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Effective control of acute myeloid leukaemia and acute lymphoblastic leukaemia progression by telomerase specific adoptive T-cell therapy Full Text- https://tinyurl.com/yb3gjwqs Telomerase (TERT) is a ribonucleoprotein enzyme that preserves the molecular organization at the ends of eukaryotic chromosomes. Since TERT deregulation is a common step in leukaemia, treatments targeting telomerase might be useful for the therapy of hematologic malignancies. Despite a large spectrum of potential drugs, their bench-to-bedside translation is quite limited, with only a therapeutic vaccine in the clinic and a telomerase inhibitor at late stage of preclinical validation. We recently demonstrated that the adoptive transfer of T cell transduced with an HLA-A2-restricted T-cell receptor (TCR), which recognize human TERT with high avidity, controls human B-cell chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL) progression without severe side-effects in humanized mice. In the present report, we show the ability of our approach to limit the progression of more aggressive leukemic pathologies, such as acute myeloid leukaemia (AML) and B-cell acute lymphoblastic leukaemia (B-ALL). Together, our findings demonstrate that TERT-based adoptive cell therapy is a concrete platform of T cell-mediated immunotherapy for leukaemia treatment. Facebook - bit.ly/2xznxjV Twitter - bit.ly/2xzWvsu LinkedIn - bit.ly/2xzJ6kc Pintrest - bit.ly/2xzX8SS Reddit - bit.ly/2hoxI0N www.Oncotarget.com

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.

EBV ist ein Herpesvirus, welches in über 90% aller Erwachsenen nachgewiesen werden kann und in den wenigsten Fällen Beschwerden verursacht. Unter bestimmten Umständen kann es aber zur Ausbildung einer Infektiösen Mononukleosekommen und auch an der Entstehung einer Reihe von Krebserkrankungen, allenvoran die PTLD (posttransplant lymphoproliferative disease), das Burkitt- und das Hodgkin-Lymphom, ist EBV ursächlich beteiligt. Trotz zahlreicher Bemühungen und einiger vielversprechender Ansätze ist bis heute kein wirksamer Impfstoff gegen das Epstein-Barr Virus vorhanden. Im Bereich Exosomen als Mittel zur Induktion von Immunantworten wird seit gut 10 Jahren geforscht und ihre Wirksamkeit konnte bereits in klinischen Studien zur Behandlung mehrerer Krebsarten getestet werden. In dieser Doktorarbeit wurden HEK 293-Zellen und ein auf diesen Zellen basierendes Verpackungssystem für virale Vektoren auf ihre Eignung hin untersucht, rekombinante Exosomen und Virus-like-Particles (VLPs) zu produzieren, welche eventuell als DNA-freies Vakzin gegen EBV eingesetzt werden könnten. In EBV-positiven Verpackungszelllinien konnte durch Induktion des lytischen EBV-Zyklus die Freisetzung DNA-freier VLPs erreicht werden. Genau wie Exosomen aus 293-Zellen, die zuvor mit Expressionsplasmiden für EBV-Antigene transfiziert worden waren, konnten sie aus dem Zellkulturmedium aufgereinigt werden. Ihr großes immunogenes Potential zeigte sich bei der Reaktivierung von EBV-spezifischen TZellklonen und Gedächtnis-T-Zellen aus PBMCs, wo bereits geringe Mengen für eine Stimulation ausreichten. Zu der hohen Effizienz der Partikel trug ihr Tropismus bei, der auf virale Glykoproteine, vor allem gp350, zurückzuführen war. Die Partikel besaßen dadurch eine Affinität zu B-Zellen, über die effizient die Präsentation der Exosomen und Virus-like-Particles erfolgte. Auch in in vivo-Versuchen, bei denen mit dem hu-PBMC-Rag-Mausmodell und dem MHV-68-Mausmodell gearbeitet wurde, konnten durch Immunisierung mit Exosomen bzw. Virus-like-Particles virusspezifische humorale wie zelluläre Imunantworten ausgelöst werden. In Stimulationsexperimenten von malignen Zellen aus Patienten mit chronisch lymphatischer B-Zellleukämie (B-CLL) konnte ich weiterhin zeigen, dass Exosomen und VLPs auch als Überträger funktioneller Moleküle wie den CD40L, einem Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor-Familie, fungieren können. Dieser bewirkte in den sonst nicht immunogenen und deshalb vom Immunsystem nicht erkannten CLL-Zellen eine verstärkte Expression kostimulatorischer, Adhäsions- und apoptoseassoziierter Moleküle. Auf diese Weise war es möglich, autologe Tumor- und EBV-spezifische T-Zellen zu reaktivieren. Exosomen und Virus-like-Particles könnten deshalb bei der Behandlung der B-CLL eine vielversprechende Alternative zur Gentherapie darstellen.

Trotz eines breiten Spektrums an konventionellen Therapieoptionen stößt die Behandlung von Krebserkrankungen in der modernen Medizin oftmals an ihre Grenzen. Eine Möglichkeit, diese Limitationen zu überwinden, bietet der Einsatz innovativer therapeutischer Ansätze, wie etwa der Immuntherapie. Vielversprechendes Potenzial auf diesem Gebiet bieten Dendritische Zellen (DZ), welche auf Grund ihrer zentralen Rolle als „Wächter des Immunsystems“ eine Schlüsselstellung in der Modulation der Immunantwort einnehmen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob durch Vakzinierung mit dendritischen Zellen Immunantworten gegen Zellen der chronischen lymphatischen B-Zell-Leukämie (B-CLL) erzeugt werden können. Ein Teil der Arbeit bestand darin, Tumorzellen mit humanen DZ zu fusionieren und das immuntherapeutische Potential dieser Strategie in vitro zu evaluieren. Darüber hinaus wurde anhand eines murinen B-Zell-Lymphoms in vivo und in vitro untersucht, welche weiteren Immunzellen durch die Vakzinierung mit DZ aktiviert werden und wie das Zusammenspiel dieser Zellen mit den DZ zu einer effizienten Antitumorantwort beiträgt.

Die chronische lymphatische Leukämie ist die häufigste Leukämie im Erwachsenenalter in den westlichen Ländern. Erkenntnisse der letzten Jahre haben das Spektrum verfügbarer Therapien deutlich erweitert, kurativ ist bisher nur die allogene Knochenmarkstransplantation. Im Blut der betroffenen Patienten treten die Zellen des malignen Klons in Kontakt mit autologen Immuneffektorzellen. Gentherapeutische Strategien basierend auf dem Transfer immunstimulatorischer Moleküle eröffnen deshalb neue Perspektiven für die Therapie der B-CLL. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals die Eignung eines Helfervirus-freien EBV-Genvektorsystems für den Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen beschrieben. Durch Optimierung der Vektorverpackung für ein eGFP kodierendes Plasmid konnte gezeigt werden, dass sich mit Hilfe einer Helfervirus-freien Verpackungszelline infektiöse Titer bis zu 2 x 106 infektiöse Partikel/ml generieren lassen. Das untersuchte Vektorsystem eignet sich für einen effizienten Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen. Auf eine CD40L-Stimulation, wie sie zur Verbesserung der Transfereffizienz von Adenoviren zur Anwendung kommt, kann dabei verzichtet werden. Der Gentransfer lässt sich mit Hilfe eines monokonalen Antikörpers gegen CD21 weitgehend neutralisieren. In Kontrollexperimenten mit Überständen aus der Verpackung TR-deletierter Genvektorplasmide sinkt die Gentransferrate auf Werte nahe der Nachweisgrenze. Nach Verpackung des therapeutischen Moleküls CD40L sinkt die Transfereffizienz gegenüber dem eGFP kodierenden Genvektor und vermehrt unspezifische Effekte werden beobachtet. Zu den charakteristischen Eigenschaften EBV abgeleiteter Genvektoren zählen ein Tropismus für B-Lymphozyten und eine grosse Verpackungskapazität, die den Transfer von Gensequenzen bis zu einer Grösse von 160 kb erlaubt. Als essentielle EBV-Elemente enthalten die Genvektoren nur die Verpackungssignale TR und den lytischen Replikationsorigin oriLyt. Zukünfte Entwicklungen des Vektorsystems haben zum Ziel das Risiko von Rekombinationsereignissen zu reduzieren, die zur Freisetzung replikationsfähiger Virusmutanten oder potentiell onkogener viraler Gene führen könnten.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.

Sat, 1 Jan 1994 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/6915/1/6915.pdf Thiel, E.; Raghavachar, A.; Ehlers, B.; Langenmayer, Irmgard; Zeigmeister, B.; Knauf, W. U.