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Trotz verbesserter Therapiemöglichkeiten ist die Prognose beim Fibrosarkom der Katze noch immer ungünstig. In der vorliegenden Arbeit sollte die Verträglichkeit eines neuen Therapieansatzes zur Behandlung des felinen Fibrosarkoms untersucht werden. Verwendet wurde ein nonviraler Gentransfer mittels Magnetofektion, um eine Transfektion mit dem felinen Zytokingen GM-CSF zu erreichen. Ziel der durchgeführten Phase-I-Studie war die Festlegung einer maximalen tolerierten Dosis. In die prospektive Dosis-Eskalations-Studie wurden Katzen, die definierte Einschlusskriterien erfüllten, aufgenommen. Die Steigerung der Dosis des Plasmids, das für feGM-CSF kodiert, erfolgte in vier festgelegten Schritten (50, 250, 750 und 1250 µg Plasmid). Jeweils vier Katzen wurden in eine Dosisgruppe aufgenommen. Die Plasmide wurden in wässriger Lösung in einem 1:1-Verhältnis mit magnetischen Nanopartikeln gemischt, die zur besseren Bindung an die DNA mit Polyethylenimin beschichtet waren. Die Plasmidlösung mit einem Volumen von 500 µl wurde intratumoral injiziert. Danach wurde durch Applikation eines Neodymium-Eisen-Bor-Magneten auf das Tumorgebiet ein Magnetfeld für die Dauer einer Stunde angelegt. Durch diese Magnetofektion wurde die Transfektion auf das Tumorgebiet beschränkt, sowie die Effektivität des Gentransfers verbessert. Das Behandlungsprotokoll umfasste zwei intratumorale Injektionen an den Tagen -14 und -7 sowie die großräumige en-bloc-Resektion des Fibrosarkoms an Tag 1. Eine Kontrollgruppe bestehend aus vier Katzen wurde ohne Zusatztherapie einer Operation unterzogen. Aus ethischen Gründen wurde dabei auf eine Verzögerung der chirurgischen Entfernung durch Placebo-Applikationen im Zeitraum von 14 Tagen verzichtet. Eine Untersuchung auf mögliche auftretende Toxizitäten erfolgte an den Tagen -7, 0, 14, 45, 90 und 180. Zwei weitere Untersuchungen an den Tagen 270 und 360 dienten zur Kontrolle auf Rezidiv- und Metastasenbildung. Aufgetretene klinische oder hämatologische Toxizitäten wurden anhand eines speziellen Nebenwirkungskatalogs (VCOG-CTCAE-Tabelle) erfasst und in Korrelation zur durchgeführten Therapie gestellt, um über eine Zuordnung als Nebenwirkung entscheiden zu können. Ein statistischer Vergleich erfolgte für die Parameter Körpergewicht, Leukozytenzahl und das Differentialblutbild zwischen Kontrollkatzen, behandelten Katzen und den Katzen der verschiedenen Dosisgruppen. Sieben weitere Katzen wurden mit derselben Gentherapie mit humanem GM-CSF behandelt, bei denen der Expressionsachweis von huGM-CSF mittels ELISA in den Zellkulturüberständen der angezüchteten Tumore gelang. In den ersten drei Dosisgruppen traten keine schwerwiegenden Nebenwirkungen auf. Da bei drei der vier Katzen der höchsten Dosis leichte Nebenwirkungen beobachtet wurden, wurden zwei weitere Katzen mit der höchsten Dosis behandelt. Dabei traten jedoch keine Toxizitäten auf, so dass die Dosis von 1250 µg für feGM-CSF kodierendes Plasmid als sichere, gut verträgliche Dosis für nachfolgende Phase-II-Studien festgelegt werden konnte. Auch die beobachteten Ergebnisse bezüglich Rezidivrate sind als sehr viel versprechend einzustufen.

Erufosin (Erucylphosphohomocholin, ErPC3) ist ein neuer Wirkstoff aus der Substanzklasse der Alkylphosphocholine, deren Angriffspunkt nicht die DNA, sondern die Zellmembran ist. Die Alkylphosphocholine lagern sich dort ein, beeinflussen die Lipidzusammensetzung, den Lipidmetabolismus und agieren durch Beeinflussung von intrazellulären Signalwegen unter anderem als Apoptoseinduktoren. Seit Januar 2004 wird mit Erufosin eine Phase I Studie durchgeführt (Dr. med. Lars Lindner, Medizinische Klinik und Poliklinik III, Klinikum Großhadern, LMU München, unpubliziert). Nach Abschluss der Studie wird sich für die folgenden Phase II Studien die Frage nach möglichen Kombinationsmöglichkeiten mit klassischer Chemotherapie oder auch Strahlentherapie stellen. Aufgrund der fehlenden myelosuppressiven Aktivität und der bislang guten Verträglichkeit (fehlende gastrointestinale Toxizität) eignet sich Erufosin insbesondere als Kombinationspartner für weitere toxische Therapieprinzipien wie z.B. Strahlentherapie. Für verschiedene andere, zum Teil bereits klinisch eingesetzte Alkylphosphocholine (Miltefosin®, Perifosin®) konnte in vitro gezeigt werden, dass sie die strahleninduzierte Apoptose verstärken und das klonogene Gesamtüberleben reduzieren, beides zum Teil sogar synergistisch. Eine Phase I Studie zum Einsatz von Strahlentherapie und Perifosin® wurde in den Niederlanden durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine gute Verträglichkeit der Kombinationsbehandlung (Vink, Schellens et al. 2006). In dieser Arbeit wurde anhand von Zellkulturexperimenten an 14 humanen Zelllinien von für Strahlentherapie in Frage kommenden Tumorentitäten die Kombinationswirkung von Erufosin und Strahlentherapie untersucht. Um die Bestimmung des klonogenen Überlebens zu simulieren wurde das WST1-Zellproliferationsassay verwendet. Die Tumorzellen wurden in einer 96-well-Platte ausgesät, mit Erufosin und Bestrahlung behandelt und die Zellzahl nach 5-8 Tagen Inkubation mit WST1-Reagenz gemessen. Dabei handelt es sich um eine Substanz, die von lebenden Zellen verstoffwechselt wird und der Metabolit photometrisch mit dem ELISA-Reader bestimmt werden kann. Zusätzlich wurde bei 6 Zelllinien die Auswirkung der Kombinationsbehandlung auf die frühe Apoptoseinduktion untersucht. Hierzu wurden die Zellen ausgesät, behandelt und nach 48h mit Propidiumiodid und Hoechst 33342 angefärbt. Die Auswertung erfolgte durch Auszählung der apoptotischen Zellen am Fluoreszenzmikroskop. Zur Quantifizierung der Kombinationseffekte wurde die isobolographische Analyse eingesetzt. Alle untersuchten Zelllinien zeigten in unterschiedlicher Empfindlichkeit ein Ansprechen auf Bestrahlung und Erufosin. Die Strahlenwirkung konnte durch Zugabe von Erufosin verstärkt werden, so dass das mehr Tumorzellen abstarben bzw. die frühe Apoptoseinduktion zunahm. In der isobolographischen Analyse ergaben sich subadditive bis additive Effekt. Besonders empfindlich für die Kombinationsbehandlung zeigten sich mit additiven Effekten A-549 (Bronchial-Ca), MCF-7 (Mamma-Ca), SK-LMS1 (Leiomyosarkom), NCI-H460 (Bronchial-Ca), DU-145 (Prostata-Ca), RD-ES (Ewing-Sarkom), KB (Zervix-Ca), FADU (Pharynx-Ca). Angesichts der Verstärkung des Strahleneffekts im Bezug auf Gesamtüberleben, der frühen Apoptoseinduktion bei Tumorzellen und dem bisher viel versprechenden Einsatz in der Klinik sollte die Kombination aus Erufosin und Strahlentherapie experimentell und klinisch weiter evaluiert werden.

Die koronare Herzkrankheit (KHK) stellt momentan die häufigste Krankheits- und Todesursache in Europa dar. Häufig kommt es als Folge einer KHK zum akuten Myokardinfarkt mit den gefürchteten Folgen, wie kardiogenem Schock und plötzlichem Herztod. Während sich die etablierten konservativen Therapiestrategien bislang auf eine Verminderung des pathologischen Remodellings beschränken, gewinnt die Forschung an alternativen Therapiemöglichkeiten zur längerfristigen Regeneration des geschädigten Myokards zunehmend an Bedeutung. Ein neuer bisher noch nicht zur Therapie des Herzinfarkts eingesetzter Kandidat könnte das Parathormon (PTH) sein. Dessen Fragment PTH (1-34) befindet sich bereits seit Jahren im klinischen Einsatz zur Bekämpfung schwerer Osteoporosen. Im Tiermodell verbesserte PTH durch Steigerung des myokardialen Blutflusses die Herzfunktion und verhinderte dadurch die Ausbildung eines kardiogenen Schocks. Kürzlich konnte darüber hinaus im Mausmodell gezeigt werden, dass PTH die Stammzellnische im Knochenmark reguliert. So führte die PTH-Gabe zu einem Anstieg verschiedener Stammzellpopulationen im Knochenmark und verminderte bei bestrahlten Mäusen nach Knochenmarktransplantation signifikant deren Mortalität. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von PTH (1-34) auf die Mobilisation von Knochenmarkstammzellen ins periphere Blut sowie mögliche Effekte auf Pumpfunktion und Remodelling nach akutem Myokardinfarkt im Mausmodell zu untersuchen. Die Behandlung mit PTH (1-34) führte zu einer Mobilisation verschiedener Stammzellpopulationen aus dem Knochenmark ins periphere Blut. Dabei kam es nach PTH-Gabe im Gegensatz zu Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) nicht zum Abfall von CD45+/CD34+ Stammzellen im Knochenmark. Nach chirurgisch induziertem Myokardinfarkt führte die Gabe von PTH zu einer signifikanten Abnahme der Mortalität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Dies war bei den PTH-Tieren assoziiert mit einer signifikanten Verbesserung der globalen Herzfunktion. So waren das Herzzeitvolumen und die Auswurffraktion nach PTH-Gabe deutlich gesteigert. Wir konnten anhand einer erniedrigten arteriellen Nachlast in den hämodynamischen Untersuchungen zeigen, dass PTH am arteriellen Gefäßbett zu einer Vasodilatation führt. Über diesen bekannten Einfluss von PTH auf den arteriellen Gefäßwiderstand kommt es zu einem gesteigerten myokardialen Blutfluss. Dadurch verbessert PTH in der Akutphase nach akutem Myokardinfarkt die Herzfunktion und schützt vor einem akuten Herzversagen. Auf histologischer Ebene fanden sich nach PTH-Behandlung kleinere Infarktgrössen und eine verminderte Abnahme der linksventrikulären Vorderwand im Vergleich zu den Kontrolltieren. Diese Veränderungen im Remodelling nach PTH-Behandlung waren durch eine Zunahme von CD31+ Kapillaren in der Grenzzone um den Infarkt (Borderzone) erklärbar. Die Gefäßneubildungen waren assoziiert mit einer gesteigerten Expression von Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) sowie des Insulin like Growth Factor-1 (IGF-1)-Rezeptors in der Borderzone. PTH bewirkt somit entweder direkt oder indirekt über die Mobilisation von Knochenmarkstammzellen eine vermehrte Sekretion von vaskulären Wachstumstumsfaktoren wie VEGF und IGF-1. So kommt es nach akutem Myokardinfarkt im Mausmodell zu einem abgeschwächten „Remodelling“ mit konsekutiver Verbesserung der myokardialen Pumpfunktion. Neben weiterer Untersuchungen bezüglich der Mechanismen, über die PTH zu den gezeigten Veränderungen im kardialen Remodelling führt, müßte in einem nächsten Schritt geklärt werden, ob PTH (1-34) beim Menschen in der zur Osteoporosebehandlung üblichen Tagesdosis von 20-40 µg oder in konsekutiv höheren Dosierungen zur Freisetzung verschiedener Populationen von Knochenmarkstammzellen ins periphere Blut führt (Phase I Studie).

Thu, 23 Mar 2006 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5156/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/5156/2/Schaffer_Moshe.pdf Schaffer, Moshe

Das feline Fibrosarkom hat mit einer Rezidivneigung von bis zu 70 % nach alleiniger chirurgischer Entfernung eine ungünstige Heilungsprognose. Auch adjuvante Chemo- oder Strahlentherapien führen nur in 42 % der Patienten zu einer rezidivfreien Zeit von über einem Jahr. In der vorliegenden Arbeit soll ein nonvirales Gentransfersystem etabliert werden, bei dem erstmalig eine Kombination aus drei felinen Zytokin-Genen zur adjuvanten Immunstimulation nach Tumorexstirpation beim Fibrosarkom der Katze eingesetzt wird. Ziel dieser Studie ist die Festlegung einer maximal tolerierten Dosis. Mit Hilfe eines Nebenwirkungskataloges, der auf der Common-Toxicity-Criteria-Tabelle des National Cancer Instiute basiert, werden klinische wie auch labordiagnostische Parameter objektiv erfasst und in Relation zur Therapie gestellt. Nach definierten Aufnahmekriterien werden Katzen mit Fibrosarkomen von prak-tischen Tierärzten an die Medizinische Kleintierklinik überwiesen. Es werden nur Tiere in die Studie aufgenommen, deren Tumoren (Primärtumor oder Rezidiv) am Rumpf lokalisiert sind. Die Tumorexstirpation muss in einer Sitzung möglich sein und darf dabei weder zu einer Gliedmaßenamputation noch zur Eröffnung einer Körperhöhle führen. Katzen, bei denen Hinweise auf Metastasen oder eine andere schwere Krankheit vorliegen, sowie Tiere, die bereits zuvor mit einer Chemo-, Strahlen- oder Gentherapie behandelt wurden, können nicht in die Studie aufge-nommen werden. Nach Tumorexstirpation wird den Tieren ein Kollagenschwamm in das Tumorbett implantiert. Dieser Kollagenschwamm trägt Plasmide, die jeweils für feIL-2, feIFNγ und feGM-CSF kodieren. Die Plasmid-DNA ist zusätzlich an Polyethylenimin (PEI) assoziiert und mit einem Hüllpolymer (P6YE5C) ummantelt. Insgesamt werden 15 Tiere in vier verschiedenen Dosisgruppen therapiert. Gruppe I (n=3) mit 75 μg je Plasmid, Gruppe II (n=3) mit 150 μg je Plasmid, Gruppe III (n=6) mit 300 μg je Plasmid und in Dosisgruppe IV (n=3) mit 600 μg je Plasmid. Als Ver-gleichsgruppe gelten vier Katzen, die unter gleichen Bedingungen nur mit einer en bloc Resektion behandelt werden. In die Studie werden 15 Katzen (mk=9, wk=6) im Alter zwischen drei und 15 Jahren aufgenommen. Die Fibrosarkome sind häufiger im Interscapularbereich lokalisiert. Bei keinem Patienten kommt es zu therapiebedingten Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens. Drei Katzen entwickeln postoperativ ein Serom, das ohne thera-peutisches Eingreifen resorbiert wird. Systemische Veränderungen, die auf die Therapie zurückgeführt werden, manifestieren sich erst in Dosisgruppe IV mit einem Abfall der Lymphozytenpopulation. Dabei fallen in einem Zeitraum bis 45 Tage nach Implantation des Kollagenschwammes die Lymphozyten bis zu 70 % des Ausgangs-wertes ab. Bei dieser Phase I-Studie handelt es sich um eine Dosisfindungsstudie. Diese wird durch das Auftreten erster Nebenwirkungen, die auf das Transgen oder auf dessen Expressionsprodukt zurückgeführt werden können, beendet. Die maximal tolerierte Dosis wird somit in vorliegender Studie auf 600 μg je Zytokin-Plasmid festgesetzt.

Die vorliegende Studie war zunächst als eine klinische Studie der Phase II geplant, in der mit einer Dosis von 5x108 IU AdV-hIL-2 und AdV-feIFNg eine intratumorale immunstimulierende Therapie bei Katzen mit Fibrosarkom durchgeführt werden sollte. Als Ausgangsdosis orientierte man sich dabei an der von WIELAND (2002) erprobten Dosis von je 5x108 IU rekombinanten viralen Vektoren (AdV-hIL-2 bzw. AdV-feIFNg). Durch das Auftreten starker Toxizitäten musste die Studie abgebrochen werden. Daher wurde eine klinische Studie der Phase I durchgeführt, bei der sowohl der Zeitpunkt als auch die Dosierung der Therapie verändert wurden. Ziel der Studie war es, anhand einer Dosisfindung die maximal tolerierbare Dosis der präoperativen intratumoralen immunstimulierenden Therapie mit AdV-hIL-2 und AdV-feIFNg herauszufinden. Dazu wurde insgesamt 20 Tiere zusätzlich zur chirurgischen Entfernung des Tumors mit einer Dosis von je 1x107 IU bis 5x108 IU Virus behandelt, wovon jeweils drei Patienten die Dosis 1x107 IU, 5x107 IU und 1x108 IU und 11 Patienten die Dosis von 5x108 IU erhielten. Acht Katzen wurden als Kontrolltiere ausschließlich einer chirurgischen Therapie unterzogen. Alle Katzen wurden im Verlauf der Studie regelmäßig tierärztlich untersucht und alle dabei erfassten klinischen, hämatologischen und klinisch-chemischen Parameter in einer CTC-Tabelle erfasst und hinsichtlich ihrer Toxizität bewertet. Zusätzlich wurden von allen Katzen der höchsten (5x108 IU AdV-hIL-2 und AdV-feIFNg) und zweithöchsten (1x108 IU AdV-hIL-2 und AdV-feIFNg) sowie von einer Katze der 5x107 IU AdV-hIL-2 und AdV-feIFNg-Dosierungsgruppe die Serum-hIL-2-Spiegel bestimmt. Erst bei der höchsten und klinisch schlecht tolerierten Dosis von 5x108 konnte die Transgenexpression mit Abschwemmung von IL-2 in den Blutkreislauf durch messbare Serum-Interleukin-2-Spiegel nachgewiesen werden. Als auftretende Toxizitäten konnten Erhöhung der Körpertemperatur, Gewichtsreduktion, Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens, Abnahme des Hämatokrits, Thrombozytopenie und Leukozytopenie beobachtet werden. Anhand dieser Ergebnisse hat sich eine Dosis von je 1x108 IU AdV-hIL-2 und AdV-feIFNg als von den Patienten gut tolerierte Dosis herausgestellt. Diese Dosis wurde im Anschluss in einer klinischen Studie der Phase II auf ihre Wirksamkeit geprüft.