Podcasts about eine aktivierung

Mein Podcast wird heute 2 Jahre alt! Und deshalb habe ich heute eine ganz spezielle Folge für dich. Eine Aktivierung, damit du deinen Tag in einer hohn Frequenz startest.  Wenn du in der Früh aufwachst und zu deinem Handy greifst. Geh nicht als erstes auf Facebook oder Instagram, sondern höre dir diese Aktivierung an! https://open.spotify.com/episode/4Ngh0zJtDGr7YKK4rt5rpQ?si=op4x5iBxQgOXfxjgx5SZeA&dl_branch=1

Bisher wurden sieben verschiedene TRPC-Kanäle (für „classical (oder canonical) transient receptor potential“) beschrieben, die in der Plasmamembran tierischer Zellen lokalisiert sind. Diese Kanäle gehören zu einer von sieben Familien der TRP-Ionenkanäle, deren Mitglieder an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper beteiligt sind. Im Jahr 2005 konnten in Patienten, die an einer autosomal dominant vererbten Form der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) leiden, Mutationen der TRPC6-Kanäle identifiziert werden, die zu einer Überaktivität dieser Kanäle führen ( sog. “gain-of-function”-Mutationen). Etwas später (2006) wurden aber auch einige FSGS Patienten entdeckt, die keine „gain-of-function“-Mutationen im TRPC6 sondern funktionslose, sog. „loss of function“-Mutationen der Phospholipase Cɛ (PLCɛ) exprimierten. Diese Daten deuten auf eine funktionelle Interaktion zwischen TRPC6 und PLCɛ in Zellen der Niere hin, die bisher noch nicht näher untersucht worden ist. Beide Proteine könnten sich auch als Zielstrukturen für eine Pharmakotherapie der FSGS eignen. Die FSGS äußert sich durch eine Störung des glomerulären Filtrationsprozesses in der Niere, wodurch es unter anderem zu einer Proteinurie kommt. In vielen Fällen führt die FSGS terminal zur ESRD („end stage renal disease“), also zu einem akuten Nierenversagen. Glomeruli bilden die filtrierende Einheit der Niere, wobei der eigentliche Filter, welcher im Inneren des Glomerulus lokalisiert ist, aus Podozyten, Endothelzellen und der dazwischen befindlichen Basalmembran besteht. Da TRPC-Kanäle unter anderem in Podozyten exprimiert werden, liegt die Annahme nahe, dass diese Zellen durch den vermehrten Ca2+-Einstrom mutierter Kanäle bei der FSGS krankhaft verändert sein könnten. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Podozyten aus Wildtyp (WT)-Mäusen sowie TRPC6 (TRPC6-/-)- und PLCε (PLCε-/-)-gendefizienten Tieren isoliert und umfangreich durch den Nachweis podozytenspezifischer Markerproteine charakterisiert. Zellfunktionen wie Proliferation, Aktinstressfaserbildung, RhoA- und TRPC6-Aktivität wurden vergleichend in den Zellen der verschiedenen Genotypen analysiert. Es zeigte sich, dass PLCε zwar mit TRPC6 in Zellen des Nierenkortex interagieren kann, aber PLCε-/--Podozyten funktionell in ihrer Angiotensin II-induzierten Aktinstressfiberbildung und GTPγS-induzierten TRPC6-Aktivierung nicht von Wildtyp-Podozyten unterschieden werden konnten, was auf eine redundante Funktion der PLCε-vermittelten TRPC6-Aktivierung hindeutet. Eine Aktivierung von TRPC6 durch PLCε wird wahrscheinlich durch die Stimulation der wesentlich stärker exprimierten anderen PLC-Isoform PLCβ1, zumindest in Podozyten, überdeckt. Eine Expression der klonierten murinen TRPC6-FSGS-Mutanten in primär isolierten Wildtyp- und TRPC6-defizienten Podozyten war für die Zellen lethal, wodurch die Pathogenität eines erhöhten TRPC6-induzierten Ca2+-Einstroms für diese Zellen und damit den gesamten Nierenglomerulus in FSGS-Patienten noch einmal nachgewiesen werden konnte. In Zukunft könnten deswegen spezifische TRPC6-Inhibitoren eine Therapieoption zur Linderung der Symptome bei FSGS-Patienten sein.

Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

Die glatte Muskulatur steuert eine Vielzahl wichtiger physiologischer Funktionen, wie beispielsweise den Blutdruck, die Magen-Darm-Motilität und die Harnblasen Entleerung. Die Kontraktion des glatten Muskel wird nach hormoneller Stimulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren vor allem durch L-Typ Ca2+-Kanäle vermittelt. Dies konnte mit Untersuchungen an genetisch veränderten Mauslinien, die glattmuskelspezifisch eine Deletion des Cav1.2 Ca2+-Kanals aufweisen (SMACKO Mäuse), belegt werden. Die Ansteuerung des L-Typ Ca2+-Kanals nach hormoneller Stimulation ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher, den Kopplungsmechanismus sowie eventuell beteiligte Linkerproteine zwischen dem M3 Rezeptor und dem L-Typ Ca2+-Kanal in der Harnblase zu untersuchen. Die Experimente wurden sowohl an Harnblasen von Wildtyp und SMACKO Mäusen, als auch an Schweineharnblasen durchgeführt. Die funktionellen Untersuchungen legten eine cholinerge Modulation des Cav1.2 Ca2+-Kanal über die PKC nahe. So bewirkte der Einsatz von PKC- und Cav1.2 Ca2+-Kanal-Antagonisten eine Hemmung der cholinergen Kontraktion. Eine Aktivierung der PKC durch den Phorbolester PdBu hingegen führte zu einer Verstärkung der cholinergen Kontraktionsantwort mit einer gleichzeitigen Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Signals. Den Beleg einer direkten Assoziation von PKC und Cav1.2 Ca2+-Kanal lieferten die biochemischen Untersuchungen. Die BN Page Versuche zeigten die Anwesenheit der PKC im Cav1.2 Proteinkomplex. Eine Mitfällung der PKC mit dem Cav1.2 Antikörper bestätigten die Hypothese einer direkten Interaktion beider Proteine. Die Phosphorylierungsversuche belegten, dass die α1C-Untereinheit und im Schwein auch die β3-Untereinheit des Cav1.2 Ca2+-Kanals verstärkt nach cholinerger Stimulation phosphoryliert werden. Die Ergebnisse zeigten die Beteiligung eines PKC/ Cav1.2 Signalkomplexes bei der cholinerg induzierten Kontraktion der Harnblase von Maus und Schwein.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen aufgrund ihres Differenzierungspotentials einen großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin dar. Entsprechend zahlreicher zell- und tierexperi-menteller Untersuchungen scheint die klinische Anwendung dieser adulten Stammzellpopulation im Rahmen einer Zelltherapie in greifbare Nähe zu rücken, wobei MSC als Basis für einen Patien-ten-spezifischen Zell- und Gewebeersatz dienen könnten. In welcher Weise die regenerative Kapazität der MSC durch spezielle Signaltransduktionsmechanismen gesteuert wird, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Wnt/β-Catenin-Signaltrans-duktionsweg sowohl in humanen (hMSC) als auch in murinen (mMSC) mesenchymalen Stamm-zellen untersucht. Diesem komparativen Ansatz lag das Ziel zugrunde, Gemeinsamkeiten und Unterschiede in diesen beiden Zellentitäten zu evaluieren, um damit langfristig den Grundstein für die Übertragbarkeit von Daten aus nachfolgend geplanten murinen in vivo-Modellen auf die klinische Situation legen zu können. Hierzu wurden zunächst die Basis-Komponenten des Wnt/β-Catenin-Signalweges vergleichend analysiert. Eine Aktivierung des Wnt-Signalweges wurde über Stimulation mit Wnt3a bzw. LiCl in beiden Zellspezies sowie in einem RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Ansatz durch Knockdown der für den β-Catenin-Abbaukomplex essentiellen Proteine APC und Axin2 in hMSC erreicht, während eine Inhibtion durch die Transfektion von small interfering RNAs (siRNAs) gegen das transkrip-tionsaktivierende Protein β-Catenin bzw. den Wnt-Korezeptor LRP5 induziert wurde. Dabei zeigten sich neben zahlreichen Gemeinsamkeiten unter anderem hinsichtlich der Proliferation auch klare Unterschiede zwischen hMSC und mMSC. Dies betraf insbesondere die Steuerung von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-mediierten Invasionsprozessen, die im Falle von hMSC eine deutliche Wnt-Abhängigkeit aufwiesen, während die Invasionsfähigkeit von mMSC nicht durch den Wnt-Signalweg reguliert wurde. Diese Unterschiede in den zellulären Phänotypen spiegelten sich vorwiegend in einer Spezies-divergenten Regulation der Matrix-Metalloproteinase MT1-MMP wider, da nur in hMSC die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade mit einer vermehrten MT1-MMP-Expression einherging. Darüber hinaus konnte das Tcf/Lef-Reporter-System in mMSC etabliert werden, das die Quanti-fizierung β-Catenin-abhängiger Expression ermöglicht. Dies erfolgt mit Hilfe eines Reporter-proteins, dessen Expression nur nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern induziert wird. Mit diesem System konnte unter anderem auch der Nachweis der funktionellen Plasmid-kodierten Wnt3a-Expression erbracht werden. Derartig generierte Reporter-mMSC könnten vor allen Dingen hinsichtlich einer Anwendung im in vivo-Mausmodell von großem Vorteil sein, da Wnt-aktive MSC mittels eines in vivo-Imaging-Systems visualisiert werden können, um ihre Rolle bei Geweberegenerationsprozessen aufzuklären. In einem weiteren Teilprojekt wurde die Wirkung von Dkk-1, einem Inhibitor des kanonischen Wnt-Signalweges, in hMSC eingehend untersucht. Dabei stand die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Dkk-1 und seinem Rezeptor LRP6 im Vordergrund. Versuche zum LRP6-Knockdown brachten ein komplexes Regulationssystem zutage, das eine feinjustierte Balance zwischen akti-vierenden und inhibierenden Signalen impliziert. Die Ergebnisse zusätzlicher RNAi-basierter Experimente wiesen außerdem auf eine funktionelle Divergenz von LRP5 und LRP6 hin. So vermittelt der Wnt-Korezeptor LRP5 vornehmlich aktivierende Signale, wie sie z.B. durch Wnt3a ausgelöst werden, während LRP6 hauptsächlich eine repressive Funktion beispielsweise durch Bindung von Dkk-1 zuzuordnen ist. Da neben den LRP-Rezeptoren auch Frizzled-Rezeptoren (Fzd) eine wesentliche Rolle bei der Wnt-Signalerfassung spielen, wurde zunächst das Fzd-Expressionsprofil in hMSC und mMSC mittels semiquantitativer RT-PCR-Analysen näher untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle bisher bekannten 10 Fzds auch in MSC exprimiert werden, dieses jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Zudem ergaben Wnt3a-Stimulationsexperimente in hMSC, dass die Expression von Fzd8 negativ durch Wnt3a beeinflusst wird. Um die Bedeutung von Fzd8 näher zu evaluieren, wurden daher Fzd8-Knockdown-Experimente durchgeführt. Diese ließen erkennen, dass die hMSC-Proliferation maß-geblich von der Fzd8-Expression abhängt, wobei allerdings Fzd8 keinen direkten Rezeptor für Wnt3a darstellt. Zusammenfassend spiegeln die in der vorliegenden Promotionsarbeit erhobenen Daten zum Teil eindeutige Unterschiede zwischen basalen Wnt-regulierten Prozessen in hMSC und mMSC wider, denen insbesondere bei der präklinischen Validierung von therapeutischen Strategien in Maus-modellen eine tragende Rolle zukommt. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg maßgeblich an der Steuerung des invasiven Verhaltens von hMSC beteiligt ist, wie dies in ähnlicher Weise von anderen Forschergruppen auch für die Metastasierung von Tumorzellen nachgewiesen werden konnte, erscheint es zukünftig von vorrangigem Interesse, die hier erhobenen in vitro-Daten in einem in vivo-Mausmodell zu evaluieren. In diesem Kontext kann allerdings nur durch einen komparativen Ansatz, wie er dieser Arbeit zugrunde liegt, die Basis für ein Spezies-relevantes drug design bezüglich des Wnt-Signalweges entwickelt werden, um schließlich aussagekräftige Stamm-zelltherapien bzw. Anti-Tumorstrategien entwickeln zu können.

Die Anwendung eines Hämoperfusionsverfahrens zur Lipidadsorption hat spezielle Kriterien der Biokompatibilität zu erfüllen, hierzu gehören das Fehlen von Interaktionen mit Erythrocyten, Leukocyten und Thrombocyten; die Abwesenheit von Hämolyse und Aktivierung der Gerinnung und Thrombosierung sowie Ausbleiben einer Komplement- oder Kinin-Kallikrein-Reaktion. Die direkte Adsorption von Lipoproteinen durch das DALI-Verfahren ist eine etablierte, vollblutkompatible, sichere, effektive und biokompatible Therapieoption zur Behandlung der Hyperlipoproteinämie. Modifikationen des etablierten und zugelassenen DALI-Systems müssen vor Anwendung in der Routinebehandlung nachweislich vergleichbare Eigenschaften aufweisen. Im standardisierten Verfahren erfolgt die erforderliche Antikoagulation mittels kombinierter Gabe eines Heparin-Bolus (20 IE/ kg KG) und kontinuierlicher Citratzumischung im Verhältnis von 1:20. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Modifikationen der standardisierten Antikoagulation getestet. Unter Reduktion der Citratdosis auf ein Verhältnis von 1:40 bei gleichzeitiger Erhöhung des initialen Heparinbolus (60 IE/kg KG) konnte im Vergleich zur etablierten DALI-Apherese eine vergleichbar gute Effektivität des Verfahrens nachgewiesen werden. Die gemäß NUB-Richtlinien geforderte Absenkungsrate für LDL-Cholesterin über 60% konnte sowohl mittels modifizierter als auch etablierter Apherese erreicht werden. Die diskreten Vorteile des etablierten Verfahrens in der Absenkung des LDL-Cholesterins (69% vs. 62%), Gesamt-Cholesterins (57% vs. 53%) und des Lipoprotein (a) (70% vs. 66%) erscheinen klinisch nicht relevant. Die klinische Sicherheit beider Verfahren zeigte sich unbedenklich und ergab im Vergleich keine Unterschiede. Der Verlust an ionisiertem Calcium war bei Anwendung der modifizierten Antikoagulation erwartungsgemäß geringer (5% vs. 18%), klinisch resultierten daraus jedoch keine Unterschiede bezüglich der Verträglichkeit der Apheresen. Die Antikoagulation war bei Anwendung beider Antikoagulationsregime sicher und ausreichend gut, eine Aktivierung der plasmatischen Gerinnung gemessen anhand der Thrombin-Antithrombin-Komplexe fand in beiden Untersuchungsarmen nicht statt. Die Biokompatibilität beider Verfahren zeigte sich in der beschriebenen Studie vergleichbar zufriedenstellend. Zeichen der Hämolyse waren nicht detektierbar, Erythrocyten-, Leukocyten- und Thrombocytenzahlen waren bei Anwendung beider Verfahren im Wesentlichen vergleichbar stabil. Eine Aktivierung des Komplementsystems fand weder bei Durchführung des Standardverfahrens noch bei Modifikation des Antikoagulationsregimes statt. Eine relevante Aktivierung von Thrombocyten, detektiert mittels -Thromboglobulin, der polymorphnukleären Granulocyten (Elastase) oder der Monocyten konnte jeweils ausgeschlossen werden. Die Modifikation der Gerinnungshemmung aktivierte im tolerablen und vorbekannten Umfang das Kinin-Kallikrein-System, entscheidende Unterschiede zum etablierten Verfahren waren nicht nachweisbar. Aufgrund dieses Phänomens ist eine gleichzeitige Therapie mit ACE-Inhibitoren und DALI kontraindiziert. Insgesamt kann die untersuchte Modifikation der Antikoagulation bei DALI bedenkenlos in der klinischen Routine eingesetzt werden. Auch die Untersuchungen zu DALI ohne Gabe des etablierten initialen Heparin-Bolus und kontinuierlicher ACD-A Gabe im Verhältnis 1:20 zeigte sich klinisch sicher und bedenkenlos. Bedingt durch das dauerhafte ACD-A-Verhältnis 1:20 wurde im Vergleich zur historischen Kontrollgruppe eine geringere Konzentration ionisierten Calciums reinfundiert. Diese Tatsache bedarf ein besonderes Augenmerk bei Patienten, die zur Hypocalciämie neigen. Patienten, die eine orale Antikoagulation mit Phenprocoumon erhielten, wiesen eine ausreichend gute Antikoagulation währen der heparinfreien DALI-Apherese auf, die Aktivierung der plasmatischen Gerinnung fiel gering und vergleichbar zum Kontrollkollektiv aus. Bei Patienten ohne orale Antikoagulation zeichnete sich eine mäßige Aktivierung der plasmatischen Gerinnung durch die heparinfreie DALI-Apherese ab, jedoch ohne offensichtliche Relevanz. Dennoch gebietet die Durchführung des Verfahrens ohne Heparin Vorsicht. Die Zellzahlen für Thrombocyten, Leukocyten und Erythrocyten blieben auch ohne Gabe von Heparin stabil, eine Hämolyse bei heparinfreier Antikoagulation fand nicht statt. Eine klinisch relevante Aktivierung der Thrombocyten oder PMN-Granulocyten konnte nicht nachgewiesen werden. Die durch die negativ geladene Oberfläche des DALI-Adsorbers bedingte Aktivierung des Kallikrein-Kinin-Systems (Bradykinin) wurde durch das heparinfreie Verfahren nicht nennenswert verändert und hatte keine klinischen Nebenwirkungen zur Folge. Das Komplementsystem erfuhr keine evidente Aktivierung durch Weglassen des Heparins bei DALI. Die Effektivität der DALI-Apherese ohne Heparin ist vergleichbar zum etablierten Verfahren, LDL-Cholesterin konnte im Mittel um 65% gesenkt werden, Lp(a) um 62%.

Die vorliegende Arbeit wurde durch den SFB 369 (Teilprojekt B7) unterstützt. Sie sollte auf Basis der bereits vorliegenden Erkenntnisse klären, welcher Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Ajoen in HL-60 Zellen zu Grunde liegt. Dirsch et al. 5 zeigten bereits 1998, dass Ajoen Apoptose in humanen akut-myeloischen Leukämiezellen (HL-60) induziert. Weiterhin zeigte sich eine dosis- und zeitabhängige Produktion der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N-Acetylcystein (NAC), ein Antioxidans, verhinderte partiell die Ajoeninduzierte ROS-Produktion und die Apoptose. Auf dieser Grundlage konnten folgende Ergebnisse erarbeitet werden: 1) Ajoen verursacht in HL-60 Zellen die Aktivierung der Caspase-3 sowie der Caspase-8. Eine generelle Aktivierung von Caspasen ist für die Ajoen-induzierte Apoptose nötig, da der Breitbandcaspaseinhibitor z-VAD-fmk die durch Ajoen provozierte DNA-Fragmentation völlig verhindert. 2) Die Ajoen-induzierte Apoptose wird nicht durch den Todesrezeptor CD95 vermittelt. Dafür sprechen folgende Ergebnisse: a) Unsere HL-60 Zellen exprimieren den CD95-Rezeptor, jedoch kann der natürliche CD95-Ligand (CD95L) keine Apoptose hervorrufen. Wahrscheinlich ist der CD95-Rezeptor inaktiv. b) Außerdem kann für die Caspase-8, die für die Signalweiterleitung vom CD95-Rezeptor u.a. mit verantwortlich ist, durch Einsatz eines spezifischen Caspase-8 Inhibitors keine Bedeutung für die Ajoeninduzierten Apoptose gezeigt werden. c) CD95-resistente Jurkat Zellen (JurkatR) sind auf Ajoen genauso empfindlich wie die Kontrollzellen. 3) Es konnte bewiesen werden, dass Ajoen Apoptose über den mitochondrialen Signalweg induziert: a) Ajoen verursacht sowohl den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials der inneren Membran als auch eine Cytochrom c- Freisetzung aus dem intermembranären Spalt. b) Die Ajoen-induzierte Apoptose hängt von der provozierten mitochondrialen Dysfunktion ab: HL-60 Zellen, die das anti-apoptotische Protein Bcl-xL überexprimieren, sind vor Apoptose geschützt. c) Die höhere Sensitivität der HL-60/neo bzw. die niedrigere Sensitivität der HL-60/bcl-xL Zellen auf Ajoen konnte auch morphologisch durch TEM-Untersuchungen untermauert werden. Zusammenfassend konnte also für die Ajoen-induzierte Apoptose eine von Mitochondrien abhängige Signalweiterleitung gezeigt werden. 4) Untersuchungen zur Frage, wie es zur Ajoen-induzierten mitochondrialen Dysfunktion kommt, brachten folgende Erkenntnisse: a) Eine Aktivierung von Caspasen ist für die Auslösung der mitochondrialen Ereignisse nicht notwendig. Die abgeschwächte und verzögerte Caspaseaktivierung in HL-60/bcl-xL Zellen beweist: Caspasen werden „downstream“ der mitochondrialen „Aktivierung“ gespalten. b) Die ROS-Entstehung ist ein Ereignis vor („upstream“) der mitochondrialen Dysfunktion. c) Die folgerichtige Untersuchung der MAPK JNK, p38 und ERK1/2 (die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 war bereits bekannt), ergab deren Aktivierung, jedoch ist diese für die Signalvermittlung nicht nötig. Nur für die ERK1/2 Kinase konnte eine direkte Beteiligung, und zwar als „survival“-Faktor, festgestellt werden, während die Akt als „survival“- Faktor keine Bedeutung hat. Ergebnisübersicht: CD95 Caspase-8 ROS p 38 MAPK ERK1/2 JNK Akt DNA- Fragmentierung Apoptose Caspase-3 Caspase-8 Aktivierung Caspase-3- ähnlicherCaspasen z-VAD-fmk Cytochrom c- Freisetzung z-VAD-fmk AP-1 Extrinsischer intrinsischer Signalweg Signalweg Bcl-xL Ajoen Abb. 61: Ergebnisübersicht Rot:-- Involvierung im Signalweg, blau:-- kein kausaler Zusammenhang gegeben; –I = Hemmung.