgün: Man muss sagen, wenn man sich traut in die Literatur der Neuroimmunologie und Biomarker zu gehen, wird man immens viele Sachen finden. Die Grundlagenwissenschaft spuckt immer wieder total spannende Parameter aus und das ist totaler Wahnsinn, was man da messen kann. Das ist auch ein bisschen die Intention, die wir haben mit unseren Studien. Sinnvoll ist es immer dann, wenn es am Ende beim Patienten landet. Wenn es hochrangig in einem Journal publiziert ist und dann steht es da auf weißem Papier, ist dem Patienten noch nicht geholfen. Deshalb wollen wir die Parameter heraus selektieren und die Techniken so gut zu verfeinern, dass es einfach messbar wird, effizient und kostengünstig ist und einen direkten Bezug zur Erkrankung hat. Wenn man das mal herunterbricht, bleibt aktuell gar nicht mehr so viel übrig. Etablierte Biomarker der Neuroimmunologie bei MS Was wir schon relativ regelmäßig nutzen, wenn MS-Patienten eine Immuntherapie bekommen, ist der Immunstatus. Man kann z. B. ein Blutbild machen, auch das wäre schon ein Biomarker. Aber man kann an dem Punkt noch sehr viel weiter in die kleinen Gruppen der Immunzellen gehen und diese Differenzierung zeigt uns bei verschiedenen Erkrankungen sehr gut auf, ob eine Therapie genommen wird oder nicht und auch wie intensiv der Effekt letztendlich in dem Immunsystem ist. Das funktioniert zum Beispiel für Natalizumab oder beim Fingolimod. Diese Typen von Biomarkern, setzen sich relativ gut durch und gehen in die Routine über. An der Schwelle zur Routine Demgegenüber gibt es aber andere Parameter wie bspw. Zytokinmessungen oder besonders aktuell die Neurofilamente, die an der Schwelle stehen zur Routine. Da wissen wir, das macht sehr viel Sinn. Die Krankenkassen interessieren sich dafür noch nicht wirklich, weil es natürlich immer Geld kostet, aber viele Patienten sind in immunologischen Studien oder man kann es auch auf Igelleistungen oder individuelle Abstimmungen machen und da wird es auch schon herangezogen. Nele: Jetzt muss ich nochmal ganz kurz rückfragen. Das klang gerade so, als ob sie bei manchen Medikamenten sehen können, ob der Patient, der die Therapie nehmen soll, diese überhaupt nimmt, oder? Denn „Therapietreue“ ist ja ein wichtiger Punkt. Ich habe das Thema zwar noch nicht individuell im Podcast angesprochen, will aber noch eine Folge dazu machen. Denn natürlich ist es hilfreich, zu wissen, ob der Patient sein Medikament nimmt oder nicht. Ansonsten denkt man „der Wirkstoff wirkt nicht, aber es liegt nicht am Wirkstoff, sondern daran, dass der Patient das Medikament nicht nimmt“. Ist das korrekt zusammengefasst? Dr. Akgün: Genau. Es gibt solche Möglichkeiten das zu monitoren. Nicht für alle Therapien so einfach, aber für bestimmte Präparate schon. Nele: Das ist ja gut für die allgemeine Aussage zur Wirksamkeit von Medikamenten. Dr. Akgün: Genau, was sie gerade angesprochen haben. Gerade wenn eben doch eine Krankheitsaktivität da ist. Da sollte im Arzt-Patienten-Vertrauen, unter vier Augen, ehrlich zugegeben werden, ob man das Medikament nimmt oder nicht, weil am Ende macht der Patient die Therapie nicht für mich als Arzt, sondern für sich und da muss man die Karten auf den Tisch legen. Aber prinzipiell kann man so etwas durch solche Biomarker differenzieren. Wie bestimmen sie die Biomarker und was verraten ihnen die Ergebnisse? Dr. Akgün: Das ist sehr vielfältig. Der Klassiker ist das Blut, obwohl man sagen muss, das ist eine relativ einfach zu erhebende Substanz. Sie ist in gewissen Mengen verfügbar und es macht keine zusätzlichen Umstände „ein Röhrchen mehr abzunehmen“, wenn die Patienten ein Routinemonitoring kriegen wo Leberwerte, Nierenwerte, etc. überprüft werden. Das gehört ja häufig zum Standardsetting mit dazu. Und die neuen Biomarker ergänzen dabei die Diagnostik. Es ist einfach ein sehr gutes Spiel, denn im Blut ist es ein Kompartment, was auch ein Immunkompartment ist, insofern dort zirkulierende Immunzellen abgebildet werden, die ja auf Wanderschaft sind und im besten Fall schon zeigen, was im restlichen Organismus ist, also ein Spiegel ist. Alternativen zum Liquor? Was natürlich trotzdem noch intensiv verwendet wird, ist der Liquor, also das Nervenwasser. Gerade bei der Multiplen Sklerose spielt das in der Erstdiagnostik eine sehr, sehr wichtige Rolle und man würde sicherlich noch häufiger Liquor entnehmen. Es ist eine exzellente Substanz, um eine sehr gute Aussage zu treffen, was zerebral, also im Zentralnervensystem, vor sich geht. Aber das ist natürlich eine Maßnahme, die man sich jetzt nicht alle drei Monate gönnen möchte und daher muss man andere Möglichkeiten finden und diskutieren, wie man möglicherweise schon eine Aussage treffen kann, wie die Konstellation im Nervenwasser ist, aber weniger invasiv und weniger kompliziert zu entnehmen ist. Das Potenzial von Bioproben wie Urin und Stuhl Andere Parameter sind momentan auch viel in Diskussion oder andere Substanzen oder Bioproben. Urin ist relativ einfach zu gewinnen und hat viele Analyten, die eine gute Aussagekraft haben. Das ist auch sehr im Fokus im Moment, wie man das weiter nutzen und verwenden kann. Stuhlproben, das klingt jetzt etwas eigenartig, aber das ist ja auch hier schon im Podcast in Diskussion gewesen. Da Ernährung und Immunsystem eng zusammenhängen, wird sich vielleicht auch in Zukunft einiges tun, und man wird herausfinden, ob man darüber eine Aussage treffen kann hinsichtlich Biomarkern in solchen Proben. Das sind ein bisschen die Klassiker. Alles andere ist schon sehr speziell. Man kann natürlich auch Hirnbiopsien machen und solche Aspekte. Das ist aber sehr individuell. Da muss man sehr komplizierte Fragestellungen haben. Das gehört nicht zu unserem Routinegeschäft. Nele: Ja, das klingt auch nicht so schön. Ich gebe, glaube ich lieber Urin und Blut ab. Und Lumbalpunktion ist etwas, worum sich die meisten MS-Patienten nicht so reißen. Dr. Akgün: Richtig. Nele: Jetzt haben sie bereits angesprochen, dass es verschiedene experimentelle Verfahren und Methoden gibt, die sie nutzen. Wenn es dich, liebe Lesering, lieber Leser interessiert, schau gern auf der Webseite nach, dort sind alle gelistet. Man findet dort unter anderem Zellkultur, verschiedene Analysen und Zellsortierung. Wie komplex sind die Untersuchungsverfahren und -methoden? Braucht man spezielle Geräte dafür? Eine hohe Rechenleistung? Gut ausgebildete Fachkräfte? Viel Zeit oder alles in Kombination? Dr. Akgün: Alles in Kombination trifft es ganz gut. Wir haben verschiedene Projekte oder auch Analysestufen im Labor, die zu unserem Forschungsauftrag gehören. Grundlagenforschung Manchmal sind die Analysetechniken noch sehr basal. Alles wird mit der Hand zusammenpipettiert, Zellen unter dem Mikroskop einzeln ausgezählt. Das ist die Essay-Entwicklung, die ersten Schritte. In dem Stadium wird viel probiert. „Wie muss ich die Konzentration zusammenstellen?“, etc. Da wird z. B. auch viel über Zellkultur gemacht. Das ist aber eine gute Möglichkeit, um sich an Biomarkermessungen heranzutasten. Vollautomatisierte Verfahren Dann gibt es bei uns auch im Labor vollautomatisierte Geräte. Dafür nehme ich die Probe des Patienten. Die wird auf das Gerät gestellt und nach vier Stunden gehe ich wieder ans Gerät und habe einen Messwert, eine Ausgabe mit einem Referenzbereich und das sind schon die Analyten, die sehr an diesem Routinesetting sind. Analysen im Zwischenstadium Außerdem haben wir viele Projekte, die sich genau in der Mitte befinden. Meist läuft das über eine unserer vielen Kooperationen. Ich denke da gerade an die Zellmechanik. Das ist eine Messtechnik, die zellmechanische Eigenschaften von Immunzellen beurteilen kann und die wir in Kooperation versuchen zu hinterfragen „wie nützt uns diese Messtechnik speziell bei unseren MS-Patienten, als Diagnosemöglichkeit oder als Therapiemonitoring?“ Da haben wir schon viel Erfahrung und das sind auch Prozedere, die automatisierter werden. Deshalb muss man ein bisschen differenzieren, was wir für ein Labor sind, weil es ja viele Arten von Laboren gibt. Diese Routinelabore, wo ich meine Serumprobe hinschicke und meine Leberenzyme und Nierenenzyme erhalte, sind vollautomatisiert. Das ist hoch qualitätsmangementgeprüft. So etwas sind wir nicht primär, sondern wir die Stufe davor, die an der Entwicklung beteiligt ist, um irgendwann Essays genau in dieses Routinesetting zu führen, und das ist notwendig, damit es irgendwann kosteneffektiv wird. Wenn Sie jemanden haben, der gut ausgebildet ist, dann aufwändige Geräte, die komplex auch in der Bedienung sind, das braucht Zeit, das braucht Equipment. Das ist teuer und für den Durchsatz, der ja heute auch Medizin bedeutet, eben noch nicht geeignet, aber wo die Reise hingeht für solche Biomarker. Zusammenfassung Biomarker Entwicklung Nele: Okay, also sie übersetzen quasi Forschung, schauen sich das ganz von Beginn an und skalieren es größer „inwieweit ist das machbar?“. Auf dem Weg fliegen ein paar Kandidaten raus, aber die übriggebliebenen werden irgendwann zur Routineuntersuchung. Uns diese finalen Biomarker kann ich dann bei einem normalen niedergelassenen Arzt erheben, der nicht an der Uniklinik sein muss. Dieser Arzt schickt meine Bioproben in ein Labor, wo sie analysiert werden und erhält eine gute Aussagekraft über meine Krankheit oder Aktivität der MS, oder? Dr. Akgün: Korrekt, ganz genau. Nele: Super. Jetzt würde mich noch das Thema Neurofilament-Leichtketten-Analyse interessieren, weil ich gelesen habe, dass es eine schöne Möglichkeit wäre, dass man irgendwann in Zukunft dann keine Lumbalpunktion mehr braucht. Erklären sie bitte die Neurofilament-Leichtketten Analyse genauer? Wo nehmen sie die Proben dafür? Dr. Akgün: Also wir n unserem Labor, aber auch in Dresden an sich, und diese Meinung teilen viele andere Kollegen weltweit, die sich mit diesem Parameter beschäftigen, sind der Meinung, dass das ein sehr sinnvolles Add-on ist im Monitoring der Patienten. Neurofilamente gehören zum Zytoskelett von Neuronen, die wir im Gehirn und im Rückenmark finden. Wenn diese Neuronen zerstört werden, werden die zytoskelettalen Produkte, also Neurofilamente, freigesetzt. Den Prozess kennt man schon viele Jahre. Man kann das z. B. im Liquor sehr gut messen, weil Patienten eben mit einer neuronalen Zerstörung sehr hohe Werte an diesen freigesetzten Neurofilamenten im Liquor haben. Das weiß man, das hat man auch oft schon diagnostisch gewählt, aber wie sie eben richtig gesagt haben, ist das ein Marker, der sich nicht dafür eignet, regelmäßig erhoben zu werden. Die Entnahme von Nervenwasser ist eine schwierige Konstellation. Neurofilamente zeigen an, wie aktiv die MS ist Bei der MS spielt es deshalb so eine interessante Rolle, weil wir heute wissen, dass dieser Schaden, der über die Neurofilamente angezeigt wird, ein Indiz dafür ist, wie aktiv die Erkrankung gerade ist. Wir können ja die Schübe mit dem Patienten differenzieren, diskutieren, ob da ein klinischer Schub da ist. Wir machen das MRT als Unterstützung, ob neue Läsionen aufgetreten sind, aber wir wissen, dass das seine Detektionsgrenze hat. Und wenn eben noch ein Minischaden da ist, den der Patient nicht einmal merkt, den das MRT auch nicht misst, dann können uns sehr wahrscheinlich die Neurofilamente an dem Punkt unterstützen und anzeigen z. B. „funktioniert die Therapie gut oder sogar richtig gut?“ Und das wollen wir ja eigentlich wissen. Was ist der ELISA? Wie funktioniert er? Die Neurofilamente sind deshalb jetzt wieder in den Fokus gerückt, weil es neue Techniken gibt, die minimalste Mengen an diesen Neurofilamenten messen können und das hat dazu geführt, dass man festgestellt hat „die Dinger sind ja auch im Blut vorhanden“. Die Konzentration ist zwar sehr, sehr viel geringer als im Nervenwasser, aber das korreliert eng. Ich muss sie halt dort nur messen können. Dafür hat man eine Technik genommen, den ELISA, den man auch im Nervenwasser anwendet. Man hat sozusagen Beats verwendet. Beats sind kleine Kügelchen, ähnlich Magnetkugeln – die haben an der Oberfläche einen Antikörper und dieser Antikörper kann das Neurofilament binden. Man kann dann dieses gebundene Neurofilament über Gegenfärbung und Fluoreszenzsignale sichtbar machen, das ist der ELISA. Das Problem beim ELISA ist aber oft, dass das Signal zu schwach ist. Diese Einzelbeats, also das Binden auf diese einzelnen Magnetkügelchen erlaubt, dass die Magnetkügelchen in einem Schritt vor der Messung aufgetrennt werden und das Gerät jedes einzelne Magnetkügelchen abscannt, ob es da ein kleines, gebundenes, gefärbtes Protein, also Neurofilament-Protein findet. Dadurch können sogar einzelne Proteine nachgewiesen werden. Einfach nur die Differenzierung einer seit Jahren etablierten Analysetechnik auf einzelne Magnetbeats, die dann selektiv abgearbeitet werden, erlaubt diese Messgrenze so immens sensitiv zu machen und man kann sozusagen einzelne Sandkörner in zehn Schwimmbecken nachweisen, so genau ist diese Technik. Das ist schon sehr fortgeschritten, sehr automatisiert und auch Durchsatzmedizin. Sprich, man kann viele Proben in kurzer Zeit damit analysieren und daher gibt es hier schon sehr viele, sehr gute Untersuchungen und wir wissen, dass das Neurofilament ein sehr guter Marker ist, um Krankheitsstabilität vs. -aktivität zu differenzieren. Potenziale der Neurofilament-Messung Da rückt dann natürlich in den Fokus, dass man sagt „Mensch, kann ich das nicht nutzen, um mir das Nervenwasser zu sparen und möglicherweise auch MRT?“, obwohl man vorsichtig sagen muss, dass das MRT uns natürlich noch ein bisschen mehr Auskunft gibt. Aber um mal eine Idee aufzuzeigen, wenn ich alle drei Monate zum Neurologen komme, meine Beschwerden berichte, könnte ich bei diesem Besuch meinen Neurofilamentwert mit untersuchen, genauso wie ich den neurologischen Status ermittle. Dann wüsste ich, die aktuelle Behandlung „passt oder passt halt nicht?“. Das ist etwas sehr Neues und sehr Spannendes, wo wir hoffen, dass wir das Patienten in der Zukunft sehr viel häufiger in der Routine anbieten können. Nele: Super. Denn viele MS-Patienten haben Angst vor der Lumbalpunktion. Und beim MRT ist es ähnlich, da brauchen manche Betroffene extra Beruhigungsmedikamente, für die Untersuchung. Und wenn diese Menschen vielleicht nur ins MRT müssen, wenn man sieht „hier gibt es eine stärkere Aktivität“, das wäre für viele eine große Erleichterung. Ich stelle mir das jetzt so vor, finde ich nur ein Korn im großen Wasserbecken, ist alles okay, aber wenn da ein kleines Häufchen Sand ist, bedeutet das leider viel Aktivität und dann muss etwas passieren in irgendeiner Art und Weise. Dr. Akgün: Ganz genau. Nele: Okay, super. Aber das finde ich ganz toll, schöne Sache. Blitzlichtrunde 1. Vervollständigen Sie den Satz: Für mich ist die Multiple Sklerose…? Dr. Akgün: …eine Erkrankung, die aktuell sehr im Fokus der Gesellschaft steht. Das finde ich super, weil es eine Erkrankung ist, die in den Fokus muss. Sie braucht eine extrem große Lobby und Leute, die fordern und wollen und Verbesserungen wollen für die Patienten, damit wir unsere Sache einfach auch besser machen, die, die in der Wissenschaft sind und die, die in der Versorgung sind. Nele: Ja, das ist auf jeden Fall auch meine Wahrnehmung. Da passiert gerade unglaublich viel und zum Glück auch im chronischen Bereich, der in den zurückliegenden Jahren nicht so im Fokus war und in den ja doch viele – zumindest von den älteren Patienten – rutschen bzw. gerutscht sind. Welche Internetseite können Sie zum Thema MS empfehlen? Dr. Akgün: Natürlich unsere Website. Ich glaube halt, dass der Dschungel der Websites oder wo man sich Inhalte runternehmen kann, groß ist. Es ist für Patienten manchmal schwierig zu differenzieren „welchen Informationen kann ich trauen und welche sind für mich als der Typ, der ich bin, wichtig und richtig?“. Wir machen daher die Patientenpodcasts und wollen aufklären. Auf der Webseite findet man den entsprechenden Link. Das ist das, was ich empfehlen kann, und ich finde solche Plattformen einfach toll, wie sie es jetzt haben, weil das echt ist, das ist real und da kann man sich austauschen und das sind verlässliche Informationen und das ist das, was die Patienten brauchen. Nele: Genau, wissenschaftlich fundiert. Ich kann den Patientenpodcast vom MS-Zentrum Dresden auch nur weiterempfehlen. In einer Folge lernt man auch ihr neuroimmunologisches Labor genauer kennen. Dr. Akgün: Also das, was ich gerade gesagt habe, haben wir in dem Patientenpodcast vom Labor mal ein bisschen visualisiert, weil man muss da drin sein. Wir machen das jeden Tag. Deshalb wissen wir, wovon wir reden, aber es ist auch für ärztliche Kollegen oft sehr abstrakt und das war  die Idee in dem Podcast, dem Patienten das mal ein bisschen zu zeigen. Da kann man sich das auch nochmal genauer anschauen, wie das wirklich aussieht und was wir da machen. Das war die Idee von diesem Podcast. Nele: Die Folge muss ich mir in den nächsten Tagen unbedingt noch anschauen. Als Letztes habe ich den Schlafpodcast gesehen, der war auch ganz toll. Für dich da draußen, unbedingt einschalten. Man muss dafür nicht Patient am MS-Zentrum in Dresden sein. Solange du der deutschen Sprache mächtig bist, ist das eine sehr interessante Informationsquelle. Und die Folgen machen Spaß. Welchen Durchbruch wünschen sie sich für die Forschung und Behandlung der MS in den kommenden fünf Jahren? Dr. Akgün: Naja, was ich schon hoffe und da bin ich auch relativ optimistisch, ist, dass sich die individuelle Therapie durchsetzt. Davon bin ich ein Verfechter. Wir reden immer davon, dass MS die Erkrankung mit den tausend Gesichtern ist, was ja impliziert, dass die Patienten alle unterschiedlich sind. Und jeder, der reinkommt, ist unterschiedlich. Das ist er als Mensch und das ist seine Erkrankung auch. Und meine Hoffnung, und daher arbeiten wir auch so kräftig an solchen Sachen, ist, dass Biomarker dabei helfen können zu differenzieren „wen habe ich da vor mir? Was braucht er für eine Therapie? Warum wirkt die Therapie? Warum ist die andere vielleicht nicht so optimal für den Patienten und wie sieht das individuelle Monitoring aus?“. Also dass wir individueller werden, personalisierter und dafür brauchen wir ein paar mehr Werkzeuge, als wir sie heute haben. Aber da tut sich Gott sei Dank sehr, sehr viel. Nele Handwerker: Darauf freue ich mich auch. Das finde ich ganz spannend, was sich da gerade alles regt. An dich da draußen nochmal der Aufruf Wenn du gefragt wirst, an einer Studie teilzunehmen, bitte, bitte mach das. Nur so können Experten, wie Frau Dr. Akgün und alle anderen Forscherinnen und Forscher und Neurologen, uns zunehmend besser helfen. Ich nehme immer an allen Studien teil, lasse mir den Sinn und vorab immer von meinem behandelnden Neurologe, Professor Ziemssen, erklären. Und er erklärt die Studien auch immer super, sodass ich gerne teilnehme, da, wo ich helfen kann. Ich habe zum Glück die MS nicht so schlimm, insofern bin ich nicht für alles qualifiziert, aber ich finde Studien immer sinnvoll und wichtig. Natürlich werden dadurch auch Sackgassen herausgefunden, ganz klar, nicht alles führt zum Erfolg, aber so ist Forschung. Verabschiedung Möchten Sie den Hörerinnen und Hörern noch etwas mit auf dem Weg geben? Dr. Akgün: Ich mache ja auch Sprechstunden, und habe dabei viele Patienten kennengelernt und ich glaube, am Ende ist es wichtig, dass man merkt, und lernt und für sich interpretiert, wer man ist und wo man mit seiner Erkrankung hin will. Wir sind Experten und ich bin ein Verfechter der Schulmedizin, aber am Ende sind das alles Beratungen. Man will den Patienten etwas an die Hand geben, aber man muss sich selbst treu bleiben und ich glaube, das ist das Wichtige. Und dass man objektiven Empfehlungen erstmal zuhört. Was man daraus für sich selber mitnimmt, und dann entscheidet liegt in eigenen Ermessen. So muss man durch das Leben gehen, mit oder ohne Erkrankung. Wie kann man am besten über die Forschung und Ergebnisse des neuroimmunologischen Labors an der Uniklinik Dresden informiert bleiben? Dr. Akgün: Auf der Website vom Zentrum für klinische Neurowissenschaften sind wir als Labor mit verlinkt. Wir werden das jetzt auch etwas aktueller halten. Das ist sozusagen ein Ziel, damit wir das für die Patienten sichtbarer machen, sonst ist es ja immer sehr im Forschungssetting. Wenn man sich da nicht bewegt, bekommt man es sonst nicht mit. Das zum einen und über Podcasts bzw. Patientenveranstaltungen – und das wäre über den Newsletter. Dort geben wir unsere Updates heraus. So wollen wir für die Patienten verständlich vermitteln „was ist jetzt neu? Was ist für mich als Patient relevant von diesen eher wissenschaftlich angehauchten Sachen?“ Und das in regelmäßigen Abständen. Nele: Ein ganz herzliches Dankeschön, Dr. Akgün! Weiter ganz viel Erfolg für sie, ihr Team und natürlich auch die ganzen Teams weltweit, die am Thema Neuroimmunologie arbeiten. Das ist ja auch etwas Schönes, zusammen findet man mehr raus. Dann ihnen eine gute Zeit und viele Grüße nach Dresden. Dr. Akgün: Lieben Dank, Grüße zurück. Bis bald. Tschüss. Nachwort Wie gesagt, mich plagt die MS zum Glück nicht so sehr, toi, toi, toi und mein Medikament wirkt von Anfang an, aber vielleicht ist es bei dir anders, du hast schon mehrere Therapien durch und es wäre ja total schön, wenn man in Zukunft wirklich von Anfang an sehen kann „du bist Typ X“ und man kann dir mit der „Therapie Beta“, helfen. Die wird bei dir anschlagen und zum Erfolg führen und man kann das auch messen, wie gut sie zum Erfolg führt und was man noch anderes machen muss, damit man die MS wirklich so zeitig wie möglich, so gut wie es geht aufhalten, am besten auf Pause-Modus setzen kann und das bis zum Lebensende. Das wäre doch das Schönste. Und vielleicht gehörst du da draußen auch zu den Menschen, die Angst vor MRT-Untersuchungen haben. Dann wäre es natürlich wunderbar, da nur rein zu müssen, wenn es nötig ist. Mich stört das nicht. Ich hatte das nur einmal, da war ich gerade in einer ängstlichen Phase. Ansonsten bin ich psychisch gut gewappnet und gehe ohne Probleme ins MRT. Es ist halt laut, aber ansonsten stört es mich nicht. Da ist ganz viel Tolles im Fluss und nochmal zur Wiederholung die Aufforderung: Wenn es Studien gibt, die dir nicht weh tun, beim Blutabnehmen ist es vielleicht ein kurzer Piks, aber im übertragenen Sinne, dann nimm bitte daran teil. Das hilft dir selber und uns allen. Studien sind sehr wichtig, sie ermöglichen neue Erkenntnisse. Ankündigung Folge 111 Beim nächsten Mal, interviewe ich MS-Patientin Melanie, die bei Instagram auch als @melsworldinpictures“ zu finden ist. Sie wird mir Rede und Antwort stehen zu ihrem Leben mit MS. Bei Melanie spielt die Psyche ein ganz großes Thema, und wirkt sich stark auf ihre MS aus. Ein spannendes Interview mit einer ganz tollen Frau. Einschalten lohnt sich. ++++++++++++++++++++ In diesem Sinne wünsche ich dir alles Gute und komm gesund durch die Erkältungszeit. Tschüss, Nele Mehr Informationen rund um das Thema MS erhältst du in meinem kostenlosen MS-Letter.

Zusammenfassung Die Schizophrenie ist eine der schwerwiegendsten psychiatrischen Erkrankungen mit weit reichenden psychischen und sozialen Auswirkungen auf die betroffenen Patienten und ihre Angehörigen. Die Lebenszeit-Prävalenz beträgt etwa 1%. Die Ergebnisse von Kopplungs- und Assoziationsuntersuchungen zeigen den starken Einfluss einer genetischen Komponente bei der Entstehung der Krankheit. Die bisherigen Forschungsergebnisse weisen darauf hin, dass es sich bei der Schizophrenie um eine genetisch komplexe Erkrankung handelt, deren Ätiologie sich durch das Zusammenwirken von Umweltfaktoren und genetischen Faktoren auszeichnet. Bislang ist es noch nicht gelungen, alle an der Pathogenese beteiligten Faktoren, vor allem aber die Mechanismen ihres Zusammenspiels zu entschlüsseln. Aufgrund von morphologischen und molekularbiologischen Untersuchungen sowie genetischen Kopplungs- und Assoziationsstudien fand sich eine Reihe von Suszibilitätsgenen für Schizophrenie, darunter auch das Gen DTNBP1. Es ist auf dem Chromosom 6 in der Region 22.3 lokalisiert und kodiert für das Protein Dysbindin-1. Im Gehirn nimmt dieses Protein Einfluss auf das Zytoskelett und die synaptische Plastizität und ist an der Signaltransduktion von Neuronen über NMDA- und GABA-Rezeptoren und damit am Glutamat- und Dopaminstoffwechsel beteiligt (Benson et al. 2001; Harrison und Weinberger, 2005). Morphologische Untersuchungen zeigen, dass die Konzentration von Dysbindin-1 in wichtigen Bereichen des Gehirns bei schizophrenen Patienten vermindert ist (Talbot et al. 2004; Tang et al. 2009). Eine Reihe von Assoziationsstudien, teils auch familienbasiert, haben in unabhängigen Kollektiven mit verschiedenstem ethnischen Hintergrund signifikante Assoziationssignale an unterschiedlichen Varianten im DTNBP1-Gen gefunden (Straub et al. 2002b; van den Oord et al. 2003; Schwab et al. 2003; Morris et al. 2003; van den Bogaert et al. 2003;, Tang et al. 2003; Kirov et al. 2004; Williams et al. 2004; Numakawa et al. 2004; Funke et al. 2004; de Luca et al. 2005; Duan et al. 2007; Riley et al. 2009 und Voisey et al. 2010). Dabei handelte es sich teilweise um Einzelbasen-Polymorphismen oder Haplotypen im DTNBP1-Gen, die sich als signifikant mit Schizophrenie assoziiert gezeigt haben. Folgestudien konnten diese Ergebnisse oftmals aber nicht bestätigen (Turunen et al. 2006, Datta et al. 2007, Joo et al. 2007, Holliday et al. 2006, Peters et al. 2008, Sanders et al. 2008; Strohmaier et al. 2010). In der vorliegenden Arbeit wurden die sechs Einzelbasenpolymorphismen, rs3213207, rs2619538, rs1011313, rs1047631, rs2056943 und rs2619522 untersucht. Bei ihnen hatten sich in Studien zuvor teilweise deutliche Assoziationsbefunde gezeigt. Die Marker wurden hier erneut an einem unabhängigen kaukasischen Kollektiv von 503 Patienten und 1290 gesunden Kontrollpersonen untersucht. Zustätzlich wurde die Patientengruppe in vier verschiedene Kategorien unterteilt, je nachdem ob Angehörige mit psychischen Störungen, mit Schizophrenie oder Angehörige 1.Grades mit Schizophrenie in der Familienanamnese vorlagen, sowie als vierte Gruppe das Patientenkollektiv insgesamt. Dabei zeigten sich in den unterschiedlichen Patientengruppen signifikante Assoziationshinweise und Trends zur Assoziation bei den Markern rs3213207 und rs2619538, der Marker rs1011313 zeigte lediglich Trends zur Assoziation mit Schizophrenie. Die höchste Signifikanz erreichte mit einem p-Wert von 0,034 der Marker rs3213207 in der Gruppe der Patienten mit schizophrenen Angehörigen. Hier trat der heterozygote Genotyp A/G signifikant häufiger bei Patienten auf als die homozygoten Genotypen A/A und G/G. Ebenfalls Signifikanzniveau erreichte der Marker rs2619538. Dabei zeigte sich in der Gruppe der Patienten mit schizophrenen Angehörigen ersten Grades ein signifikant niedrigerer Anteil homozygoter Träger des selteneren Allels Adenin bei einem p-Wert von 0,044. Die Marker rs1047631, rs2056943 und rs2619522 zeigten in dieser Arbeit keine Hinweise auf Assoziation mit Schizophrenie. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit und der anderer Forschungsgruppen besteht weiterhin Grund zur Annahme, dass es sich bei DTNBP1 um ein Suszeptibilitäts-Gen für Schizophrenie handelt. Zwar konnten auch in dieser Arbeit die positiven Assoziationsergebnisse von Vorläuferstudien nicht in vollem Umfang repliziert werden, jedoch stützen die Ergebnisse die Annahme, dass Variationen im DTNBP1-Gen an der Pathogenese der Schizophrenie beteiligt sind. Dabei weisen die Ergebnisse in dieser Arbeit durchaus darauf hin, dass es einen Zusammenhang gibt zwischen positiver Familienanamnese in Bezug auf Schizophrenie und genetischen Variationen im DTNBP1-Gen. Gründe für die Inkonsistenz in den Ergebnissen der bisherigen Untersuchungen könnten die abweichenden Stichprobengrößen sowie die unterschiedliche ethnische Herkunft der untersuchten Kollektive sein. Auch die Einschlusskriterien für die Patienten- und Kontrollgruppen wichen voneinander ab. Vermutlich aber ist eine der Hauptursachen auch die genetische und phänotypische Heterogenität der Erkrankung an Schizophrenie. Weitere Studien mit höheren Fallzahlen werden nötig sein, um die genetischen Risikomarker auf dem DTNBP1-Gen und ihr mögliches Zusammenspiel mit Markern auf anderen Genen genauer zu detektieren.

Im komplexen System der Funktionsweise von Thrombozyten werden auch dem Cholesterin der thrombozytären Zellmembran verschiedenste Funktionen zugeschrieben. Es hält die Zelle als wichtiger Membranbestandteil flexibel und beweglich und reichert sich bevorzugt in lipid rafts an. Durch die Anreicherung in diesen cholesterinreichen Domänen nimmt es Einfluss auf das clustering bestimmter Membranrezeptoren oder auf die transmembranöse Signalvermittlung und trägt auf diese Weise wesentlich zur Organisation und Funktionalität der Zellmembran bei. Dass der Cholesteringehalt der Zellmembran auch Einfluss auf die Bildung von Mikropartikeln hat, konnte in dieser Arbeit erstmals nachgewiesen werden. Die Cholesterinbeladung führte zu einem höheren Anstieg der Mikropartikelanzahl als die Cholesterindepletion der Thrombozytenmembran. Durch die zusätzliche Einwirkung von Scherkräften im Kegel-Platten-Viskosimeter konnte die rein passive Generierung von Mikropartikeln noch erhöht werden. Hier waren die meisten Mirkopartikel ebenfalls in der Gruppe der cholesterinbeladenen Thrombozyten zu finden. Im TDT-Test spiegelte sich die höhere Anzahl von Mirkopartikeln in der Gruppe der cholesterinbeladenen Thrombozyten in einer verkürzten Gerinnungszeit gegenüber den cholesterindepletierten Plättchen wider. Insgesamt zeigte sich die Thrombingenerierung durch Veränderung des Cholesteringehaltes der Plättchenmembranen jedoch verlangsamt. Während eines Flussversuchs über VWFdA1 bildeten mit Cholesterin beladene Thrombozyten bei einer Scherrate von 10.000s-1 durchschnittlich längere tether aus als cholesterindepletierte Thrombozyten. Dies spricht dafür, dass der Cholesteringehalt die Flexibilität der Thrombozytenmembran insgesamt beeinflusst und damit auch die Adhäsion zum Zytoskelett, so wie es bereits für andere Zelltypen beschrieben wurde. Cholesterinbeladene Thrombozyten exprimierten im ruhenden Zustand mehr P-Selektin als cholesterindepletierte Thrombozyten. Während die P-Selektin-Expression der cholesterindepletierten Plättchen durch das Einwirken von Scherkräften deutlich gesteigert wurde, kam es bei den cholesterinbeladenen Thrombozyten zu keinem weiteren Anstieg. Dies deutet auf eine gestörte Degranulation der Thrombozyten durch Cholesterinbeladung hin, bzw. auf eine „Aktivierung“ der Thrombozyten trotz Blockierung der klassischen Aktivierungskaskaden. Ob die bei uns unter experimentellen Bedingungen in vitro beobachteten Phänomene auch die generell erhöhte Aktivität der Thrombozyten von Patienten mit Hypercholesterinämie, sowie die bei dieser Erkrankung bestehende erhöhte Anzahl von Mirkopartikeln erklären kann müssen weitere Studien klären.

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

Epithelzellen, die Modell-Zelllinien dieser Dissertation, sind für die Aufteilung und Abtrennung verschiedener Kompartimente eines Organismus zuständig, indem sie sich zu Grenzflächen zusammenschliessen, welche häufig hohen physikalischen Spannungen und Kräften ausgesetzt sind. Um diese physikalischen Kräfte zu verarbeiten oder sie selbst zu produzieren, verwenden Epithelzellen, wie alle anderen Zelltypen auch, das Zytoskelett, das sich im Allgemeinen aus den Komponenten Mikrotubuli, Intermediär-Filamenten und Aktin sowie den damit korrespondierenden Motorproteinen Dynein, Kinesin sowie Myosin zusammensetzt. In dieser Dissertation wird das Zusammenspiel von Aktin und Myosin auf der apikalen Seite von Epithelzellen untersucht. Im Falle von konfluenten Zellen mit vollständig ausgebildeten Zell-Zell-Kontakten sind auf der apikalen Seite der Zellen Mikrovilli zu finden, kleine, mit Aktin-Bündeln gefüllte Ausstülpungen aus der Zelloberfläche, welche für die optimierte Nahrungsaufnahme sowie als Antennen für Signalverarbeitung zuständig sind. Im Zuge der Arbeit konnten wir feststellen, dass sich der Aktin-Myosin-Aufbau auf der apikalen Seite von Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte, sogenannten nicht-konfluenten Zellen, grundsätzlich ändert. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und anderen experimentellen Methoden zeigen wir, dass zwar ähnliche Ausstülpungen auf der apikalen Oberfläche von Einzelzellen zu finden, diese jedoch häufig verlängert, gebogen, hoch-dynamisch und oft parallel zur Zellmembran orientiert sind. Wir zeigen mittels molekularbiologischer Methoden, dass ein zusätzliches, innerhalb der apikalen Zellmembran liegendes isotropes Akto-Myosin-Netzwerk für die dynamische Reorganisation der Mikrovilli-Ausstülpungen verantwortlich ist. Der Identifzierung des isotropen Akto-Myosin-Netzwerkes, welches eine der Hauptaussagen dieser Dissertation ist, wird eine detaillierte Analyse der dynamischen Netzwerkreorganisation angefügt, die mittels temporaler und örtlicher Bild-Korrelationsanalysen charakteristische Zeiten und Längen der Dynamik definiert. Des Weiteren entwickeln wir mehrere Bild- Analyseverfahren, allen voran die Methode der iterativen temporalen Bildkorellation sowie des optischen Flusses, wodurch wir eine Oszillation der Netzwerk-Reorganisationsgeschwindigkeit identifizieren und parametrisieren können. Verschiedene, auf Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter optischer Fluss-Bildanalyse basierende Experimente geben Hinweise auf zwei mögliche Erklärungen für die identifizierten Oszillationen. Sowohl Myosin aktivitätsregulierende Proteine als auch spontan auftretende Spannungsfluktuationen im unter Zugspannung liegenden Netzwerk können mögliche Ursachen für die identifizierten Netzwerkoszillationen sein. Obwohl eine eindeutige zelluläre Funktion des apikalen Akto-Myosin-Netzwerkes im Rahmen dieser Doktorarbeit noch nicht identifiziert werden konnte, so können wir aufgrund von verschiedenen Resultaten dennoch postulieren, dass das hier identifizierte Netzwerk eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und Signaltransduktion einnimmt. Unabhängig davon repräsentiert das hier gefundene Netzwerk die faszinierende Möglichkeit, ein aktives, zweidimensionales Akto-Myosin-Netzwerk nicht nur in vitro, sondern in seiner natürlichen Umgebung studieren und biophysikalische Eigenschaften analysieren zu können.

Meine Arbeit befasst sich mit der histologischen, histochemischen und elektronenmikroskopischen Analyse des Eileiters des Straußes (Struthio camelus). Als Untersuchungsmaterial dienten die Eileiter von acht geschlechtsreifen und zwei nicht geschlechtsreifen Blauhals-Schwarzhals-Hybriden aus der Straußenfarm Donaumoos in Leipheim. Die Histomorphologie wurde mittels konventioneller Färbungen (H.E.-Färbung, van Gieson-Resorcinfuchsin-Färbung, Trichromfärbung nach Masson und Goldner, Alcianblau 8GX-Färbung, Perjodsäure-Schiff-Reaktion) dargestellt. Glykohistochemisch wurden durch den Einsatz von Lektinen die Kohlenhydratstrukturen untersucht. Mittels immunhistochemischer Techniken wurde das Zytoskelett sowie die Verteilung von Östrogen- und Progesteronrezeptoren im Straußeneileiter studiert. Unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops konnte die Ultrastruktur ermittelt werden. Der Eileiter kann in die fünf Abschnitte Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und Vagina unterteilt werden. Das Epithel der untersuchten Tiere war im gesamten Eileiter ein mehrreihiges, hochprismatisches Epithel, welches sich aus Zilienzellen und sekretorischen Zellen zusammensetzt. In der Lamina propria mucosae finden sich charakteristische Drüsen im kaudalen Infundibulum, Magnum, Isthmus, Uterus und im uterovaginalen Übergangsbereich. Die Alcianblau-Färbung zeigt sich für pH 2,5 und pH 1,0 positiv im Oberflächenepithel des Infundibulums und Magnums der geschlechtsreifen Strauße und im Oberflächenepithel von Uterus und Vagina sowohl der adulten als auch der juvenilen Tiere. In der Vagina sind es vorrangig die Epithelzellen am Boden von Schleimhauteinstülpungen, die Alcianblau-positiv erscheinen. Die PAS-Reaktion fällt bei den adulten Straußen im Epithel des Infundibulums, und in Epithel und Drüsen sowohl des Magnums als auch des Isthmus positiv aus. Geschlechtsreife und nicht geschlechtsreife Laufvögel weisen eine positive PAS-Reaktion im Oberflächenepithel von Uterus und Vagina auf. Durch die Trichromfärbung konnten Mukosubstanzen zum einen im Epithel des tubulären Infundibulums und des Uterus, zum anderen in den Magnum- und Isthmusdrüsen der adulten Tiere festgestellt werden. Das Vaginalepithel zeigt sich bei geschlechtsreifen und nicht geschlechtsreifen Tieren positiv für Mukosubstanzen. Mittels glykohistochemischer Untersuchungen wurden die Zuckerstrukturen auf den Zellen des Eileiters nachgewiesen. Es wurden sowohl FITC-konjugierte als auch biotinylierte Lektine verwendet. Für die Durchführung der Analysen mit FITC-konjugierten Lektinen kamen Canavalia ensiformis Agglutinin (ConA), Pisum sativum Agglutinin (PSA), Lens culinaris Agglutinin (LCA), Ricinus communis Agglutinin (RCA), Peanut Agglutinin (PNA), Griffonia simplicifolia Lektin I (GSL-I), Dolichos biflorus Agglutinin (DBA), Soybean Agglutinin (SBA), Wheat germ Agglutinin (WGA), succinyliertes Wheat germ Agglutinin (WGAs), Ulex europaeus Agglutinin I (UEA-I), Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (PHA-E) und Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (PHA-L) zum Einsatz. Als biotinylierte Lektine wurden Viscum album Agglutinin (VAA), Sophora japonica Agglutinin (SJA), Sambucus nigra Agglutinin (SNA), und Maackia amurensis Agglutinin I (MAA-I) verwendet. Im Eileiter des Straußes konnte die Bindung von ConA, LCA, PSA, VAA, SJA, SNA, WGA, WGAs, MAA-I, PHA-E und PHA-L festgestellt werden. Lediglich schwach binden RCA und DBA. Keine Bindung konnte für die Lektine PNA, GSL-I, SBA und UEA-I ermittelt werden. Anhand immunhistochemischer Methoden wurden zytoskelettale Elemente sowie Hormonrezeptoren im Eileiter des Straußes untersucht. Hierbei wurde mittels spezifischer Antikörper die Lokalisation von Tubulin, Vimentin, Panzytokeratin, Zytokeratin (CK) 5, CK 14, CK 18, CK 19, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), non-muscle myosin (NMM), Östrogenrezeptor alpha (ER-α) und Progesteronrezeptor (PR) bestimmt. CK 19 konnte hierbei lediglich im Vaginalepithel festgestellt werden. ER-α zeigt sich ausschließlich in den Uterindrüsen der geschlechtsreifen Strauße immunpositiv. Für CK 7 und CK 8 konnten keine immunpositiven Strukturen im Eileiter ermittelt werden.

Das Zytoskelett durchzieht als dicht verästeltes Netzwerk die Zelle und bestimmt deren Form und mechanische Festigkeit. Mit seiner Hilfe können sich Zellen teilen, Material aufnehmen und auf externe Einflüsse reagieren. Darüber hinaus dient es zum Transport von zellulären Strukturen wie Vesikeln und Mitochondrien. An der LMU forschen über dieses Zellskelett die Labore von Professor Michael Schleicher und Professor Manfred Schliwa, beide vom Adolf-Butenandt-Institut. Sie sind Teil des interdisziplinären Sonderforschungsbereichs „Dynamik und Regulation Zytoskelettabhängiger Bewegungsvorgänge“.

Diffusive Transportprozesse auf der Nanometerskala spielen eine entscheidende Rolle für das Verständnis von kolloidalen Systemen jeglicher Art — in Anwendungen aus der Biologie sind sie gar von lebenswichtiger Bedeutung. In dieser Dissertation untersuche ich die Diffusion von Makromolekülen in verschiedenen Umgebungen anhand von drei typischen Modellszenarien. Der zentrale Teil dieser Arbeit beschäftigt sichmit der Dynamik in Suspensionen dünner Stäbchen, wobei die Stabformeine Idealisierung anisotroper, länglicher Teilchen mikroskopischerGröße darstellt. Ein vereinfachtes Modell wird ausgearbeitet, welches das Problem auf die Bewegung eines einzelnen Stäbchens in einem zweidimensionalen Parcours von punktförmigen Hindernissen reduziert. Ich untersuche dieses Modell auf zweierlei Art: Zum einen habe ich Molekulardynamik- Simulationen entwickelt, die die Brownsche Bewegung des Stäbchens über neun Größenordnungen in der Zeit berechnen. Experimentell relevante Observablen werden dabei in statistisch exzellenter Qualität erfasst, u.a. die intermediäre Streufunktion. Zum Zweiten formuliere ich eine analytische Beschreibung dieser Dynamik auf mesoskopischer Skala, basierend auf der Smoluchowski-Perrin-Gleichung der freienDiffusion. Erstmals präsentiere ich hierzu die geschlossene Lösung dieser Gleichung in zwei Dimensionen und zeige, dass man mithilfe der Messung zweier Diffusionskoeffizienten eine quantitative mesoskopische Theorie für Systeme mit Hindernissen gewinnt. Der Vergleich der Simulationen mit der Theorie ermöglicht ein fundiertes quantitatives Verständnis der Dynamik in Suspensionen von Stäbchen, gekennzeichnet durch mehrere Zeit- und Längenskalen. Ich belege, dass die effektive Theorie bis hinab zu Längenskalen von der Größe des mittleren Teilchenabstands gültig ist und untermauere die bisher nicht verlässlich gestützten skalentheoretischen Vorhersagen von Doi und Edwards. Schließlich finde und erkläre ich ein intermediäres Potenzgesetz in den Streufunktionen. Dies interpretiere ich als ein neues generisches Charakteristikumder anisotopen Dynamik von Stäbchen in ungeordneten Suspensionen mit starker gegenseitiger räumliche Einschränkung. In Ergänzung dieses Themenkomplexes beschäftigt sich der erste Teil der vorliegenden Arbeit mit dem diffusiven Transport in heterogenen Umgebungen fraktaler Geometrie—eine Fragestellung, die für dieDynamik beispielsweise in porösenMedien und in der sehr heterogen zusammengesetzten biologischen Zelle relevant ist. Im Rahmen des Lorentz-Modells bilde ich dieses Transportproblem ab auf die Diffusion eines einzelnen, isotropen Teilchens im Leerraum zwischen zufällig angeordneten harten Kugeln. Ich präsentiere umfangreiche Computersimulationen zusammen mit einer detaillierten Skalenanalyse der kritischen Dynamik in der Nähe des Perkolationsübergangs. In unmittelbarer Nähe des kritischen Punktes beobachte ich anomale Diffusion über vier Größenordnungen in der Zeit. Diese herausragende Genauigkeit ermöglicht die Darstellung der universellen dynamischen Skalenfunktion im sehr langsam konvergierenden Übergang zum anomalen Bewegungsgesetz, unter Einbeziehung universeller Korrekturen des Potenzverhaltens. Der letzte Teil der Arbeit ist der Dynamik einzelner semiflexibler Filamente gewidmet, die z.B. im Zytoskelett der Zelle essentielle mechanische Aufgaben erfüllen. Die Bewegungsgleichung eines solchen Polymers in strömenden Flüssigkeiten drücke ich durch die Dynamik der Eigenmoden aus, unter Berücksichtigung der Zwangsbedingung longitudinaler Steifigkeit. Eine darauf aufbauende Analyse der Rotation eines Polymers in Scheerströmungen beleuchtet das charakteristische Verhalten der Modenspektren. Zusammenfassend vertiefen meine Ergebnisse fundamental das Verständnis dynamischer Prozesse bei der Diffusion von Makromolekülen, mit konkreten Vorhersagen für auch experimentell messbare Größen. Besonders zu nennen ist hier die Streufunktion einer Suspension von Stäbchen, deren intermediäres Potenzverhalten ich als ein universelles Merkmal der Reptationsbewegung von Stäbchen ansehe.

Die Pathogenität von enteropathogenen Yersinien-Spezies wird von einem Virulenzplasmid pYV kodiert. Das pYV kodiert für den Typ-III-Sekretions-/Translokationsapparat und die Yops. Sechs Yop-Effektorproteine sind bekannt, die in die eukaryote Zelle transloziert werden: YopE, YopH, YopM,YopO/ YpkA, YopP/ YopJ und YopT. Die intrazellulären Angriffspunkte und Wirkungen der einzelnen Yops auf die Zielzelle sind Gegenstand aktueller Forschung. In dieser Arbeit wurden erstmals systematisch potentielle Zytoskelettveränderungen von Thrombozyten durch Inkubation mit Yersinia-Monosekretionsmutanten YopH, YopE, YopO, YopP, YopM und den Yersinia-Monodeletionsmutanten DeltaYopH, DeltaYopE, DeltaYopT, DeltaYopO und DeltaYopM untersucht. Im zeitlichen Verlauf adhärieren uninfizierte Thrombozyten durch eine Zunahme der Fläche durch Ausbildung von Filopodien und Lamellipodien. In den durchgeführten Experimenten ähneln die mit der YopP-Monosekretionsmutante inkubierten Thrombozyten uninfizierten Thrombozyten, d.h. YopP zeigt als Einziges der untersuchtes Yops keinen Einfluss auf das Zytoskelett. Mit der YopH, YopM, YopE bzw. YopO-Monosekretionsmutante inkubierte Thrombozyten zeigen kleinere Zellflächen und eine Dominanz von abgerundeten Zellen. Dies deutet auf eine schlechtere Adhäsion der Zellen an der extrazellulären Matrix hin. In mit WA-C(pTRANS,pCJYM-HA) infizierten HeLa-Zellen konnte YopM zunächst im Zytosol, nach 2-4h Infektion zusätzlich im Zellkern lokalisiert werden. Ausserdem zeigten mit WAC(pTRANS,pCJYM-HA) infizierte HeLa-Zellen Zytoskelettveränderungen: ein ungeordnetes Zytoskelett mit Vakuolen, vereinbar mit einer Ablösung der Zelle von der Matrix. Kaya et al. konnten im Affinitätsblot in vitro eine Interaktion von YopM mit der intrazellulären Cystein-Protease Calpain zeigen. Wegen der morphologischen Ähnlichkeit zwischen mit WA-C(pTRANS,pCJYM) inkubierten bzw. mit Calpeptin, einem Calpain-Inhibitor, inkubierten Thrombozyten wurde die von Kaya et al. dargestellte Interaktion zwischen YopM und Calpain in vivo in dieser Arbeit überprüft. Die Präzipitationsversuche aus infizierten HeLa-Zellen über Calpain sowie über YopM ergaben keinen Hinweis auf eine Interaktion von YopM und Calpain. McDonald et al. publizierten RSK 1 und PRK 2 als intrazelluläre Interaktionspartner von YopM. Funktionelle Studien über die Proteine RSK 1 und PRK 2 lassen darauf schließen, dass sie regulierende Einflüsse auf das Zytoskelett, die Translation und das Zellüberleben haben. Diese Funktionen und die beobachteten Einflüsse von YopM auf das Zytoskelett der Zielzelle sind mit einem Modell vereinbar, in dem YopM die Zytoskelettveränderungen durch Interaktion mit RSK 1 und PRK 2 hervorrufen könnte. Diese Hypothese muss durch zukünftige Forschungen geklärt werden.

Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern. So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt. Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing"). Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden. Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.

Die Kraftspektroskopie hat sich als eine moderne Methode zur Untersuchung der Elastizität und Entfaltung einzelner Proteine etabliert. Kraftspektroskopische Experimente zeichnen sich unter anderem dadurch aus, dass die Entfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde die Kraftspektroskopie zur Analyse der Elastizität und der Entfaltungskinetik einzelner Zytoskelett-Proteine verwendet. Die untersuchten Moleküle, die Superhelix-Struktur des Myosin Schwanzes und das Aktin-bindende Protein Filamin (ddFLN) repräsentieren dabei zwei wichtige Strukturmotive der Proteinfaltung. Die Messungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, ein detailliertes Verständnis hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der Struktur der Proteine und deren mechanischen Eigenschaften zu gewinnen. Der Anwendungsbereich der Methode konnte mit Hilfe eines neu entwickelten Messprotokolls erweitert werden. So wurde in Rückfaltungsexperimenten neben der Entfaltungskinetik auch die Rückfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt. Die kraftspektroskopische Untersuchung des Schwanzes des Muskelmotor-Proteins Myosin II zeigte, dass das Molekül über elastische Dehnungseigenschaften verfügt. Die Superhelix-Struktur des Schwanzes weist ein charakteristisches Kraftdehnungsverhalten auf, das bei Dehnung und Entspannung des Moleküls reversibel ist. Das Kraftdehnungsverhalten der Superhelix konnte erfolgreich durch ein Zwei-Zustands-Modell analytisch beschrieben werden. Das Modell beruht auf der Annahme, dass einzelne Segmente der Helix entweder einen gefalteten oder entfalteten Zustand einnehmen. Ferner liegt dem Modell zugrunde, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht beim Übergang zwischen den Zuständen besteht. In den Experimenten mit dem Aktin-bindenden Protein ddFLN wurden die Entfaltungskräfte der Immunoglobulindomänen sowie die mechanische Stabilität der Dimerbindung des inelastischen Moleküls bestimmt. Es zeigte sich, dass die Dimerbindung im Vergleich zu den benachbarten Domänen von ddFLN über eine größere mechanische Stabilität verfügt. Experimente mit verschiedenen Konstrukten des Moleküls zeigten außerdem, dass die Entfaltung einer der ddFLN-Domänen, nämlich Domäne 4 (ddFLN4), über einen stabilen Zwischenzustand erfolgt. Auf Basis der NMR-Struktur und der kraftspektroskopischen Daten verschiedener Mutationen von ddFLN4 wurde eine Analyse der Primärstruktur dieses Zwischenzustandes vorgenommen. Demnach entfalten im ersten Entfaltungsschritt 50 Aminosäuren, währenddessen die restlichen 50 Aminosäuren von ddFLN4 den stabilen Zwischenzustand bilden. Wiederholtes Dehnen und Entspannen von ddFLN ergab, dass es sich bei dem Entfaltungszwischenzustand von ddFLN4 ebenfalls um einen Faltungszwischenzustand handelt. Die Analyse der Rückfaltungsereignisse führte zu dem Ergebnis, dass die Rückfaltung von ddFLN4 nur durch ein kinetisches Drei-Zustands-Modell mit einem obligaten Zwischenzustand beschrieben werden kann. Der Zwischenzustand stellt also einen „on-pathway“ Zwischenzustand dar, der von ddFLN4 zuerst eingenommen wird, bevor die Domäne in ihre native Struktur übergeht. Die quantitative Bestimmung der Faltungskinetik von ddFLN4 erfolgte durch Anpassung des Modells an die Daten. Der Vergleich der Faltungskinetik von ddFLN4 und allen anderen Domänen von ddFLN führte zu dem Ergebnis, dass ddFLN4 mit Zwischenzustand eine ca. 10fach schnellere Faltung aufweist, obwohl alle Domänen eine homologe Struktur besitzen. Domäne ddFLN4 stellt demnach ein Beispiel dar, inwiefern ein Faltungszwischenzustand zu einer substantiellen Beschleunigung der Faltung führen kann.

Vererbung und intrazelluläre Positionierung von Mitochondrien werden in eukaryotischen Zellen durch verschiedenartige Zytoskelett-abhängige molekulare Maschinerien vermittelt. Dabei spielen insbesondere Mikrotubuli eine herausragende Rolle in Säugetierzellen und in einigen Pilzen. Außer einzelnen Motorproteinen, welche an der Interaktion von Mitochondrien mit Mikrotubuli in Säugerzellen beteiligt sind, sind keine weiteren die Interaktion vermittelnden Komponenten bekannt. Ziel der Arbeit war, in dem filamentösen Pilz Neurospora crassa als Modellorganismus Proteine zu identifizieren, die an der Interaktion von Mitochondrien mit Mikrotubuli beteiligt sind und diese zu charakterisieren. Zuerst sollte die biochemische Grundlage der Wechselwirkung zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli durch Entwicklung und Einsatz von in vitro-Testsystemen aufgeklärt werden. Hierfür wurde ein biochemisches Testsystem entwickelt, in dem isolierte Mitochondrien mit Taxol-stabilisierten Mikrotubuli unter verschiedenen Bedingungen inkubiert werden, um nach Saccharosegradienten-Zentrifugation die Assoziation zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli zu analysieren. Zusätzlich sollten die Ergebnisse dieser Versuche in einem fluoreszenzmikroskopischen Testsystem verifiziert werden. Dafür wurde die Expression von mitochondrial zielgesteuertem GFP in N. crassa etabliert. Auf diese Weise konnte nicht nur das Verhalten und die Morphologie von Mitochondrien in verschiedenen Stadien des Lebenszyklusses in vivo beobachtet werden, sondern isolierte GFP-gefärbte Mitochondrien konnten zudem für eine mikroskopische Interaktionsanalyse mit Rhodamin-gefärbten Mikrotubuli verwendet werden. Unter Einsatz der beiden Testsysteme wurde eine spezifische ATP-abhängige Interaktion zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli nachgewiesen, die durch peripher mit der mitochondrialen Außenmembran assoziierte Proteine vermittelt wird. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Beteiligung von Motorproteinen an der Assoziation von Mitochondrien mit Mikrotubuli hin. Deshalb wurde im Genom von N. crassa gezielt nach Sequenzen gesucht, die Kinesine kodieren, die diese Rolle übernehmen könnten. Es wurden zwei neue Mitglieder der Unc104-Kinesinfamilie identifiziert und im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert. Eines dieser Kinesine, Nkin2, ist peripher mit der Außenmembran von Mitochondrien assoziiert. Unter Verwendung der in vitro-Testsysteme wurde die Beteiligung von Nkin2 am Transport von Mitochondrien im Wildtyp belegt. Die Interaktion der Mitochondrien mit Mikrotubuli in vitro kann durch eine Präinkubation von Zusammenfassung Mitochondrien mit Antikörpern gegen Nkin2 geblockt werden. Um die Funktion von Nkin2 im Mitochondrientransport in vivo zu untersuchen, wurden nkin2-Deletionsmutanten erstellt und funktionell charakterisiert.Die Deletion von Nkin2 führt in vivo zu einem eingeschränkten Mitochondrientransport in auswachsenden Hyphen. Dieser Phänotyp wird durch Überexpression des zweiten neu identifizierten Mitglieds der Unc104-Familie, Nkin3, komplementiert. Zwar ist Nkin3 im Wildtypstamm nicht auf Mitochondrien lokalisiert, es wird aber bei Abwesenheit von Nkin2 hochreguliert und spezifisch an die Mitochondrien rekrutiert.In Abwesenheit von Nkin2 ist Nkin3 essenziell für die Interaktion in vitro von Mitochondrien mit Mikrotubuli. Diese Ergebnisse deuten auf eine funktionelle Redundanz von verschiedenen Motorproteinen im Mitochondrientransport in N. crassa hin, die in ähnlicher Weise auch in Säugerzellen vorliegen könnte. Da Transport und Vererbung von Mitochondrien nicht nur von dem beteiligten Motorprotein abhängen, sondern auch mit Fusions- und Teilungsvorgängen der mitochondrialen Membranen verknüpft sind, wurde eine Stammsammlung von Deletionsmutanten nichtessenzieller Gene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nach Komponenten mit einer Funktion in der Morphogenese von Mitochondrien durchmustert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Gene identifiziert. Die aus der Deletion dieser Gene resultierenden Phänotypen werden beschrieben.

Der Tonus der glatten Muskulatur wird einerseits direkt durch Aktivierung des kontraktilen Apparates und andererseits über Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration gesteuert. NO freisetzende Pharmaka aktivieren die lösliche Guanylylzyklase und führen über den cGMP/cGMP-Kinase abhängigen Signalweg zur Erschlaffung der glatten Muskulatur. Wie die Kinase dieses Signal vermittelt ist noch weitgehend unklar, wobei schon einige Substrate der cGMP-Kinase I bekannt sind. In der Mikrosomenfraktion glatter Muskeln wurde ein stabiler Komplex der cGMP-Kinase I und ihrer Substrate IRAG und IP3-Rezeptor Typ I beschrieben, der für die Steuerung des Calciumausstroms aus Speichern des sarkoplasmatischen Retikulums verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit sollte dieser mikrosomale Komplex genauer untersucht und die beteiligten Proteine gereinigt und charakterisiert werden. Dies geschah vor allem durch Co- Immunpräzipitationen mit spezifischen Antikörpern und Affinitätschromatographie mit cGMP-Agarose. Die Identifizierung der gereinigten Proteine erfolgte durch MALDI-TOF Analyse und Immunoblot, wobei Substrate der Kinase nach cGMP-abhängiger Phosphorylierung mit radioaktiv markiertem ATP detektiert wurden. Der Komplex wurde aus dem glatten Muskel der Trachea von Rindern aufgereinigt und seine Bestandteile isoliert. Dabei ergab sich die Assoziation von Phospholamban, einem Substrat der cGMP-Kinase, das den Calcium Rücktransport durch die Ca2+-ATPase in Speichervesikel des sarkoplasmatischen Retikulums moduliert. Die Interaktion von Phospholamban mit der cGMP-Kinase I β und dem IP3-Rezeptor Typ I konnte nach heterologer Expression der Komponenten in COS 7 Zellen bestätigt werden. Dazu wurde Phospholamban aus cDNA des Herzens der Maus kloniert und mit je einer der beiden Isoformen der cGMP-Kinase I α und β, dem IP3-Rezeptor Typ I und IRAG in COS 7 Zellen exprimiert. Weiterhin konnte die Assoziation des Komplexes an die zytoskelettalen Proteine α-Aktin und Calponin H1 gezeigt werden. Das Zytoskelett kann einerseits zur Stabilisierung des Komplexes im glatten Muskel beitragen. Andererseits kann der Komplex Membranproteine mitdem Zytoskelett verbinden und einen direkten Einfluss auf die Calcium unabhängige Kontraktion der Zelle haben. Als einzige Funktion von Phospholamban ist bisher die Regulation der Ca2+-ATPase beschrieben worden, daher wurde deren Assoziation an den funktionellen Komplex untersucht. Dazu wurde der Komplex an cGMP-Agarose gereinigt und nach Elution eine Co-Immunpräzipitation mit den spezifischen Antikörpern der Komplexbestandteile durchgeführt. Die differenzierte Auftrennung über zwei Säulen deckte die Existenz zweier Proteinkomplexe auf, die über das Zytoskelett miteinander verbunden sind. Einer besteht aus Phospholamban und der Ca2+-ATPase und steuert die Aufnahme von Calcium in intrazelluläre Speicher, der andere enthält einen geringeren Teil Phospholamban, die cGMP-Kinase I β und ihre Substrate IRAG und den IP3-Rezeptor Typ I. Dieser zweite Komplex reguliert wahrscheinlich den Calciumausstrom aus dem sarkoplasmatischen Retikulum.

A large number of actin-binding proteins regulates the dynamics of the actin cytoskeleton. Here we report the identification and characterization of two new proteins in Dictyostelium discoideum: the novel cytoskeleton protein villidin and a third profilin isoform. One goal of the project was to analyze the features of the villidin sequence in detail and to investigate the protein by molecular, biochemical and cell biological approaches. Villidin has a calculated molecular mass of 190,000 Da. Based on the domain structure of the protein, villidin can be assigned to the gelsolin/villin-family as well as to the WD-repeat family. In principal, the group of the WD-repeat proteins includes regulatory proteins which are involved in signal transduction and other important cellular processes. The N-terminus of villidin harbours between four and eight of the specific WD-repeats and forms probably a β-propeller structure. The WD-domain is followed by an intervening domain of 400 amino acids that leads to the second characteristic villidin domain at the C-terminus. This part of the sequence exhibits a similarity to villin, though the first of the six villin domains is absent in villidin. However the typical headpiece is present. Villidin mRNA and protein are expressed in low amounts during growth and early aggregation, they are increased during development and reach highest levels at the tipped aggregate stage. The protein is present in the cytosol as well as in the cytoskeletal and the membrane fraction. These biochemical results are in agreement with the immunofluorescence data. The endogenous villidin is homogeneously distributed throughout the cytosol and localizes at vesicular structures. Colocalization experiments lead to the assumption that these structures might belong to a still unknown population of vesicles. GFP fusion proteins with the villin homology domains show a similar distribution, whereas GFP fusions of the N-terminal part encompassing the WD-repeats are present in F-actin rich regions at the plasma membrane and on internal membranes during motility, pinocytosis and phagocytosis. Mutants lacking villidin do not show an aberrant phenotype during growth and development but are defective in motility and phototaxis in the multicellular slug stage. Based on this defect and the multidomain structure of the protein, villidin might be involved in signal transduction processes leading to phototactic movement. The second part of the project dealt with a new gene which codes for a third profilin isoform in D. discoideum. The well-known Dictyostelium profilin isoforms I and II are able to interact with G-actin, PIP2 and poly-L-prolin. As in the case of profilin I and II, profilin III is encoded by a single gene. In contrast to profilin I and II, the transcription of profilin III is not developmentally regulated. All three isoforms show the typical limited homology at the amino acid level. The recombinant Profilin III protein cosediments with poly-L-prolin, inhibits the actin-polymerisation and the PIP2 interaction of profilin III competes with the G-actin affinity. The low expression of Profilin III mRNA in growing and developing cells suggests a distinct role of profilin III because a low protein concentration argues against an actin sequestering function.

7 Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) Untersuchungen an lebenden Zellen durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde eine Versuchsanordnung aufgebaut, die ein kommerziell erhältliches AFM mit einem invertierten optischen Mikroskop kombiniert. Die Anordnung erlaubt es, während der Messung Umgebungsbedingungen aufrechtzuerhalten, bei denen Zellen über lange Zeiträume hinweg überleben. Zunächst wurde eine festkörpergestützte Lipidschicht als Modellsystem verwendet, um die komplexe Wechselwirkung zwischen AFM-Spitze und Zellmembran zu charakterisieren. Daraus ergab sich eine Methode zur ortsaufgelösten Messung elektrostatischer Oberflächeneigenschaften. Die ersten Experimente an lebenden Zellen dienten der Beantwortung einiger grundlegender Fragen zur Bildentstehung an weichen Proben. Dazu zählen die Diskussion des verringerten Auflösungsvermögens und die Interpretation des Abbildungsvorgangs. Durch Korrelation der AFM-Messungen mit strukturellen Daten in Form von Fluoreszenzbildern konnten faserige Strukturen, die häufig in AFM-Bildern lebender Zellen auftreten, als Spannungsfasern (Bündel von Aktinfilamenten) identifiziert werden. Den Hauptteil der Arbeit bilden Elastizitätsmessungen an Zellen, die ebenfalls mit Hilfe des AFM durchgeführt wurden. Die lokalen Elastizitätsmoduli einer Probe werden dabei aus dem Verlauf von Kraftkurven berechnet. Dieser Berechnung liegt das Hertz-Modell für die elastische Eindrückung zweier Körper zugrunde. Einschränkungen, die sich ergeben, wenn Voraussetzungen des Modells hinsichtlich Probenbeschaffenheit und geometrischer Verhältnisse des Systems nicht erfüllt sind, wurden experimentell untersucht und theoretisch diskutiert. Um eine Interpretation der Elastizitätsbilder zu ermöglichen, mußte geklärt werden, welche Bestandteile den Zellen mechanische Stabilität verleihen. Morphologischen Überlegungen zufolge spielt das Zytoskelett die Rolle einer Stützstruktur, die die Zellen nicht nur stabilisiert, sondern auch verschiedene Bewegungsvorgänge ermöglicht. Durch gezielte Manipulationen konnte gezeigt werden, daß das Aktinnetzwerk, eine Komponente des Zytoskeletts, von entscheidender Bedeutung für die Zellelastizität ist. In analogen Experimenten wurde festgestellt, daß Mikrotubuli, die ebenfalls zum Zytoskelett gehören, keinen Einfluß auf die Stabilität von Zellen haben. Die Manipulationen wurden mit Hilfe verschiedener chemischer Wirkstoffe durchgeführt, die spezifisch bestimmte Bestandteile des Zytoskeletts angreifen. Dabei konnten sogar Unterschiede in den Mechanismen der Wirkstoffeffekte beobachtet werden. Eine erste Anwendung fanden diese Resultate bei der Untersuchung kriechender Zellen. Dieser Bewegungsvorgang beruht auf koordinierten Umstrukturierungen im Aktinnetzwerk und spielt eine entscheidende Rolle z. B. bei der Ausbreitung von Krebs, bei der Embryonalentwicklung oder bei Reaktionen des Immunsystems. Mit Hilfe von Elastizitätsmessungen an aktiven Lamellipodien kriechender Bindegewebszellen wurden Erkenntnisse über den molekularen Mechanismus gewonnen, der der Bewegung dieser Zellen zugrunde liegt. Von vier Modellvorstellungen über den Ursprung der Kraft, die das Lamellipodium vorwärts schiebt, sind nur zwei mit den AFM-Daten konsistent. Die Fortsetzung dieser Messungen bilden ähnliche Experimente mit schnell kriechenden Keratocyten sowie mit chemotaktisch stimulierten MTLn3-Zellen. In einem weiteren Projekt wurde das Quellverhalten der Cuticula untersucht. Die Cuticula ist die wachsartige extrazelluläre Schicht an der Oberfläche von Blättern hochentwickelter Pflanzen. Sie reguliert den Wasserhaushalt der Pflanzen. Aus dem gemessenen Quellverhalten ergaben sich Rückschlüsse auf die Diffusionsrate von Wasser durch die Cuticula.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden physikalische Meßmethoden entwickelt, um die Struktur und Dynamik der Plasmamembran lebender Säugetierzellen zu untersuchen. Dabei lag der Schwerpunkt zum einem auf der mechanischen Kopplung der Membranlipidschicht zu dem darunter liegenden, unterstützend wirkenden Zytoskelett, und zum anderen auf der Beweglichkeit einzelner Membrankomponenten innnerhalb der Membranlipidschicht. Ausgangspunkte für die Entwicklung neuer Methoden waren die Rasterkraftmikroskopie (RKM) und ´single-particle tracking’ (SPT). Die RKMermöglicht die Abbildung von Ober‡ächen mit hoher Au‡ösung in physiologischer Umgebung, so lange die Wechselwirkungskräfte die Probenober‡äche nicht zu sehr deformieren. SPT ist eine Technik, um die Bewegung von einzelnen Molekülen zu verfolgen. Dafür werden diese mit Polysteren-kügelchen oder kolloidem Gold markiert und mit Videomikroskopie beobachtet. Auf diesen Techniken aufbauend wurden folgende Verfahren und Geräte für diese Arbeit entwickelt: Das Scanning-Photonic Force Microscope (SPFM) als Analogon zum RKM: In einer Laserfalle (einem mit einem Objektiv hoher Apperatur (100x, NA 1.3) fokussierten infraroten (IR) Laser) wird ein Fluorophor gefülltes Polysterenkügelchen (bead, r=0.1¹m) gefangen. Die Fluorophore des als Sonde verwendeten Kügelchens werden über einen Zwei-Photonen Prozeß durch den IR-Laser zur Fluoreszenz angeregt. Eine Auslenkung aus der Halteposition durch eine äußere Kraft führt zum Abfall der Fluoreszenz. Im SPFM wird die Sonde mit Hilfe des Lasers analog zum mechanischen Hebelarm im RKM über die Probe bewegt. Dabei wird wie beim RKM die Auslenkung und somit Kraft gemessen. Die wesentlichen Unterschiede sind die fehlende mechanische Verbindung zur Umwelt, die ein Abrastern beliebiger transparenter 3D-Strukturen ermöglicht, die extrem kleine Federkonstante des Sensors (0.1- 1¹N/m), welche daher besser an die Elastiztät von biologischen Objekten angepaßt ist, sowie die stark reduzierte viskose Dämpfung der kleineren Sonde, was schnelleres Messen ermöglicht. Das Photonic Force Microscope (PFM) ist die Weiterentwicklung des SPFM. Bei der verwendeten kleinen Federkonstante werden die thermischen Positions‡ uktuationen sehr groß. Daher wurde ein Detektor entwickelt, der Messung der Position der Sonde in der Falle in drei Dimensionen mit Nanometer Ortsau‡ösung und 50kHz-Bandbreite ermöglicht. Der Detektor basiert auf der Interferenz des an der Sonde vorwärts gestreuten Laserlichts mit dem ungestreuten Licht. Dieses Prinzip wurde zuvor nur für seitliche Auslenkungen entlang einer Achse verwendet und erstmals in dieser Arbeit drei dimensional angewandt. Die vollständige theoretische Beschriebung des Detektorsignals ist ebenfalls ein Novum. Im PFM werden mit diesem Detektor die thermischen 3D-Positions‡uktuationen einer durch den Laser in einem Volumen von 0.1*0.1*0.6¹m3 gehaltenen Sonde analysiert. Zusätzlich wirkende Potentiale und die Viskosität des umgebenden Mediums können gemessen werden.