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Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufige (10%), spontane, immun-mediierte, wiederkehrende Entzündung des inneren Pferdeauges, die letztendlich zur Erblindung des betroffenen Auges führt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin stellt die ERU das einzige spontane Tiermodell für die autoimmun-mediierte Uveitis des Menschen dar, so dass Fortschritte in der Erforschung der ERU auch einen Beitrag für ein besseres Verständnis dieser Erkrankung beim Menschen leisten. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen am Zielorgan, die zur Entstehung der ERU und den rezidivierenden Entzündungsschüben führen, sind bis heute nicht geklärt. Durch seinen unmittelbaren Kontakt zur Retina ermöglicht der Glaskörper einen indirekten Einblick auf die in der Retina ablaufenden pathophysiologischen Prozesse und stellt ein wertvolles Probenmaterial bei der Erforschung vitreoretinaler Erkrankungen wie der ERU dar. Ziel dieser Arbeit war es, Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 119 Glaskörperproteine mittels LC-MS/MS identifiziert. Hiervon konnte durch eine Label-free Quantifizierung für 79 Proteine eine differenzielle Expression nachgewiesen werden. 17 Proteine zeigten eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben von an ERU erkrankten Pferden, wohingegen 62 Proteine in ihrer Expression vermindert waren. Durch die mit der Software STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins) durchgeführte Protein-Interaktionsnetzwerk-Analyse konnten vier Cluster von Proteinen identifiziert werden, die bei der ERU verändert exprimiert werden. Neben einer Gruppe von Plasmaproteinen, einer aus Zelladhäsions-Proteinen bestehenden Gruppe und Proteinen des Wnt-Signalweges wurde erstmalig eine funktionell mit den Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 assoziierte Gruppe identifiziert, für deren Vertreter ebenfalls eine differenzielle Expression in der Pferderetina nachgewiesen wurde. Der Wnt-Inhibitor SFRP-2 war in den Glaskörpern von an ERU erkrankten Pferden vermindert nachweisbar und zeigte eine Assoziation mit der Expression seines Interaktors Wnt3a in der gesunden Pferderetina. Mit A2M konnte durch SF-TAP Aufreinigung ein bislang unbekannter Interaktor für SFRP-2 identifiziert und in Bezug zur ERU weiter charakterisiert werden. Für das Protein Osteopontin konnte eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben und Retinae der Kontrollpferde nachgewiesen werden. Rückblickend erwies sich die Protein-Netzwerkanalyse der durch LC-MS/MS identifizierten, differenziell exprimierten Proteine als geeignete Methode, um Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Weitere Experimente sind nun notwendig, um die funktionelle Bedeutung der neu identifizierten Proteine und der mit ihnen assoziierten Signalwege in der ERU zu evaluieren.

Thu, 25 Jun 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10445/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10445/1/Ilmer_Matthias.pdf Ilmer, Matthias

Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen heute in der westlichen Welt die häufigste Todesursache überhaupt dar. In der Vergangenheit wurde deshalb zu deren Therapie bereits eine Vielzahl an medikamentösen und chirurgischen Behandlungsmöglichkeiten entwickelt, die jedoch insbesondere in schweren Erkrankungsfällen keine langfristig zufrieden stellenden Optionen bieten konnten. Von Embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) erhofft man sich deshalb ganz neue, zelltherapeutische Möglichkeiten. Durch das Potential, vitales Herzmuskelgewebe aus diesen pluripotenten Zellen in vitro generieren zu können, eröffnen sich dabei für die kausale Behandlung der Herzinsuffizienz bisher ungeahnte Perspektiven. Zwei der Hauptprobleme bei der Gewinnung von Kardiomyozyten aus der differenzierten ES-Zell-Kultur stellen jedoch zum einen der geringe Anteil von Herzmuskelzellen an der Mischkultur und zum anderen deren schwierige hochselektive Aufreinigung dar. Durch Entschlüsselung der Stammzellentwicklung und der daran beteiligten Faktoren und Signalkaskaden könnte es jedoch in Zukunft möglich werden, die Steuerung für diese Differenzierung zu übernehmen, um so aus den hoch proliferativen, pluripotenten Vorläuferzellen Kardiomyozytenreinkulturen gewinnen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde der früh während der Embryonalentwicklung exprimierte Transkriptionsfaktor mesoderm posterior 1 (MesP1) als mögliche Schlüsselkomponente der kardiovaskulären Entwicklung detailliert untersucht. Mithilfe eines dafür konstruierten Vektors konnte der Faktor MesP1 in stabil-transfizierten, murinen embryonalen Stammzellen überexprimiert – und so dessen induktive Wirkung auf die Entwicklung von Herz- und Endothelzellen während der ES Zell-Differenzierung auf molekularer wie auch zellulärer Ebene nachgewiesen werden. So zeigte sich in den transgenen Zellen bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung eine verstärkte Expression u. a. der frühen kardialen Transkriptionsfaktoren Nkx2.5 und GATA-4, die sich später während der Differenzierung in einer mehrfach erhöhten Ausbeute an Kardiomyozyten und Endothelzellen in der Zellkultur widerspiegelte. Die Funktionalität der amplifizierten Kardiomyozyten bezüglich Kontraktionsfrequenz und Reagibiliät auf vegetative Reize blieb dabei unverändert erhalten. Bei der Analyse der Keimblattentwicklung fiel auf, dass durch Überexpression des mesoderm posterior 1 in den transgenen Zellen die Menge an Gesamtmesoderm unverändert blieb, jedoch innerhalb dieses Keimblattes die Differenzierung deutlich in Richtung kardiovaskulär und zu Lasten der Skelettmuskelentwicklung verschoben war. Im Ektoderm zeigte sich eine verstärkte neurale Entwicklung, induziert durch die vermehrt vorhandenen kardiogenen Zellen. Die Bildung des Endoderms war unbeeinträchtigt. Im Folgenden konnte schließlich in Untersuchungen zur Signaltransduktion der Mechanismus der MesP1-vermittelten kardiovaskulären Induktion aufgeklärt werden, indem der Faktor Dickkopf-1, ein Inhibitor des Wnt-Signalweges, als Zielgen des Transkriptionsfaktors MesP1 identifiziert und in Folgeversuchen mittels Bandshift auch bestätigt werden konnte. Die Blockade des Wnt-Signalweges ist verantwortlich für die Initiierung der kardiovaskulären Differenzierung während der Embryonalentwicklung. MesP1 stellt damit einen besonderen Faktor während der Embryogenese dar und einen wichtigen Startpunkt für die weitere Entzifferung der komplexen Signaltransduktionskaskaden der Herz- und Gefäßentwicklung. Das vollständige Verständnis dieses komplexen Netzwerkes sowie die Übertragung auf das humane ES-Zell-System könnte es einmal ermöglichen, Herzmuskelerkrankungen des Menschen mit embryonalen Stammzellen therapieren zu können.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen aufgrund ihres Differenzierungspotentials einen großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin dar. Entsprechend zahlreicher zell- und tierexperi-menteller Untersuchungen scheint die klinische Anwendung dieser adulten Stammzellpopulation im Rahmen einer Zelltherapie in greifbare Nähe zu rücken, wobei MSC als Basis für einen Patien-ten-spezifischen Zell- und Gewebeersatz dienen könnten. In welcher Weise die regenerative Kapazität der MSC durch spezielle Signaltransduktionsmechanismen gesteuert wird, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Wnt/β-Catenin-Signaltrans-duktionsweg sowohl in humanen (hMSC) als auch in murinen (mMSC) mesenchymalen Stamm-zellen untersucht. Diesem komparativen Ansatz lag das Ziel zugrunde, Gemeinsamkeiten und Unterschiede in diesen beiden Zellentitäten zu evaluieren, um damit langfristig den Grundstein für die Übertragbarkeit von Daten aus nachfolgend geplanten murinen in vivo-Modellen auf die klinische Situation legen zu können. Hierzu wurden zunächst die Basis-Komponenten des Wnt/β-Catenin-Signalweges vergleichend analysiert. Eine Aktivierung des Wnt-Signalweges wurde über Stimulation mit Wnt3a bzw. LiCl in beiden Zellspezies sowie in einem RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Ansatz durch Knockdown der für den β-Catenin-Abbaukomplex essentiellen Proteine APC und Axin2 in hMSC erreicht, während eine Inhibtion durch die Transfektion von small interfering RNAs (siRNAs) gegen das transkrip-tionsaktivierende Protein β-Catenin bzw. den Wnt-Korezeptor LRP5 induziert wurde. Dabei zeigten sich neben zahlreichen Gemeinsamkeiten unter anderem hinsichtlich der Proliferation auch klare Unterschiede zwischen hMSC und mMSC. Dies betraf insbesondere die Steuerung von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-mediierten Invasionsprozessen, die im Falle von hMSC eine deutliche Wnt-Abhängigkeit aufwiesen, während die Invasionsfähigkeit von mMSC nicht durch den Wnt-Signalweg reguliert wurde. Diese Unterschiede in den zellulären Phänotypen spiegelten sich vorwiegend in einer Spezies-divergenten Regulation der Matrix-Metalloproteinase MT1-MMP wider, da nur in hMSC die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade mit einer vermehrten MT1-MMP-Expression einherging. Darüber hinaus konnte das Tcf/Lef-Reporter-System in mMSC etabliert werden, das die Quanti-fizierung β-Catenin-abhängiger Expression ermöglicht. Dies erfolgt mit Hilfe eines Reporter-proteins, dessen Expression nur nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern induziert wird. Mit diesem System konnte unter anderem auch der Nachweis der funktionellen Plasmid-kodierten Wnt3a-Expression erbracht werden. Derartig generierte Reporter-mMSC könnten vor allen Dingen hinsichtlich einer Anwendung im in vivo-Mausmodell von großem Vorteil sein, da Wnt-aktive MSC mittels eines in vivo-Imaging-Systems visualisiert werden können, um ihre Rolle bei Geweberegenerationsprozessen aufzuklären. In einem weiteren Teilprojekt wurde die Wirkung von Dkk-1, einem Inhibitor des kanonischen Wnt-Signalweges, in hMSC eingehend untersucht. Dabei stand die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Dkk-1 und seinem Rezeptor LRP6 im Vordergrund. Versuche zum LRP6-Knockdown brachten ein komplexes Regulationssystem zutage, das eine feinjustierte Balance zwischen akti-vierenden und inhibierenden Signalen impliziert. Die Ergebnisse zusätzlicher RNAi-basierter Experimente wiesen außerdem auf eine funktionelle Divergenz von LRP5 und LRP6 hin. So vermittelt der Wnt-Korezeptor LRP5 vornehmlich aktivierende Signale, wie sie z.B. durch Wnt3a ausgelöst werden, während LRP6 hauptsächlich eine repressive Funktion beispielsweise durch Bindung von Dkk-1 zuzuordnen ist. Da neben den LRP-Rezeptoren auch Frizzled-Rezeptoren (Fzd) eine wesentliche Rolle bei der Wnt-Signalerfassung spielen, wurde zunächst das Fzd-Expressionsprofil in hMSC und mMSC mittels semiquantitativer RT-PCR-Analysen näher untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle bisher bekannten 10 Fzds auch in MSC exprimiert werden, dieses jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Zudem ergaben Wnt3a-Stimulationsexperimente in hMSC, dass die Expression von Fzd8 negativ durch Wnt3a beeinflusst wird. Um die Bedeutung von Fzd8 näher zu evaluieren, wurden daher Fzd8-Knockdown-Experimente durchgeführt. Diese ließen erkennen, dass die hMSC-Proliferation maß-geblich von der Fzd8-Expression abhängt, wobei allerdings Fzd8 keinen direkten Rezeptor für Wnt3a darstellt. Zusammenfassend spiegeln die in der vorliegenden Promotionsarbeit erhobenen Daten zum Teil eindeutige Unterschiede zwischen basalen Wnt-regulierten Prozessen in hMSC und mMSC wider, denen insbesondere bei der präklinischen Validierung von therapeutischen Strategien in Maus-modellen eine tragende Rolle zukommt. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg maßgeblich an der Steuerung des invasiven Verhaltens von hMSC beteiligt ist, wie dies in ähnlicher Weise von anderen Forschergruppen auch für die Metastasierung von Tumorzellen nachgewiesen werden konnte, erscheint es zukünftig von vorrangigem Interesse, die hier erhobenen in vitro-Daten in einem in vivo-Mausmodell zu evaluieren. In diesem Kontext kann allerdings nur durch einen komparativen Ansatz, wie er dieser Arbeit zugrunde liegt, die Basis für ein Spezies-relevantes drug design bezüglich des Wnt-Signalweges entwickelt werden, um schließlich aussagekräftige Stamm-zelltherapien bzw. Anti-Tumorstrategien entwickeln zu können.

Ziel der Arbeit war die Etablierung RNA Interferenz basierender Systeme zur Senkung der Proteinspiegel von b- und g-Catenin und die darauf aufbauende Evaluierung potentieller b-Catenin Zielgene mittels Microarray Technologie. Der Schwerpunkt sollte dabei auf die Untersuchung von im Wnt-Signalweg beteiligten Genen gelegt werden. Wir konnten in den kolorektalen Karzinomzelllinien SW-480, DLD-1 und HT-29 mehrere voneinander unabhängige siRNA sowohl gegen b- als auch g-Catenin etablieren. Dabei stand neben ausreichender Senkung der Protein- und mRNA-Spiegel auch die Vermeidung unerwünschter Effekte auf die Zellen im Mittelpunkt dieser Etablierungsarbeit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten vier neue funktionale Zelllinien etabliert werden. Sowohl in HT-29 als auch in SW-480 konnte ein universell einsetzbarer TET-Repressor stabil integriert werden. Die Linien HT-29TR und SW-480TR können als Basis für induzierbare Expressionssysteme verwendet werden. Auf Grundlage der Linie SW-480TR konnten Zelllinien etabliert werden, die durch Doxycyclin vermittelte Induktion shRNA gegen b-Catenin exprimieren. Mittels dieser Linien können Effekte, die durch die Senkung der b-Catenin Proteinspiegel hervorgerufen werden, einfach, schnell und zuverlässig in einem breiten Spektrum an in vitro und in vivo Assays untersucht werden. Im Rahmen einer Microarray Analyse des Transkriptoms von SW-480 Zellen nach RNA Interferenz basierter Senkung der b-Catenin Proteinspiegel wurde DKK4 als sehr stark reguliertes Gen auffällig. Mittels RT-PCR konnten wir bestätigen, dass die Expression von DKK4 direkt von den vorliegenden b-Catenin Proteinspiegeln abhängig ist. Basierend auf einer in silico Analyse des DKK4 Promoters wurden mit Hilfe von Reportergen Konstrukten der für die Aktivierbarkeit durch b-Catenin verantwortliche Abschnitt des DKK4 Promoters bestimmt. Wir konnten darstellen, dass die Aktivierung des DKK4 Promotors sowohl von der Präsenz von b-Catenin als auch von TCF4 abhängt. Die Expression von DKK4 bedingt die Gegenwart des aus TCF4 und b-Catenin bestehenden Transaktivierungskomplexes, der für die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription verantwortlich zeichnet. Gleichzeitig stellt der DKK4 Promoter durch die Präsenz von TCF-Bindestellen eine Zielstruktur für diesen Transaktivierungskomplex dar. Unsere Daten belegen, dass DKK4 ein b-Catenin Zielgen darstellt. Wir konnten auflerdem zeigen, dass die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription durch Gabe von rekombinantem DKK4 gehemmt werden kann. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit dargestellt werden, dass die Expression des Wnt-Antagonisten DKK4 in einen negativen Feedback Mechanismus, der durch b-Catenin autoreguliert wird, eingebunden ist. Der vermutete Feedback Mechanismus stellt sich wie folgt dar. Wnt-Faktoren aktivieren die Transkription b-Catenin abhangiger Zielgene, darunter auch DKK4. DKK4 initiiert durch Bindung an LRP und Kremen den Abbau von b-Catenin und verhindert somit die weiterführende Transkription von Wnt-b-Catenin Zielgenen. DKK4 übernimmt als autokriner Inhibitor des Wnt-Signalwegs feinregulatorische Aufgaben, um bei moglicher Bedarfsdeckung b-Catenin abhängiger Gentranskription die weitere Aktivierung durch Wnt-Faktoren zu verhindern. Fur den Fall, dass DKK4 als parakriner Inhibitor agiert, wäre es denkbar, dass DKK4 von Zellen im unteren Teil der Krypte, die in hohem Maße durch Wnt-Faktoren aktiviert, werden sezerniert wird, um die darüber liegenden Zellen durch Abschirmung von weiteren Wnt-Signalen vor überschieflender Expression Wnt-b-Catenin abhängiger Gene und Proliferation zu schutzen und die Differenzierung dieser Zellen einzuleiten. Die unkontrollierte Expression von Wnt-b-Catenin Zielgenen nimmt bei der Entstehung kolorektaler Karzinome eine entscheidende Schlüsselposition ein. Zur Etablierung neuer Diagnostik- und Therapieoptionen bedarf es daher auch der stetigen Erweiterung des Verständnisses des Wnt-Signalwegs. Diese Arbeit fügt ein weiteres Rädchen in die komplexe Mechanik dieses Signalwegs ein.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist die häufigste Augenerkrankung bei Equiden. Die pathogenetischen Mechanismen, die den rezidivierenden immunologisch-inflammatorischen Reaktionen und der Schädigung intraokularer Strukturen zu Grunde liegen, sind weitgehend unerforscht. Ziel dieser Arbeit war es, durch die Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese und massenspektrometrischen Untersuchungen, die Proteinexpression in den Glaskörpern gesunder und an ERU erkrankter Pferde zu analysieren und durch die Identifizierung differenziell exprimierter Proteine, Hinweise auf Mechanismen zu erhalten, die bei der Pathogenese der ERU von Bedeutung sind. Dabei wurde Material verwendet, das bei der therapeutischen Pars-plana-Vitrektomie chirurgisch entfernt wird, was zu einer Reduktion weiterer Schübe führt. Deutliche Unterschiede zwischen gesunden und uveitischen Augen zeigten sich bereits in einer signifikant erhöhten Proteinkonzentration der Glaskörper uveitischer Pferde (3,67 µg/µl ± 2,28 µg/µl bei ERU im Vergleich zu 0,15 µg/µl ± 0,05 µg/µl bei gesunden). Die nach zweidimensionaler Gelelektrophorese des Glaskörpermaterials erhaltenen Proteinmuster der Glaskörper gesunder Augen waren sehr homogen. Ebenso zeigten die Proteinmuster der uveitischen Glaskörper untereinander nur geringe individuelle Unterschiede. Deutliche Unterschiede in der Proteinexpression waren jedoch beim Vergleich von Glaskörpern gesunder und uveitischer Augen festzustellen. Nach massenspektrometrischer Analyse der zweidimensional aufgetrennten Proteine wurden insgesamt elf differenziell exprimierte Proteine identifiziert. Hiervon waren in den Glaskörpern uveitischer Pferde, im Vergleich zu gesunden, sechs Proteine (Albumin, Gamma-Immunglobulin, Komplement C3, Apolipoprotein-AI, Carboxylesterase D1 und Histone deacetylase complex subunit SAP18) höher und fünf Proteine (Plasma Retinol-bindendes Protein, Prostaglandin-H2 D-isomerase, Dickkopf-related protein 3, Secreted frizzled-related protein 2 und Pigment epithelium-derived factor) niedriger exprimiert. Diese differenziell exprimierten Proteine sind im Zusammenhang mit der Blut-Retina-Schranke, mit Immunantworten und der Modulation des Wnt-Signalweges von Bedeutung. Interessant ist insbesondere eine mögliche Beteiligung des Wnt-Signalweges bei der ERU. Dieser wurde im Zusammenhang mit Uveitiden bisher nicht beschrieben. Die signifikant reduzierte Expression konnte für sFRP-2 und PEDF darüber hinaus direkt im retinalen Gewebe gezeigt werden. Dabei konnte zusätzlich ein Zusammenhang zwischen niedrigem PEDF und auftretender VEGF-Expression in der Netzhaut nachgewiesen werden. Die Proteomanalyse hat sich somit als geeignetes Instrument bei der Identifizierung neuer, möglicherweise bei der Pathogenese der ERU relevanter, Proteine und biologischer Signalwege erwiesen.