Podcasts about sandwich elisa

Background: Cow hair and dander are important inducers of occupational allergies in cattle-exposed farmers. To estimate allergen exposure in farming environments, a sensitive enzyme immunoassay was developed to measure cow hair allergens. Methods: A sandwich ELISA was developed using polyclonal rabbit antibodies against a mixture of hair extracts from different cattle breeds. To assess the specificity of the assay, extracts from other mammalian epithelia, mites, molds and grains were tested. To validate the new assay, cow hair allergens were measured in passive airborne dust samples from the stables and homes of farmers. Dust was collected with electrostatic dust fall collectors (EDCs). Results: The sandwich ELISA was found to be very sensitive (detection limit: 0.1 ng/ml) and highly reproducible, demonstrating intra-and interassay coefficients of variation of 4 and 10%, respectively. The assay showed no reactivity with mites, molds and grains, but some cross-reactivity with other mammalian epithelia, with the strongest reaction with goat. Using EDCs for dust sampling, high concentrations of bovine allergens were measured in cow stables (4,760-559,400 mu g/m(2)). In addition, bovine allergens were detected in all areas of cattle farmer dwellings. A large variation was found between individual samples (0.3-900 mu g/m(2)) and significantly higher values were discovered in changing rooms. Conclusion: The ELISA developed for the detection of cow hair proteins is a useful tool for allergen quantification in occupational and home environments. Based on its low detection limit, this test is sensitive enough to detect allergens in passive airborne dust. Copyright (C) 2011 S. Karger AG, Basel

Aspergillus fumigatus ist der häufigste zum Tode führende opportunistische Erreger invasiver Mykosen des Menschen. Durch den zunehmenden Einsatz von Immunsuppressiva und agressiverer Chemotherapieschemata, aber auch durch Zunahme von Organ- und Stammzelltransplantationen, steigt die Zahl abwehrgeschwächter Patienten stetig an und mit ihnen die Zahl der Invasiven Aspergillosen. Bei steigender Inzidenz blieb die Letalität trotz weiterentwickelten Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren nahezu konstant. Einer der Hauptgründe dafür ist die meist späte Diagnostik der Erkrankung, welche bei Entdeckung häufig so weit fortgeschritten ist, dass jeder Therapieversuch zu spät kommt. Diese Situation erfordert dringend die Einführung von neuen diagnostischen Methoden zur Früherkennung der Invasiven Aspergillose. Ein Ansatz in dieser Arbeit sollte sein, herauszufinden welche Makromoleküle von A. fumigatus sezerniert, und damit beim Patienten in den Blutkreislauf oder Urin gelangen. Anschließend sollte untersucht werden, ob diese Pilz-Makromoleküle auch unter Infektionsbedingungen im Menschen exprimiert werden und letztendlich im Serum detektierbar sind. Dazu wurde A. fumigatus in unterschiedlichen Medien kultiviert und sezernierte Proteine analysiert. Pilzproteine sind für die Diagnostik so wichtig, da sie als erregerspezifische Antigene mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen werden können. Umgekehrt können diese Antigene auch im Patienten eine Antikörperantwort induzieren, die mittels Antigen nachgewiesen werden kann. Von den elf sezernierten Proteinen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, wurden zwei Proteine näher charakterisiert: Die Protease Aspergillopepsin1 (PEP1) und das Toxin Hämolysin (Hly). Gegen diese beiden Proteine wurden monoklonale Antikörper (mAk) generiert, wofür Hly zuerst rekombinant hergestellt werden musste. Mithilfe monoklonaler Antikörper wurden sowohl die Sekretionsbedingungen von PEP1 und Hly genauer charakterisiert als auch versucht, in Patientenserum diese zwei Proteine nachzuweisen. Leider konnte weder PEP1 noch Hly im Serum detektiert werden. Grund dafür könnte ein vorzeitig stattgefundener Verdau durch serumeigene Proteasen sein, oder eine zu geringe Konzentration der beiden Proteine im Serum. Die Sensitivität dieses Test könnte verbessert werden, in dem diese monoklonalen Antikörper z.B. innerhalb eines Sandwich-ELISAS eingesetzt werden. Neben Proteinen haben sich in der Vergangenheit auch Polysaccharide von A. fumigatus als geeignete diagnostische Marker einer invasiven Aspergillose erwiesen. Zwar haben sie den Nachteil, als Zellwandbestandteil von Pilzen nicht Aspergillus spezifisch zu sein. Dagegen haben sie für den Nachweis im Serum andere Vorteile: Sie sind sehr stabile Moleküle (z.B. hitzebeständig) und werden in größeren Mengen von A. fumigatus produziert und freigesetzt, sodass sie bereits mit weniger sensitiven Methoden detektierbar sind. In dieser Arbeit wurden nach Immunisierung zweier Mäuse mit A. fumigatus-Kulturüberstand u.a. zwei Antikörper gegen Galaktofuranose (Galf) identifiziert. Galaktofuranose kommt nicht nur als Seitenkette des Galaktomannans, einem Hauptbaustein der Aspergillus-Zellwand, vor, sondern ist auch Bestandteil vieler sezernierter Pilz-Glykoproteine. Das Vorkommen sowohl als fester Bestandteil der Zellwand und gleichzeitig als in die Umgebung abgegebenes Molekül macht den Zuckerrest Galaktofuranose nicht nur zu einem brauchbaren Marker für histopathologische Untersuchungen sondern auch für die Serologie. Anhand einer Galf-Deletionsmutante von A. fumigatus konnte die Spezifität zweier monoklonaler Antikörper (L-10-1 und L-99-13) gezeigt werden. Diese Antikörper wurden im Folgenden genutzt, um die Expressionsbedingungen von Galaktofuranose-Resten in A. fumigatus näher zu untersuchen. Es fiel auf, dass die Freisetzung von Zellwandbestandteilen mit Galaktofuranose-Resten stark von der Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig ist und erst mit Auskeimung der Sporen einsetzt. Des weiteren sollte mit Hilfe der beiden α-Galf-Antikörper versucht werden in Patientenserum Galaktofuranose-Reste zudetektieren. Hierzu wurde ein Sandwich-ELISA aufgebaut, der in zwei Varianten jeweils einen der beiden α-Galf-Antikörper als Fänger-Ak nutzte und den mAk L-10-1 (nach Konjugation mit Peroxidase) als Detektor-Ak. Es konnte gezeigt werden, dass dieser ELISA in Patientenseren sehr sensitiv Galaktofuranose-haltige Bestandteile nachweist und damit die Differentialdiagnostik einer invasiven Infektion durch A. fumigatus verbessern könnte. Nach den in dieser Arbeit erhobenen Daten kann die Sensitivität gegenüber dem kommerziell verfügbaren ELISA vermutlich noch erhöht werden. Bezüglich der Spezifität konnten die Probleme mit Galaktofuranose-Reste enthaltenen Antibiotika (wie Augmentan®) jedoch nicht beseitigt werden. Die guten Ergebnisse, die in dieser Arbeit mit dem L-10-1-ELISA erzielt wurden, führten dazu, dass dieser ELISA zur Zeit für den Einsatz in der Routinediagnostik am Max-von-Pettenkofer-Institut validiert wird.

Der klinische Nutzen des Nachweises von Aspergillus-Galaktomannan im kommerziell erhältlichen Sandwich-ELISA Platelia® Aspergillus wurde in einer prospektiven Studie an 92 Graupapageien und Amazonen evaluiert. Das Patientengut wurde unter Heranziehen objektiver klinischer Kriterien in vier Gruppen abnehmender Erkrankungswahrscheinlichkeit („gesichert“, „wahrscheinlich“, „möglich“, „unwahrscheinlich“) eingeteilt. Serumproben der Papageien wurden im Platelia® Aspergillus auf zirkulierendes Galaktomannan untersucht. Die Auswertung der ermittelten Probenindices erfolgte vergleichend für abgestufte Schwellenwerte, um den derzeit vom Hersteller empfohlenen Cut-off-Index von >= 1,5 zu überprüfen. Die Untersuchung ergab folgende Patienteneinteilung: 16,3 % der Papageien wurden in die Gruppe klinisch gesicherte Aspergillose, 11 % in die Gruppe klinisch wahrscheinliche Aspergillose, 44,6 % in die Gruppe klinisch mögliche Aspergillose und 28,3 % in die Gruppe klinisch unwahrscheinliche Aspergillose eingestuft. Für den Platelia® Aspergillus wurde unter Annahme des derzeit gebräuchlichen Cut-off-Indexes von >= 1,5 eine Sensitivität und Spezifität von 26,7 % respektive 100 % ermittelt. Das Herabsetzen des Cut-off-Indexes auf >= 0,6 führte zu einer Erhöhung der Sensitivität auf 40 % (+ 13,3 %) bei einer gleich bleibenden Spezifität von 100 %. Die Ergebnisse des Platelia® Aspergillus sollten stets im Kontext mit der klinischen Diagnostik interpretiert werden. Schlußfolgernd aus dieser Studie ergibt sich die Empfehlung, für die Untersuchung von Psittaziden-Seren im Platelia® Aspergillus einen Cut-off-Index von >= 0,6 zugrundezulegen. Dies ermöglicht die Identifizierung möglichst vieler potenziell an Aspergillose erkrankter Papageien. Das weitere therapeutische und diagnostische Vorgehen richtet sich nach der ermittelten Erkrankungswahrscheinlichkeit des Vogelpatienten. Der Platelia® Aspergillus scheint für den Nachweis einer isoliert respiratorischen Aspergillose ungeeignet. Hohes Potenzial verspricht der Sandwich-ELISA als Indikator für invasive Aspergillosen. Die praktische Bedeutung des Platelia® Aspergillus wird in seiner Verwendung als Screening-Verfahren für Aspergillose bei Psittaziden gesehen.

Ziel dieser Studie war die vergleichende Bewertung der passiven Immunisierung neugeborener Kälber unter den unterschiedlichen Managementbedingungen zweier Südkalifornischer Milchbetriebe (Farm I und Farm II). Unter Einbeziehung verschiedener Aspekte des Kälbermanagements wurde mit Hilfe der linearen Regression versucht, wichtige Einflussfaktoren auf den Immunglobulintransfer zu identifizieren. Ein weiteres Ziel bestand in der Einschätzung der Risikofaktoren, die häufig im Zusammenhang mit der Kälbersterblichkeit in Verbindung gebracht werden. Dies sind zum Beispiel unzureichende IgG-Konzentrationen im Serum, Stressfaktoren aus der Umwelt und bestimmte Managementstrategien. In der Untersuchung wurden 209 Kälber der Rasse Holstein berücksichtigt, die über einen Zeitraum von 15 Monaten, zwischen Mai 2003 und Juli 2004, geboren wurden. Die Kälber der Farm I wurden bei der ersten Kolostrumgabe mit Saugflasche, die der Farm II mit Schlundsonde versorgt. Unmittelbar vor der ersten und zweiten Tränke der neugeborenen Kälber wurden Kolostrumproben genommen. Diese und die zwischen 24 und 48 Stunden nach der Geburt gewonnenen Blutproben aus der Vena jugularis wurden mittels Sandwich ELISA auf ihre IgG-Konzentration hin untersucht. Für jedes Kalb wurden das Datum und die Zeit der Geburt, die ersten beiden Fütterungszeiten und der Zeitpunkt der Blutabnahme dokumentiert. Der mittlere IgG-Gehalt lag mit 23,5 mg/ml im Serum der 158 Kälber auf Farm I signifikant höher als der entsprechende Wert der 51 Kälber auf Farm II mit 15,9 mg/ml (p

Es wurde eine tiergerechte Wasserversorgung von Pekingenten unter hygienischen Aspekten untersucht. Insgesamt fanden fünf Versuchsdurchgänge statt, wobei nur die Ver¬suchsdurchgänge (VG) III bis V in dieser Studie berücksichtigt wurden. In jedem Versuchs¬durchgang, mit einer Mastdauer von 47 bis 49 Tagen, wurden je 1.152 Cherry-Valley-Pekingenten gehalten, die auf sechs Stallabteile aufgeteilt waren. In diesen drei Versuchsdurchgängen (III bis V) stand die Erprobung verschiedener Tränkevarianten (Nippel-, Rinnen-, und modifizierte Rundtränke) im Vordergrund. Diese Tränkevarianten wurden in Versuchsdurchgang III als Kombinationen – Nippel/Nippel, Nippel/Rinne, Nippel/Rund 24h – rund um die Uhr den Enten angeboten. In den Versuchsdurchgängen IV und V kam nur noch die modifizierte Rundtränke als offene Tränkevariante mit teilweise zeitlich begrenztem Zugang zum Einsatz. So wurde in Versuchsdurchgang IV die modifizierte Rundtränke mit 24h-,8h- und 4h Zugang zusätzlich zu Nippeltränken angeboten, in Versuchsdurchgang V erneut mit 4h- und 2h Zugang sowie einer Kontrollgruppe, denen nur Nippeltränken zur Verfügung standen. Es wurden, jeweils zu Mastbeginn (21.-28. Tag) und zu Mastende (46.-47. Tag) in den Versuchsdurchgängen III-V Wasserproben aus jeder Tränkevariante ge¬zogen und mikrobiologisch auf Enterobacteriaceae-Gehalt, Ge¬samtkeimzahl, sowie qualitativ auf Salmonella-Serovare untersucht. Des Weiteren erfolgten Blut¬entnahmen zur Bestimmung des IgY-Gehaltes im Plasma (mittels neu entwickeltem Sandwich-ELISA) sowie die Bestimmung der Ammoniakkonzentration in der Stallluft. Bei der qualitativen Untersuchung des Tränkewassers auf Salmonella-Serovare konnte aus jeder Tränkevariante Salmonellen isoliert werden. Alle isolierten Serovare konnten als humanpathogene Keime identifiziert werden. S. Saintpaul stellte das häufigste gefundene Serovar dar. Dage¬gen wurde das für den Menschen bedeutsa¬mere Serovar S. Typhimurium nur einmal isoliert. Es wurden bei der quantitativen Bestimmung auf Enterobacteriaceae-Gehalt und Ge¬samtkeimzahl immer zu Mastbeginn höhere Werte gemessen als zu Mastende. Die Messungen in Versuchsdurchgang III (VG III) zu Mastbeginn ergaben durchschnittlich 0 KbE/ml an Enterobacteriaceae in Nippeltränken (vgl. VG IV: 100.000 KbE/ml; bzw. VG V: 0 KbE/ml), bei Rinnentränken lag der Enterobacteriaceae-Gehalt in VG III bei 20.400.000 KbE/ml; an den 24h Rundtränken konnte zu Mastbeginn ein Enterobacteriaceae-Gehalt (VG III) von 4.350.000 KbE/ml (vgl. VG IV: 5.425.000 KbE/ml) festgestellt werden. Des Weiteren konnte zu Mastbeginn an der 8h zugänglichen Rundtränke ein Enterobacteriaceae-Gehalt von 1.335.000 KbE/ml gemessen werden (VG IV), wogegen an der 4h zugänglichen Rundtränke in VG IV 8.875.000 KbE/ml (vgl VG V: 125.000 KbE/ml) festgestellt wurden. An den 2h zugänglichen, modifizierten Rundtränken lag der durchschnittliche Enterobacteriaceae-Gehalt bei 600.000 KbE/ml (VG V). An allen Tränkevarianten konnte über alle drei Versuchsdurchgängen hinweg zum Mastende hin eine Abnahme an Enterobacteriaceae festgestellt werden. Bei Mastbeginn wurde als durchschnittliche Gesamtkeimzahl in VG III 0 KbE/ml (vgl. VG IV: 5.510.000 KbE/ml bzw. VG V: 605.000 KbE/ml) an Nippeltränken ermittelt, an Rinnentränken 83.075.000 KbE/ml (VG III) und an den 24h Rundtränken in VG III 74.500.000 KbE/ml (vgl. VG IV: 73.500.000 KbE/ml). Die Gesamtkeimzahlen konnten in Rundtränken mit einer zeitlichen Zugangsbegrenzung von 8h, 4h und 2h nicht reduziert werden. Die Gesamtkeimzahlen sanken in den Tränken, wie schon bei den Enterobacteriaceae, zu Mastende ab. Die gemessenen Schadgaskonzentrationen, bewegten sich zu Mastbeginn zwischen minimal 3,00 ppm an einer Nippeltränke und maximal 14,00 ppm jeweils an einer Rinnen- und einer 24h Rundtränke. Diese Werte stiegen zu Mastende deutlich an. So ergaben sich zu Mastende Ammoniakwerte von minimal 8,00 ppm an einer Nip¬peltränke und maxi¬mal 32,00 ppm an einer Rinnentränke. Die mittleren IgY-Gehalte im Blutplasma betrugen zu Mastbeginn minimal 3,66 mg/ml an der Tränkekombination Nippel/Rinne in Versuchsdurchgang III und maximal 9,72 mg/ml an der Kombination Nippel/Rund 2h in Versuchsdurchgang V. Die mittleren IgY-Konzentrationen beliefen sich zu Mastende auf minimal 15,26 mg/ml an der Tränkekombination Nip¬pel/Nippel in Versuchsdurchgang III und maximal 26,05 mg/ml an der Kombination Nippel/24h Rundtränke in Versuchsdurchgang IV. Zu Mastbeginn und zu Mastende war keine Korrelation zwischen dem IgY-Gehalt im Plasma der Tiere und dem Gehalt an Enterobacteriaceae sowie dem Gesamtkeimgehalt in offenen Tränken, festzustellen. Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen den IgY–Gehalten und den gemes¬senen Ammoniakwerten zu Mastbeginn. Zu Mastende korrelier¬ten diese Parameter nicht signifikant miteinander. Aus hygienischer Sicht kann festgestellt werden, dass sich keine erheblichen Differenzen zwischen den einzelnen offenen Tränken in Bezug auf die Gesamtkeimzahl oder An¬zahl an Enterobacteriaceae ergab. Alle Werte lagen weit über den Richtwerten der Trinkwasserverordnung. Doch diese hohen gemessenen Keimzah¬len in den Tränkevarian¬ten nehmen scheinbar keinen Einfluss auf die IgY–Gehalte im Plasma der Enten.