Podcasts about psii

0:00 - The Avalanche and Nuggets rattled off another Double DUBaroo! They both started slow, but figured it out in time. 17:55 - The Nuggets did nothing at the trade deadline. Absolutely nothing. Nuggets GM Calvin Booth spoke to the media yesterday to address the lack of trades.35:11 - PSII won NFL's Defensive Player of the Year. Add that to Denver/Colorado's stacked trophy case in the past 365 days. 

0:00 - Jim Nantz texted Vic after his interview with us and had an...interesting way to describe our show.15:03 - PSII is confident in Denver's chances heading into Buffalo. How do we all feel about the upset?30:05 - What are the most compelling matchups in the NFL Wild Card Weekend?

0:00 - Avalanche goalie Scott Wedgewood suffered an injury in a collision with Zach Benson, who immediately scored while Wedgewood was hurt. It was a strange sequence of events that overshadowed an amazing comeback win for the Avalanche. 16:17 - One of our loyal listeners, who happens to be a Georgia fan, called in to let Vic put him in his place after Notre Dame's victory in the Sugar Bowl.30:37 - Pat Surtain is a legit contender to win NFL Defensive Player of the Year. That's hard to do as a DB. More often than not, it goes to a pass rusher. 

0:00 - The NFL can show off their flashy ratings from Christmas Day, but let's be real: the games this week have been awful.14:00 - Pat Surtain II covering Ja'Marr Chase on Saturday will be a clash of the titans. Let them fight!32:37 - Pat Shurmur (unsurprisingly) had high praise for Shedeur Sanders and Travis Hunter at Alamo Bowl media availability. He believes both players will have success at the NFL level. 

0:00 - The Nuggets lost to OKC by 30 last night at Ball Arena. Look, it's preseason. It doesn't matter. But can we please get another win in Denver? Somewhere? Somehow?16:45 - The Broncos can win tomorrow even without PSII! It's the perfect opportunity to win despite the depleted defense.35:01 - Halloween used to be better. Helicopter parents have ruined it. 

0:00 - Jamal Murray still hasn't inked a contract extension. Vic says that's fine. He has to earn it this year. Prove to us you deserve it. Why is that an insult these days?18:58 - CU @ Nebraska is one of the bigger games in a stacked CFB weekend.34:37 - Remember those 3 days when PSII was the highest-paid CB in NFL history? Good times.

0:00 - Which team has more at stake this weekend: CU or the Broncos? Would a win mean more for CU @ Nebraska or Broncos @ Seahawks?19:55 - Patrick Surtain II inked a new contract extension with the Broncos! PSII is staying in orange and blue where he belongs.34:14 - Moser weighs in on Leon Draisaitl's massive payday and what it could mean for Mikko Rantanen's contract. 

0:00 - USA crushed Serbia on the court in Olympics basketbal game #1. The fellas still find the squad arrogant unlikeable. It's hard to root for them, which pains us. 20:20 - Bo Nix looks poised at the podium while addressing the media at training camp. Brett loves it, but Moser and Vic are a little more cautious about buying the hype.35:46 - Now knowing everything we do, harnessing the power of hindsight, do you think the Broncos should've taken Justin Fields in the 2021 draft over Pat Surtain II?

0:00 - Moser's pissed at Alexa and Siri. Vic's in serious pain. Brett's frustrated with key fobs. Today's show hit the ground RUNNING.17:37 - Joel Klatt caught up with Colin Cowherd and shared his takeaways from the Prime era of CU. It's already been a massive success, but there are even higher highs to reach.35:25 - Justin Jefferson is now the highest-paid non-QB in NFL history. Who are some of the others? How will that affect PSII's next contract?

The PSII - Paranormal Supernatural Investigations Ireland with co-founders Richard and Anthony

References Plant Biochemistry lectures archives :Guerra Phys.Chem. Chem. Phys., 2020,22, 7912-7934 Nature Plants 2017. volume 3, Article number:17041 --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/dr-daniel-j-guerra/message

About Michael Coté and Payroll Solutions International Inc: I am the strategy leader to a World Wide team providing Employer Services for to SME and large companies, NGO's and Government organizations. We give these organizations the ability to function outside their home market at the same level as much larger companies. We provide compliance services in all aspects of setting up and operating the customer's entity outside their domestic operations. Our global platform is SECOND to none in the marketplace. We provide services in many common languages and over 100 currencies. We offer next day, Direct Deposit in 150 countries. Payroll Solutions International Inc. PSII offers Professional Employment Services as well as complete Human Capital Management. We enable organizations to outsource Payroll Processing, Time & Attendance, and Human Resources, Accounting and Professional Services within more than 80 countries. We design solutions specific to your business'​ needs and budgetary requirements. We offer our clients the flexibility of either managed, self serve payroll or payroll software licensing. We provide an intimate service structure which enables us the ability to provide designated, live service support. Whether it is basic payroll or a complete enterprise configuration, in a hosted environment, we can accommodate organizations of any size, in any jurisdiction, and in multi-lingual, multi-currency format. Upon request we are happy to provide a no cost analysis and proposal that will suit all your business needs. Global Payroll Management Together with our global partners, we leverage more than 75 years of experience. We deliver trusted results, transformative technology, and in-market expertise. Save time and money with our new generation of Human Resources, Time & Labour Management, and Payroll all tied together in one package. Our innovative and integrated approach provides multi-language, user friendly, web-based software systems; all available through any PC, mobile and tablet device. Our easy software implementation will support your entire organization and management needs anywhere in the world. Our ultimate focus is on building strong relationships and providing an outstanding customer experience with companies of all sizes, in all markets.

In this week's episode, Rod and Jal are joined by Jeff Hopkins, Founder and Principal Educator at the Pacific School of Innovation and Inquiry in British Colombia, Canada. Jeff has been an educator since 1993 and has experience as a teacher of English, English Literature, Social Studies, History, Psychology, Physics, Math, and Independent Directed Studies blending almost every discipline.Throughout the conversation topics include the idea of constructivism; how we can change the "grammar" of schooling; trying to define transformation so people know what it looks like, and Jeff shares success stories and lessons learned from his experience with PSII. http://www.deeperlearningdozen.org

In this episode, we’re catching up with AHRI’s Dr Heping Han to talk about some recent research he published on 2,4-D syngergising metribuzin. Australian farmers and agronomists have previously observed synergy between phenoxy herbicides, such as 2,4-D and PSII herbicides, also known as Group C or Group 3 herbicides such, as metribuzin. Thanks to this new AHRI research, we now know why this is the case. Dr Heping Han joins us to explain this research and what it means for farming systems. The Grains Research and Development Corporation (GRDC) invests $1.5 million in AHRI each year to ensure Australian grain growers have access to world class research in strategies to mitigate weeds and control herbicide resistance.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.18.344648v1?rss=1 Authors: Kato, K., Miyazaki, N., Hamaguchi, T., Nakajima, Y., Akita, F., Yonekura, K., Shen, J.-R. Abstract: Photosystem II (PSII) plays a key role in water-splitting and oxygen evolution. X-ray crystallography has revealed its atomic structure and some intermediate structures. However, these structures are in the crystalline state, and its final state structure has not been solved because of the low efficiencies of the S-state transitions in the crystals. Here we analyzed the structure of PSII in solution at 1.95 [A] resolution by single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM). The structure obtained is similar to the crystal structure, but a PsbY subunit was visible in the cryo-EM structure, indicating that it represents its physiological state more closely. Electron beam damage was observed at a high-dose in the regions that were easily affected by redox states, which was reduced by reducing the electron dose. This study will serve as a good indicator for determining damage-free cryo-EM structures of not only PSII but also all biological samples, especially redox-active metalloproteins. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.09.21.307322v1?rss=1 Authors: Miller, N. T., Vaughn, M. D., Burnap, R. L. Abstract: Cyclic electron flow (CEF) around Photosystem I is vital to balancing the photosynthetic energy budget of cyanobacteria and other photosynthetic organisms. The coupling of CEF to proton pumping has long been hypothesized to occur, providing proton motive force (PMF) for the synthesis of ATP with no net cost to [NADPH]. This is thought to occur largely through the activity of NDH-1 complexes, of which cyanobacteria have four with different activities. While a much work has been done to understand the steady-state PMF in both the light and dark, and fluorescent probes have been developed to observe these fluxes in vivo, little has been done to understand the kinetics of these fluxes, particularly with regard to NDH-1 complexes. To monitor the kinetics of proton pumping in Synechocystis sp. PCC 6803, the pH sensitive dye Acridine Orange was used alongside a suite of inhibitors in order to observe light-dependent proton pumping. The assay was demonstrated to measure photosynthetically driven proton pumping and used to measure the rates of proton pumping unimpeded by dark {Delta}pH. Here, the cyanobacterial NDH-1 complexes are shown to pump a sizable portion of proton flux when CEF-driven and LEF-driven proton pumping rates are observed and compared in mutants lacking some or all NDH-1 complexes. It is also demonstrated that PSII and LEF are responsible for the bulk of light induced proton pumping, though CEF and NDH-1 are capable of generating ~40% of the proton pumping rate when LEF is inactivated. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Jeff Hopkins is the creator and principal for the Pacific School of Innovation and Inquiry (PSII) located in downtown Victoria. In this episode, Hopkins explains why he chose to create this new high school to fill gaps in education using questions and quests and how it benefits students. Read more about PSII: https://learningstorm.org/

Have you ever wanted to start your own school? This discussion will have you wanting to rethink the way you approach education in your own classroom. My guest explores the importance of creating a school that values student voice, utilizes the inquiry process to prepare students for the uncertain future, and focuses on the importance of creating a psychologically safe classroom culture in order to foster creativity and innovation. Hope you love it as much as I did! Jeff Hopkins is the founder and Principal Educator of the Pacific School of Innovation and Inquiry – an independent high school in Victoria designed to provide a model for education system transformation. His ted talks: “Education as if people mattered" and “An inquiry approach to education” have earned him global attention. Find him by searching Pacific School of Innovation and Inquiry. For more information visit my website smallactbigimpact.com and search for episode # 8. He has been an educator since 1993. He has taught many different subjects, including literature, physics, history, and psychology, and has been a counsellor, principal, and school district superintendent, among other things. Jeff was BC’s first Safe Schools Coordinator, working to address issues of intimidation, harassment, anxiety, and suicide through programs that promote equitable, engaging, and welcoming school environments. Jeff is the founder and Principal Educator of the Pacific School of Innovation and Inquiry – an independent high school in Victoria designed to provide a model for education system transformation. Inspired by the notion of “consilience,” – the unity of knowledge -- PSII helps its learners to transcend traditional high school subject silos through an interdisciplinary, inquiry-based approach. He often refers to his approach as “Education as if people mattered.” This was also the title of his 2015 TEDx Victoria talk. In 2013-14, Jeff was the University of Victoria’s first “Educator in Residence,” offering support and inspiration to education students and faculty in their contemplation of what an education system could be. He was also named UVic’s Distinguished Alumnus for 2018. Jeff has been invited to present his ideas on education and schools at dozens of conferences throughout BC, in other provinces, and internationally. First and foremost, Jeff is a father of two and a husband.

En el episodio de hoy hablamos con Isabel Vizcaíno Timón sobre el cambio metodológico que ha experimentado en los últimos años su colegio, el CEIP Manuel Nuñez de Arenas de Madrid. Además nos introduce en el trabajo a través de ABP y revela las claves para el cambio en la educación y la introducción de metodologías activas. Isabel Vizcaíno es maestra de Infantil y Primaria desde hace 25 años. Autora de varios libros y diversos artículos y publicaciones en revistas y periódicos educativos. Galardonada también con varios premios de innovación educativa.Pertenece a la asociación PSII, (por una educación Participativa, Sostenible, innovadora, e inclusiva) que combina  la intervención en entornos educativos desfavorecidos con la formación en todas sus vertientes.Notas y enlaces mencionados en el episodio:InnoBar - https://www.innobar.netJornadas de Innovación Educativa i&Edu - http://ieducrif.crifacacias.esPágina Web de Isabel Vizcaíno - https://www.isabelvizcaino.comBlog del CEIP Manuel Núñez de Arenas (Vallecas) - http://ceipmanuelnunezdearenas.blogspot.comAsociación PSII - http://asociacionpsii.wixsite.com/idearioPSII Formación - http://asociacionpsii.wixsite.com/formacion

En el episodio de hoy hablamos con Isabel Vizcaíno Timón sobre el cambio metodológico que ha experimentado en los últimos años su colegio, el CEIP Manuel Nuñez de Arenas de Madrid. Además nos introduce en el trabajo a través de ABP y revela las claves para el cambio en la educación y la introducción de metodologías activas. Isabel Vizcaíno es maestra de Infantil y Primaria desde hace 25 años. Autora de varios libros y diversos artículos y publicaciones en revistas y periódicos educativos. Galardonada también con varios premios de innovación educativa.Pertenece a la asociación PSII, (por una educación Participativa, Sostenible, innovadora, e inclusiva) que combina  la intervención en entornos educativos desfavorecidos con la formación en todas sus vertientes.Notas y enlaces mencionados en el episodio:InnoBar - https://www.innobar.netJornadas de Innovación Educativa i&Edu - http://ieducrif.crifacacias.esPágina Web de Isabel Vizcaíno - https://www.isabelvizcaino.comBlog del CEIP Manuel Núñez de Arenas (Vallecas) - http://ceipmanuelnunezdearenas.blogspot.comAsociación PSII - http://asociacionpsii.wixsite.com/idearioPSII Formación - http://asociacionpsii.wixsite.com/formacion

Oxygenic photosynthesis converts light energy into chemical energy and is responsible for generating most of our atmosphere’s oxygen and biomass on earth. Several multimeric protein complexes are involved in the underlying photosynthetic electron transfer chain with photosystem II (PSII) representing the initial complex mediating the extraction of electrons from water molecules, thus generating molecular oxygen as a by-product. During recent years, the structural details and components of the PSII complex, including its inorganic and organic cofactors, have been elucidated in great detail. However, little is known about the assembly pathway of this at least 20 protein subunits containing machinery. Previous work indicated that PSII assembly occurs in a step-wise fashion and requires a number of facilitating factors, which interact transiently with nascent PSII complexes. Earlier studies of one of those assembly factors, the cyanobacterial PratA protein, suggested that PSII biogenesis does not only underlie a temporal order but is also organized at the spatial level, as PratA was shown to mark a special intermediate membrane subfraction (PDMs), hypothesized to represent regions for initial steps of PSII biogenesis. The presented work focused on a more detailed characterization of PDMs, clearly supporting their significance not only with regard to early protein assembly, but also concerning pigment synthesis and integration into the PSII precomplexes. The PDMs could further be allocated to special membrane regions, named biogenesis centers, at sites where thylakoid membranes converge to the plasma membrane, thus demonstrating the spatial organization of PSII assembly at the cellular level. Moreover, a novel function of PratA in preloading of PSII with Mn2+ ions, necessary for construction of the water-splitting complex, was discovered. Concomitantly with progression of the assembly, the nascent PSII complexes are transported from the PDMs to the thylakoid membrane system, where Sll0933 – a novel PSII assembly factor identified in this thesis – mediates the integration of the PSII inner antenna proteins followed by completion of the assembly process. Additionally, it could be shown that many of the so far identified facilitating factors interact with each other and, thus, form a complex network for PSII assembly. Especially the interaction between the two assembly factors YCF48 and Sll0933 was characterized in more detail, revealing a successive mode of action with YCF48 operating upstream of Sll0933. Taken together, the presented results enable the development of an extended and elaborated model of PSII assembly, which is a concerted process connecting protein and cofactor synthesis/integration in a spatiotemporal manner, and thus contribute to a more profound understanding of photosynthesis itself.

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten analysiert. Durch die Kombination verschiedener gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die N-Termini von NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n) Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste massenspektrometrische Charakterisierung des NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden. Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen, niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13 niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen, membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen Charakterisierung mittels offline ESI-MS.

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Unterschiedliche Stressbedingungen wie Starklicht, Hitze oder Nährstoffmangel können zu einem Abbau photosynthetischer Komplexe wie dem Photosystem I, dem Photosystem II oder Antennenproteinen führen. Dieser Abbau wird durch spezifische Proteasen durchgeführt. Die Proteasen können dabei direkt am Abbau der Strukturproteine beteiligt sein oder aber die Translation oder Transkription von Strukturproteinen oder solchen, die am Schutz photosynthetischer Proteine unter Stressbedingungen beteiligt sind, beeinflussen. Eisenmangel kann z. B. in Pflanzen und in Cyanobakterien zu Chlorose führen. Eisen ist an der Bildung von Chlorophyll beteiligt und kann in Form eines Sauerstoffträgers als Katalysator bei der Atmung agieren. Zudem ist Eisen als Kofaktor von Cytochromen und einigen Enzymen, wie Peroxidase und Katalase, für deren Funktionalität essentiell. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Deg- und SppA-Proteasen aus Synechocystis und Arabidopsis bei der Anpassung an verschiedene Stressbedingungen analysiert. Die plastidären Deg-Peptidasen werden durch vier Mitglieder, drei lumenale Enzyme (DegP1, DegP5 und DegP8) und einem stromalen Enzym (DegP2), vertreten. In Synechocystis besteht die Deg-Familie aus drei Komponenten, HtrA (DegP), HhoA (DegQ) und HhoB (DegS). Die HhoB (DegS)-Protease, die im Synechocystis-Genom durch das sll1427-Gen kodiert wird, ist in die Anpassung an Eisenstress involviert. Die DhhoB-Mutante zeigte sich unter Eisenmangel weniger angepasst und blieb auch nach längerer Stresseinwirkung grün. Die Mutante bildete sehr wohl die zum Schutz vor Eisenmangel benötigten Proteine, jedoch war die Expression von photosynthetischen Genen unter Stressbedingungen nicht wie im Wildtyp herabreguliert. Es wird vermutet, dass HhoB, ähnlich zu der DegS-Protease aus E. coli, an der Regulation der Genexpression beteiligt ist. Jedoch anders als bei E. coli wird bei Abwesenheit des DegS-Proteins die Expression nicht herabreguliert, sondern hochreguliert. Die DegP2- und DegP5-Proteasen aus Arabidopsis sind bei der Anpassung an Lichtstress involviert. Sie sind dabei aber nicht an der Reparatur des PSII oder am Abbau des D1-Proteins beteiligt. Die DdegP2-Mutante zeigte unter Lichtstress eine geringere nicht-photochemische Löschung (NPQ), die DdegP5-Mutante eine höhere NPQ. Die NPQ besteht aus drei Komponenten, der Photoinhibierung qI, der „state transition“ qT und dem „de-excitation quenching“ qE, wobei die ersten beiden nicht betroffen waren. Dass qE betroffen war, wurde anhand des Verhältnisses der Xanthophylle Violaxanthin und Zeaxanthin bestimmt. Zeaxanthin wirkt sich positiv auf die NPQ aus. Die DdegP5-Mutante enthielt mehr Zeaxanthin relativ zu Violaxanthin als die DdegP2-Mutante. Beide Proteasen, DegP5 und DegP2, könnten Regulatoren der lumenalen Violaxanthin-de-epoxidase, welche Violaxanthin zu Zeaxanthin umwandelt, sein. Die DegP2- und die DegP5-Protease agieren als Gegenspieler bei der Löschung überschüssiger Anregungsenergie.

Plants respond to changes in illumination conditions by modifying the thylakoid proteins post-translationally and by reorganizing the photosynthetic machinery. However, the mechanisms that characterize the short-term and the long-term responses are different. In the first case, the organism reacts to rapid illumination changes via phosphorylation of photosystem II (PSII) and light-harvesting (LHCII) proteins. Phosphorylation of PSII is thought to be relevant for PSII turnover, whereas LHCII phosphorylation is required for state transitions, which ensure the redistribution of the excitation energy between the two photosystems. Long-term imbalances in the energy distribution elicit changes in the composition and stoichiometry of the photosynthetic apparatus (photosynthetic acclimation). Two types of thylakoid protein kinases have been previously associated with LHCII phosphorylation, the TAK (thylakoid-associated kinase) proteins in Arabidopsis thaliana and Stt7 in Chlamydomonas reinhardtii. This work shows that the TAK proteins (TAK1, TAK2, and TAK3) are neither involved in LHCII phosphorylation nor in state transitions. In addition, evidences are provided that exclude any role of TAK2 and TAK3 in the photosynthetic electron flow. In Arabidopsis, two Stt7-like proteins exist, STN7 and STN8. Loss of STN7 blocks both LHCII phosphorylation and state transitions, indicating that this protein is a genuine Stt7 homolog. In contrast, STN8 is required for the quantitative phosphorylation of PSII core proteins. PSII activity under high-intensity light is affected only slightly in stn8 mutants, and D1 turnover is indistinguishable from the wild-type (WT), implying that reversible protein phosphorylation is not essential for PSII repair. Functional characterization of stn7 mutants showed that STN7 is not only associated with the short term response, but it is also required for the adaptation to long-term illumination changes including light-quality-induced changes in the mRNA expression of nuclear and plastid genes for photosynthetic proteins. This indicates that short-term and long-term photosynthetic adaptations are coupled and that phosphorylation of LHCII, or of an unknown substrate of STN7, is crucial for the control of photosynthetic gene expression and readjustment of photosystem stoichiometry.

TLP40 is the first complex immunophilin which was described from plant chloroplasts (Fulgosi et al., 1998). For this protein a role in regulation of PSII protein phosphorylation has been suggested (Fulgosi et al., 1998; Vener et al., 1999; Rokka et al., 2000). Homologous proteins were found in Arabidopsis thaliana and in Synechocystis. In Synechocystis, different from higher plants, the relevant PSII proteins are not phosphorylated. The main topic of this work was therefore to characterise the homologous protein of TLP40 in Synechocystis (named cTLP40, cyanobacterial TLP40). The investigation shows: • cTLP40 contains the major structural domains of TLP40 both at the N- and at the C-termini. A higher homology is found in the immunophilin domain located at the C-terminal end. • As in chloroplasts, cTLP40 is also located in the thylakoid lumen where it is present in free form or associated to the membrane. • A Synechocystis strain lacking cTLP40 ( ∆sll0408) could grow photoautotrophycally under normal grown conditions in a way comparable to wild-type. However, after adaptation to strong light the mutant strain showed higher photosensibility. Under these conditions, there was a decrease in oxygen evolution. • The total amount of PSII dimer was reduced in the mutant under high light. The lower amount of PSII can be attributed to a slower assembly rate of the complex and/or to higher degradation rate. Protein synthesis was not impaired under any of the tested conditions. • The PPIAse activity of cTLP40 was tested in vitro on synthetic prolinecontaining peptides of PSII proteins which are exposed to the lumenal face in thylakoids. The in vitro assays showed that cTLP40 possesses PPIAse activity on control peptides but can not efficiently isomerise the specific synthetic peptides.

Plastid chromosomes from the variety of plant species contain several conserved open reading frames of unknown function, which most probably represent functional genes. The primary aim of this thesis was the analysis of the role of two such ORFs, designated ycfs or hypothetical chloroplast reading frames, namely ycf9 (ORF62) and ycf10 (ORF229, cemA). Both were analyzed in Nicotiana tabacum (tobacco) via their inactivation using biolistic plastid transformation. A new experimental protocol, based on pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), was established to reliably assess the homoplastomic state of transformed plants. 1. Functional analysis of the ycf9 gene product: The inactivation of ycf9 in N. tabacum as well as in Chlamydomonas reinhardtii yielded a homoplastomic mutant phenotype after several rounds of regeneration under selective pressure. The mutant plants grew photoautotrophically, but displayed two clear phenotypes, a light-sensitive one, increasing with the light intensity, and a dwarf phenotype under low-light combined with temperatures below 20°C. The ycf9 gene product was exclusively located in PSII core complexes. This localization was based on the isolation of protein complexes released from thylakoids by controlled, partial lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation or 2D gel electrophoresis. This finding revised data of the literature. Biochemical analysis indicated an involvement of the protein in the interaction of the light harvesting antenna II complex (LHCII) with PSII cores. In particular, PSII-LHCII supercomplexes could no longer be isolated from transplastomic tobacco plants. Furthermore, the minor chlorophyll a/b-binding proteins CP26, and to a lesser extent CP29, were substantially reduced under most growth conditions analyzed, in both, tobacco and photoautotrophically grown Chlamydomonas mutants (Swiatek et al. 2001). The gene was therefore renamed psbZ. The ∆psbZ-related alterations in the supramolecular organization of PSII complexes were accompanied by considerable modification in (i) the phosphorylation pattern of PSII subunits, (ii) the rate of deepoxydation of xanthophylls, and (iii) the kinetics and amplitude of non-photochemical quenching. The proposed position of PsbZ in close proximity to CP43 enables the protein to interact with PSII cores to elicit an adaptation process in response to excess light excitation. The molecular mechanism underlying this energy dissipation process remains to be investigated. 2. Functional analysis of the ycf10 gene product: Biolistic plastid transformation was also used to inactivate the ycf10 reading frame in tobacco. After several rounds of regeneration under selective pressure, homoplastomic plants were obtained. Northern analysis uncovered co-transcription of ycf10 within the psaI-ycf4-ycf10-petA gene cluster, with at least two promotor regions upstream of the psaI gene. The mutant plants grew photoautotrophically and developed dark green leaves with numerous pale green to white regions, the latter devoid of photosynthetic activity. The loss of ycf10 did not affect photosynthetic activity, as indicated by unaltered chlorophyll fluorescence. The tobacco ycf10 gene product was localized in the chloroplast inner envelope membrane. Neither protein composition of stroma or thylakoid fractions, nor the stability of the photosynthetic protein complexes were affected in the mutant plants. In contrast, CO2- dependent oxygen evolution was strongly reduced, with a maximum rate of Ci-dependent photosynthesis being approximately 50% lower than in wild-type plants. Two explanations can account for the observed phenomenon: (i) de-regulation of carbonconcentrating mechanisms in transformed cells, or (ii) an indirect effect on CO2-uptake in ∆ycf10 plants. 3. Pulsed-field gel electrophoresis is an ideal tool to verify the homoplastomic state of transformed plants: To enhance the sensitivity of detection of heteroplastomic states, and to distinguish between plastome-located wild-type segments in transplastomic material and promiscuous DNA, a new approach was developed. Customary Southern and PCR techniques are not sensitive enough or not discriminating the latter alternatives, respectively. Pulsed-field gel electrophoresis allows to isolate virtually contamination-free plastid DNA. Plastid DNA isolated this way lacked traces of nuclear and mitochondrial DNA at a detection level of 50 DNA molecules. This excludes that gene-specific PCR amplification products originate from promiscuous nuclear or mitochondrial gene copies. Therefore, PFGE appears to be an ideal tool to investigate the homoplastomic state of transformed plants, especially when combined with radiolabeled probes and Southern techniques.

Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise an die Bedingungen ihres Standortes gebunden. Zur Aufrechterhaltung ihrer photosynthetischen Effizienz, insbesondere unter transienten Veränderungen des Lichtregimes, haben höhere Pflanzen eine Reihe molekularer Anpassungsmechanismen entwickelt, die sowohl kurz- als auch längerfristige Adaptationen des Photosyntheseapparates ermöglichen. Für die einzigartige Dynamik der photosynthetischen Membran höherer Pflanzen spielen die reversible Phosphorylierung von Thylakoidmembranproteinen und komplexe Protein-Protein-Interaktionen unter Beteiligung multifunktioneller, regulatorischer Proteine herausragende Rollen. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Identifikation und die funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments, vor allem der Thylakoidmembran, weitere Erkenntnisse zur Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen beizutragen, die die Lichtenergie mit physiologischen Reaktionen verknüpfen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Existenz multipler, membranintegraler Proteinkinasen in den Thylakoidmembranen aus Spinatchloroplasten wurde durch den Nachweis von sechs minoren, kinaseaktiven Polypeptiden in Cytochrom b/f-Komplex-angereicherten, subthylakoidalen Fraktionen bekräftigt. Die Instabilität der in Abwesenheit des Kinasesubstrats HistonIII-S renaturierten Aktivitäten im basischen Milieu spricht für eine Autophosphorylierung der potentiellen Proteinkinasen an Serin- oder Threoninresten. 2. Die 64 kDa-Komponente AMS6 wurde mit dem monospezifischen Antikörper gegen den NTerminus seiner Aminosäuresequenz als membranintegrale Komponente gestapelter Regionen der Thylakoidmembran identifiziert. AMS6 ist weder mit der phosphorylierbaren Polyphenoloxidase noch der redoxkontrollierten LHCII-Kinase identisch, was mit Hilfe hochauflösender Gelsysteme bzw. durch Perfusionschromatographie subthylakoidaler Thylakoidmembranfraktionen gezeigt wurde. Die funktionelle Rolle von AMS6, dessen Assoziation mit dem trimeren LHCII-Komplex, nicht aber mit PSII-LHCII-Superkomplexen nachgewiesen werden konnte, ist unklar. Eine mögliche regulatorische Rolle der 64 kDa- Komponente in der Modulation des Absorptionsquerschnittes am PSII wird diskutiert. 3. Die potentielle Sensorkinase AMS9 (58 kDa) wurde mit dem heterologen Antikörper gegen das mutmaßliche cyanobakterielle Homologe slr0311 als periphere Komponente der Thylakoidmembran identifiziert. Die Interaktion mit der Stromaseite der photosynthetischen Membran erfolgte über schwache hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen. Die Akkumulation von AMS9 in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran war konsistent mit seiner Assoziation mit dem PSI. Die mögliche Funktion von AMS9 als Sensorkinase eines thylakoidalen Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystems unter Beteiligung des komplexen Polypeptids TTP30 wurde am Beispiel des rekombinanten cyanobakteriellen Homologen untersucht. Die Zerstörung des slr0311-Gens im Genom von Synechocystis sp. PCC6803 eignete sich unter den Versuchsbedingungen jedoch nicht zur Aufklärung der physiologischen Rolle von AMS9 in Spinatchloroplasten. 4. Das komplexe Polypeptid TTP30, für das in den Genomen von Spinacia oleracea L. und Arabidopsis thaliana L. mehr als ein Gen existiert, wurde durch den in organello-Import des in vitro-translatierten Vorläufers als plastidäre Komponente identifiziert. Das importierte Protein konnte über einen kurzen hydrophoben Abschnitt am C-Terminus mit der Thylakoidmembran interagieren. Die Deletion des potentiellen Membranankers führte zur Akkumulation des C-terminal verkürzten Proteins im Stroma. Die proteolytischen Erkennungssequenzen seiner größeren hydrophilen Domäne waren der Protease-Aktivität im Stroma durch die räumliche Anordung des charakteristischen, zentralen Tetratricopeptid- "repeat"-Moduls vermutlich nur bedingt zugänglich. 5. Der polyklonale Antikörper gegen den rekombinanten TTP30-Vorläufer identifizierte ein 34 kDa-Polypeptid im Stroma von Spinatchloroplasten, ein Ergebnis, das der thylakoidalen Lokalisation des in vitro importierten Proteins widersprach. Als möglicher Faktor, welcher die Spezifität des Antikörpers neben der komplexen Struktur des Vorläuferproteins beeinflussen könnte, wurde die Bindung von Calciumionen an das mutmaßliche "helix-loophelix"- Motiv in der N-terminalen Domäne von TTP30 untersucht. 6. Die DNS-Bindeaktivität des mutmaßlichen "helix-loop-helix"-Motivs von TTP30 wurde durch die "South-Western"-Analyse nachgewiesen. Der rekombinante TTP30-Vorläufer konnte Plastiden-DNS aus Spinatchloroplasten in vitro spezifisch binden. Seine säurestabile in vitro-Phosphorylierung sprach für die Regulation der potentiellen DNS-Bindeaktivität durch die posttranslationale Modifikation eines Serin- oder Threoninrestes. Eine mögliche Modulation seiner Aktivität im Sinne eines klassischen Zwei-Komponenten-Systems bestätigte sich nicht. Der Asparaginsäurerest D95 in der N-terminalen, "response regulator"- ähnlichen Domäne des rekombinanten Vorläufers übernahm in vitro keine Phosphorylgruppe von der prokaryotischen Sensorkinase EnvZ. 7. Mit dem kernkodierten Immunophilin TLP40 ist eine weitere plastidäre Komponente mit komplexer, molekularer Struktur untersucht worden. Das Protein war in seiner temporär membrangebundenen Form mit dem Cytochrom b/f-Komplex in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran assoziiert. Seine lateral heterogene Verteilung und die Diskriminierung der Komplexe in den Granastapeln wurden im Zusammenhang mit der regulatorischen Interaktion von TLP40 und einer thylakoidalen Serin-/Threoninphosphatase vom Typ 2A untersucht. 8. Die reversible Interaktion von TLP40 im Thylakoidlumen mit der Innenseite der photosynthetischen Membran aus Spinatchloroplasten wurde in einem Zwei-Phasen- Polymersystem unter Verwendung von "inside-out"-Membranvesikeln nachgewiesen. Zur Identifikation essentieller Interaktionsbereiche wurden verschiedene rekombinante Deletions- und Punktmutanten von TLP40 hergestellt, die entweder keinen funktionellen Leucin-"zipper" besaßen und/oder denen die mutmaßlichen Phosphatasebindestellen im Nterminalen Abschnitt fehlten. 9. Das Gleichgewicht zwischen "freiem" TLP40 und seiner membranassoziierten Form konnte in vitro durch submillimolare Cyclosporin A-Konzentrationen zugunsten des "freien" Anteils verschoben werden. Die reversible Interaktion von TLP40 mit der Innenseite der Thylakoidmembran beeinflußte die Dephosphorylierungsrate thylakoidaler Phosphoproteine und war ein weiterer Hinweis auf eine regulatorische Interaktion des komplexen Immunophilins im Thylakoidlumen mit einer membranintegralen Proteinphosphatase vom Typ 2A. 10. Das Modell der transmembranen Signaltransduktion, die über die katalytische Aktivität der membranintegralen Proteinphosphatase auf der Stromaseite die Stabilität, die Degradation und den Umsatz der Polypeptiduntereinheiten des PSII-Holokomplexes koordinieren soll, wurde anhand zweier molekularbiologischer Ansätze untersucht. Weder die Expression der Antisens- bzw. Sens-RNS für TLP40 in A. thaliana L. noch die Inaktivierung des Gens für das potentielle cyanobakterielle Homologe sll0408 konnten jedoch unter den gewählten Versuchsbedingungen einen detaillierteren Einblick in die physiologische Bedeutung des komplexen Immunophilins TLP40 im Thylakoidlumen von Spinatchloroplasten geben.

The reaction of several plant chlorophyll-protein complexes with NaBH4 has been studied by absorption spectroscopy. In all the complexes studied, chlorophyll b is more reactive than Chi a, due to preferential reaction of its formyl substituent at C-7. The complexes also show large variations in reactivity towards NaBH4 and the order of reactivity is: LHCI > PSII complex > LHCII > PSI > P700 (investigated as a component of PSI). Differential pools of the same type of chlorophyll have been observed in several complexes. Parallel work was undertaken on the reactivity of micellar complexes of chlorophyll a and of chlorophyll b with NaBH4 to study the effect of aggregation state on this reactivity. In these complexes, both chlorophyll a and b show large variations in reactivity in the order monomer > oligomer > polymer with chlorophyll b generally being more reactive than chlorophyll a. It is concluded that aggregation decreases the reactivity of chlorophylls towards NaBH4 in vitro, and may similarly decrease reactivity in naturally-occurring chlorophyll-protein complexes.