Podcasts about hplc methode

In der vorliegenden Arbeit wurden die Gesamtmengen und Konzentrationen der einzelnen Spülportionen an Protein, Phospholipid, SP-A und SP-D in den bronchoalveolären Lavagen von 4 juvenilen und 6 adulten Patienten mit pulmonaler Alveolarproteinose und einem Patienten mit Cholesterolpneumonitis bestimmt, und die Auswaschkinetik dieser Parameter über den Verlauf der Lavagen dargestellt. Auch wurde die Auswaschkinetik der Proformen des SP-C bei einem Patienten ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Perfluorcarboneinspülung nur einen vergleichsweise geringen Effekt auf die Auswascheffizienz einer Lavage zeigt, so dass weitergehende Untersuchungen notwendig sind, um über die Bedeutung der Technik endgültig zu entscheiden. Wir konnten zeigen, dass die Oberflächeneigenschaften bei adulten PAP Patienten sehr stark erniedrigt und bei juvenilen PAP Patienten um im Mittel 50% reduziert waren im Vergleich zu den Kontrollpatienten. Die Surfactanteigenschaften in den einzelnen Spülportionen über den Verlauf der Lavage ändern sich nicht. Es konnte zusätzlich eine signifikante Korrelation zwischen dem Initialdruck und der Öffnungszeit der Kapillare nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte eine direkte Proportionalität von Surfactantparametern und der Absorption der Nativlavage gezeigt werden und aus dieser Erkenntnis heraus eine Methode entwickelt werden, mit deren Hilfe durch eine einfache photometrischen Messung die Auswascheffizienz simultan während der Durchführung der Lavage überwacht werden kann und somit Lavagen zu einem Zeitpunkt beendet werden können, an dem eine weitere Spülung der Lunge keine große Effizienz mehr bedeutet. Das Proteinmuster von 2 pädiatrischen PAP Patienten wurde durch ein- und zweidimensionale Gelelektrophorese dargestellt und einzelne Spots mit Massenspektrometrie charakterisiert. Das Glycosilierungsmuster des SP-B und SP-C dieser Patienten wurde durch enzymatische Deglycosilierung untersucht und festgestellt, dass die in beiden Patienten vorhandenen pro SP-B Banden Nglycosiliert sind. Anhand klinischer Daten und den dazugehörigen ermittelten Surfactantparametern konnte der Effekt verschiedener therapeutischer Maßnahmen auf den Verlauf der Erkrankung bei 2 pädiatrischen PAP Patienten gezeigt werden. Für die Bestimmung von SP-B in Bronchiallavagen wurde eine neue Extraktions- und HPLC Methode entwickelt und validiert, welche es zum ersten Mal erlaubt, aufgrund seiner Sensitivität auch Lavagen von gesunden Patienten zu quantifizieren.

The existence of a melatonin rhythm in the domestic pig with respect to the light intensity has been discussed controversally. These controversial results are caused in part by inappropriate RIA methods. Until now, there are no published results describing non-immunological identification of melatonin in the domestic pig. Therefore, the main-objective of this study was to establish a HPLC method for the determination of melatonin in plasma and saliva samples of domestic pigs and to examine the correlation of the melatonin concentration of these two specimens. A further aim of this study was the possible replacement of blood sampling which requires the restraint of the animal by minimally invasive saliva sampling. The study was conducted on 12 domestic crossbred pigs aged 14 weeks (6 gilts, 6 barrows), which were housed in single pens under standardized conditions and under an equatorial lightregime (LD 12:12). Photophase light intensities were set in two groups with 250 lux and 470 lux, scotophase light intensities were below 1,0 lux. Blood and saliva samples were collected over a period of 24 hours on two non-successive days with sampling intervalls of 3 hours. Following chloroform extraction, samples were analyzed by a HPLC system. Identification and quantification of melatonin were achieved by comparing the retention times with those of authentical standards containing a known melatonin concentration. Results of this study showed that the HPLC method is appropriate for the determination of melatonin concentrations of both plasma and saliva samples and comprises a remarkably high sensitivity, which allows a reliable measurement of melatonin concentrations even in photophase samples. Results revealed identical concentrations of both photophase and scotophase melatonin concentrations at a light intensity of 250 lux, indicating a lack of suppression of pineal melatonin secretion during photophase. This indicates that differences in hormone concentrations driven by day/night-changeovers were not sufficient for pigs to differenciate between day and night at a light intensity of 250 lux. Results also showed significantly lower photophase melatonin concentrations at a light intensity of 470 lux, compared to 250 lux. This indicates a stronger light-induced melatonin supression, not being able to synchronize melatonin secretion to the lightregimen completely and therefore may have been assessed as insufficient by the animals. Furthermore, results showed clear differences in the melatonin profiles of castrated male and intact female pigs. There was no correlation of salivary and plasma melatonin concentrations. Therefore blood samples cannot be replaced by minimal-invasive saliva samples. Further studies should be done to investigate the light intensity, which entrains the synchronisation of the melatonin profile to the lightregime. This could be done by using this highly sensitive HPLC method to assess the photic demands of domestic pigs kept in indoor piggeries. Particular attention should be given to the consequences of a potential effect of a stress-load on the animals and its stimulating effects on the synthesis of melatonin, as well as potential sex differences.

Das Sevesogift 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD, ist das stärkste bisher vom Menschen in die Umwelt gebrachte Gift. Ein großer Anteil seiner toxischen Wirkungen wird auf das hohe Induktionspotential für fremdstoffmetabolisierende Enzyme zurückgeführt. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Auswirkung einer nicht letalen TCDD-Belastung auf den Arzneistoffwechsel im Modellversuch an Ratten. Als Pharmakon wurde das gut untersuchte und seit langer Zeit klinisch genutzte Imipramin gewählt. In allen Versuchen wurden die Ratten 48 Stunden vor Untersuchung des Imipraminstoffwechsels mit einer Einzeldosis von 5 µg TCDD/kg Körpergewicht vorbehandelt. Der Imipraminstoffwechsel wurde entweder in vivo durch Bestimmung der Kinetik von Imipramin und seines primären Hauptmetaboliten Desipramin im Plasma der Ratten ermittelt oder in vitro durch Messung des Umsatzes in den Lebermikrosomen bestimmt. Dabei wurden die Konzentrationen von Imipramin und seinen Metaboliten mit einer etablierten HPLC-Methode gemessen. Die Applikation von TCDD und Imipramin in vivo erfolgte bei den Ratten entweder über einen implantierten Duodenal- bzw. Jejunalkatheter oder durch intragastrale Verabreichung mit einer Schlundsonde. Mehrfache Blutproben von Einzeltieren wurden über einen implantierten Carotiskatheter oder aus dem Retroorbitalsinus gewonnen. Der induzierende Effekt der TCDD-Behandlung wurde in den Rattenlebermikrosomen anhand der Deethylierung von Ethoxyresorufin zu Resorufin überprüft. Der Umsatz dieses Substrates der Cytochrom P450-Isoenzyme 1A1 und 1A2 wurde durch die TCDD-Behandlung dreifach gegenüber den Kontrollen erhöht. Dagegen wurde der Abbau von Imipramin durch TCDD weder in den Mikrosomen in vitro, noch bei den Ratten in vivo stimuliert. Im ersten in vivo Versuch mit intraduodenaler Applikation erhöhte TCDD entgegen der Erwartung die Plasmakonzentrationen von Imipramin und Desipramin im Versuchszeitraum von 5 Stunden hoch signifikant um mehr als das Dreifache gegenüber den Kontrollen. Diese Steigerung der Bioverfügbarkeit konnte in weiteren Versuchen mit langsamerer Anflutung nach intragastraler Applikation von Imipramin nicht und auch nach intraajejunaler Gabe nur teilweise reproduziert werden. Die vorliegenden Versuche erlauben keinen Rückschluß auf den Wirkungsmechanismus des paradoxen TCDD-Effekts bei intraduodenaler Imipraminverabreichung. Angesichts der im Vergleich zum Tierversuch wesentlich geringeren TCDD-Belastung ist beim Menschen mit einem solchen Effekt auf den Arzneistoffwechsel jedoch nicht zu rechnen.

Aus fünf Sträuchern des Croton flavens L. von Barbados wurden insgesamt zwölf Verbindungen mit Hilfe von chromatographischen Methoden isoliert, wovon vier neue Naturstoffe darstellen. Die Strukturen wurden aufgeklärt anhand ihrer UV-, IR- und Massenspektren, sowie vor allem anhand der 1H-, 13C-, DEPT-, APT-, HH-COSY-, NOE-, HMQC- und HMBC-NMR-Spektren. Elf Substanzen gehören der Stoffklasse der Alkaloide an. Ein Tetrahydroprotoberberin-Grundgerüst besitzen Scoulerin (1) und Coreximin (2). Die beiden Substanzen unterscheiden sich nur in der Anordnung einer Hydroxygruppe. Bei der Biosynthese aus Retikulin wird durch das "Berberine Bridge Enzym“ die N-Methylgruppe zur Cyclisierung oxidiert. Dies ist erst der zweite Bericht, dass Tetrahydroprotoberberine aus einer Croton-Spezies isoliert wurden. Fünf weitere Verbindungen gehören der Stoffklasse der Morphinandienone an. Aus drei Sträuchern wurde das (R)-konfigurierte Salutaridin (3a) isoliert. Die phytochemischen Untersuchungen von zwei weiteren Sträuchern haben dagegen ergeben, dass sowohl Salutaridin (3a) als auch sein Spiegelbild-Isomer Sinoacutin (3b) vorkommen. Das Enantiomerengemisch hat den Namen Salutarin (3). Die Besonderheit liegt nun darin, dass in ein und derselben Pflanze von einem Naturstoff beide Enantiomere gebildet werden. Dieses Phänomen ist im Pflanzen- bzw. Tierreich sehr selten. Für die Untersuchung des Enantiomerenüberschusses von Salutaridin, der je nach Strauch und Jahreszeit zwischen 1 und 100% schwankt, wurde eine HPLC-Methode mit chiraler Säule (Chiralcel OD-R, 20:80 Acetonitril – 0.2 M Natriumperchlorat-Puffer pH 2) entwickelt. Ein weiterer Inhaltsstoff ist das N-Demethylderivat Norsinoacutin (5). Diese Verbindung ist nur in Sträuchern zu finden, die enantiomerenreines Salutaridin (3a) und nicht das Enantiomerengemisch Salutarin (3) enthalten. Es liegt der Schluss nahe, dass diese Pflanzen ein Enzym besitzen, das selektiv und quantitativ das (S)- konfigurierte Sinoacutin N-demethylieren kann. Norsinoacutin, Salutaridin und Salutarin entstehen durch ortho-para-oxidative Kupplung der Biosynthesevorstufe Retikulin. In seltenen Fällen findet auch eine para-para-oxidative Kupplung statt und es entstehen in 2,3-Position disubstituierte Morphinandienone. Zu dieser Verbindungsklasse gehören O-Methylflavinantin (4) und Flavinantin (6), die sich nur in einer Hydroxy- bzw. Methoxygruppe in 3-Position unterscheiden. Aus einem der Sträucher wurde neben dem Hauptalkaloid Salutarin (3) auch dessen N-Oxid (10) isoliert. Diese Verbindung liegt ebenfalls als Enantiomerengemisch vor und lässt sich durch die entwickelte HPLC-Methode mit einer chiralen Säule auftrennen. In diesem Strauch wurde außerdem ein neuer Naturstoff gefunden. Es gelang die Strukturaufklärung des Phenanthrens Crotoflavol (11). Dies ist der erste Bericht über das Vorkommen eines Phenanthrens in Croton-Spezies. Darüber hinaus konnten drei weitere neue Naturstoffe isoliert und identifiziert werden. In einem der Sträucher liegen Morphinandienon-Dimere vor. Durch oxidative 1,1‘-Kupplung von zwei Salutaridin-Molekülen entstehen die beiden Rotamere Saludimerin A und B (7 und 8), welche auf Grund der eingeschränkten Rotation entlang der Biarylachse unterschiedliche spektroskopische Eigenschaften aufweisen. Die absolute Konfiguration konnte durch aufwendige CD- und ROESY-Studien aufgeklärt werden. Das dritte Dimer Salsinodimerin (9) enthält eine Salutaridin- und eine Norsinoacutin-Einheit. Mit diesen drei Verbindungen konnten zum ersten Mal CC- verknüpfte Morphinandienon-Dimere aus Pflanzen isoliert werden. Zum Strukturbeweis wurden Partialsynthesen durchgeführt. Dabei sind besonders die oxidativen Kupplungen zu den Dimeren hervorzuheben. Milde Oxidation von enantiomerenreinem Salutaridin (3a) mit Silbernitrat-Lösung in Ethanol lieferte Saludimerin A (7). Andererseits erhält man bei der Oxidation eines Gemisches aus Salutaridin und Norsinoacutin (5) mit Kaliumhexacyanoferrat(III) die dimeren Alkaloide Saludimerin B (8) und Salsinodimerin (9). Aus dem Enantiomerengemisch Salutarin (3) wurde mit Diazomethan der OMethylether hergestellt, welcher das gleiche Molekulargewicht hat wie die isolierte Verbindung O-Methylflavinantin (4). Es konnte dadurch gezeigt werden, dass OMethylflavinantin in 2,3-Position disubstituiert sein muss, wohingegen das synthetische O-Methylsalutarin in 3,4-Position die Methoxygruppen trägt. Ebenfalls aus Salutarin wurde mit Chlorameisensäure-2,2,2-trichlorethylester das NNorderivat zugänglich. Mittels chiraler HPLC-Methode konnte das Enantiomerengemisch Norsalutaridin und Norsinoacutin aufgetrennt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die isolierte Verbindung 5 enantiomerenreines Norsinoacutin ist. Aus den fünf untersuchten Sträuchern konnten sowohl (R)-konfiguriertes Salutaridin (3a) als auch das Enantiomerengemisch Salutarin (3) isoliert werden. Mittels Razematspaltung über Kristallisation diastereomerer Salze konnte Salutaridin enantiomerenrein erhalten werden. Das (S)-konfigurierte Sinoacutin (3b) war dadurch aber nicht zugänglich. Daher wurde aus Norsinoacutin (5) durch NMethylierung mit Formaldehyd und dem Reduktionsmittel Natriumcyanoborhydrid das linksdrehende Enantiomer Sinoacutin synthetisiert. Salutaridin ist eine wichtige Vorstufe bei der Biosynthese von Thebain, Codein und Morphin. Es wurden daher die Stereochemie, die Biosynthese und die pharmakologischen Eigenschaften dieser Substanz näher beleuchtet. Wie schon beschrieben, konnte sowohl enantiomerenreines Salutaridin (3a), als auch das Enantiomerengemisch Salutarin (3) isoliert werden. Nur Salutaridin wird in Thebain, Codein und Morphin umgewandelt. Eine Zwischenstufe ist dabei Salutaridinol. Dieses wichtige Intermediat wurde partialsynthetisch aus Salutarin durch Reduktion der Dienon-Funktion zum Alkohol erhalten. Dabei entstehen zwei epimere Alkohole, die sich gut trennen lassen. Nur Salutaridinol und nicht 7-epi-Salutaridinol wird bei der Biosynthese weiter verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass in Croton flavens L. keiner dieser Alkohole vorliegt und damit das notwendige Enzymsystem für den Reduktionsschritt fehlen muss.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.