Podcasts about epithels

Tue, 26 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13295/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13295/1/Raith_Sabine.pdf Raith, Sabine

Zyklonukleotid-aktivierte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) spielen eine Schlüsselrolle im Seh- und Riechprozess. Der olfaktorische CNG-Kanal besteht aus den Untereinheiten CNGA2, CNGA4 und CNGB1b. Sowohl CNGA4 als auch CNGB1b können in heterologen Expressionssystemen nur zusammen mit CNGA2 funktionelle Kanäle bilden. Sie werden auch als modulatorische Untereinheiten bezeichnet, da sie dem CNG-Kanal charakteristische Eigenschaften verleihen. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von CNGB1b im Riechprozess anhand einer CNGB1-defizienten Mauslinie (CNGB1KO-Maus) untersucht werden. CNGB1KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen ein deutlich eingeschränktes Riechvermögen. Dieses äußerte sich in verringertem Körpergewicht, schlechterem Abschneiden in einem Riechtest und einem veränderten Elektroolfaktogramm (EOG). EOGs von CNGB1KO-Mäusen zeigten verglichen mit WT-Mäusen ein verzögertes Einsetzen, eine verkleinerte Amplitude und eine verlangsamte Rückbildung der Duftantwort. Als Ursache für die verzögert einsetzende Reizantwort konnte eine verringerte Sensitivität des CNG-Kanals gegenüber zyklischen Nukleotiden ausgemacht werden. Die verkleinerte Amplitude im EOG konnte durch eine verringerte Menge an Kanalprotein erklärt werden, was einen um Faktor zehn verminderten CNG-Strom zur Folge hatte. Das verlangsamte Abklingen der Duftantwort konnte auf ein Fehlen der Calcium-Calmodulin-abhängigen Inaktivierung des CNG-Stroms zurückgeführt werden. Eine Interaktion von CNGA2 und CNGA4 in CNGB1-defizienten Neuronen wurde durch Co-Immunpräzipitation nachgewiesen. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurde gezeigt, dass CNGA2 und CNGA4 zwar assemblierten, nicht aber in die Zilienmembran der ORNs transportiert wurden. Vielmehr wurde der CNGA2/CNGA4-Kanal in subziliären Zellkompartimenten zurückgehalten. Der Versuch, die Translokation in das Zilium durch Hemmung des proteolytischen Abbaus der CNG-Untereinheiten zu ermöglichen, war nicht erfolgreich, was auf eine streng reglementierte Qualitätskontrolle in olfaktorischen Rezeptorneuronen schließen ließ. Morphologisch unterschied sich das olfaktorische System von CNGB1KO-Mäusen verglichen mit dem Wildtyp durch eine Reduktion der Schichtdicke des olfaktorischen Epithels sowie einen verkleinerten Bulbus olfactorius. Neurone des Bulbus olfactorius von CNGB1-defizienten Mäusen waren bezüglich ihrer Duftantwort nicht von Wildtyp-Neuronen zu unterscheiden. Für die Bedeutung der CNGB1b-Untereinheit kann festgehalten werden, dass sie dem olfaktorischen CNG-Kanal charakteristische Eigenschaften wie erhöhte Empfindlichkeit gegenüber zyklischen Nukleotiden, die Fähigkeit zur Calcium-Calmodulin-abhängigen Inaktivierung und kontrolliertes Single Channel Flickering verleiht. Zudem spielt die CNGB1b-Untereinheit zusammen mit CNGA4 eine essentielle Rolle für den Transport des CNG-Kanals in die Zilienmembran der ORNs. Darüber hinaus ist CNGB1b unentbehrlich für eine normale Entwicklung des olfaktorischen Systems.

Eine der ersten Barrieren des Körpers gegen Bakterien, Pilze und Viren stellt die unspezifische angeborene Immunantwort dar. Zu den wichtigsten Vertretern der angeborenen Immunantwort zählt die Gruppe der antimikrobiellen Peptide. Diese Gruppe wird, gerade im Hinblick auf die Zunahme azolresistenter Candida-Stämme, immer wichtiger zur Entwicklung neuer therapeutischer Optionen. Weiterhin gewinnt der Hauptpathogenitätsfaktor von Candida albicans, die sekretorische Aspartatproteinase, an Bedeutung als therapeutischer Angriffspunkt. Ziel dieser Dissertation war die Isolierung und Identifizierung von Peptiden aus humanem Plazentagewebe, die das Wachstum von Mikroorganismen, im speziellen von Candida albicans, hemmen. Desweiteren wurde ein Peptid aus humanem Plazentagewebe gereinigt, welches in der Lage ist, den Hauptpathogenitätsfaktor von Candida albicans, die sekretorische Aspartatproteinase zu inhibieren. Zu diesem Zweck wurde eine Peptidbank aus humanem Plazentagewebe hergestellt. Die Separation von biologisch aktiven und inaktiven Peptiden erfolgte durch Reversed-Phase und Kationenaustausch-Chromatographie, wobei die antimikrobielle Aktivität der gesammelten HPLC-Fraktionen durch den Mikrodilutionstest und Sap-Inhibitionsassay überprüft wurde. Mittels dieser Methoden war es erstmals möglich, ein Peptid zu detektieren, welches sowohl die sekretorische Aspartatproteinase von Candida albicans inhibiert, als auch antimikrobielle Wirksamkeit besitzt. Dieses Peptid wurde chromatographisch gereinigt und als Fragment der β-Kette des humanen Hämoglobins identifiziert. Hierbei handelt es sich um ein kationisches Peptid, bestehend aus den 36 C-terminalen Aminosäuren des oben genannten Hämoglobins. Zudem wurden weitere bereits bekannte antimikrobielle Proteinfragmente mit Hilfe des Mikrodilutionstests und Sap-Inhibitionsassays auf antifungale Aktivität geprüft. Dabei wurde festgestellt, das ein Fragment der humanen Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, hGAPDH (1-31), sowohl das Wachstum von Candida albicans als auch die sekretorische Aspartatprotease des Pilzes hemmt. Die antifungale Aktivität des Peptides konnte auf ultrastruktureller Ebene bestätigt werden. Darüber hinaus zeigt dieses Peptid eine protektive Wirkung bei der Entwicklung oraler Kandidosen. Dies konnte unter Zuhilfenahme eines in-vitro-Schleimhaut-Kandidose-Modells auf der Basis rekonstituierten humanen Epithels gezeigt werden. Die in dieser Arbeit identifizierten und verwendeten Proteinfragmente sind ein vermutlich wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems und spielen eine wesentliche Rolle bei der Abwehr von Mikroorganismen. Aufgrund ihrer Eigenschaften könnten diese Peptide z.B. mittels lead structure Optimierung und molecular modeling in ihrer Wirksamkeit verbessert werden und sich zur Entwicklung neuer klinisch anwendbarer Peptidantibiotika eignen.

Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der bovinen Eileiterepithelzellen ex vivo und in Suspensionskultur. Ein Schwerpunkt meiner Arbeit bezüglich des bovinen Eileiters ex vivo lag bei den zyklischen Veränderungen des Eileiterepithels, über die bisher wenig präzise Daten vorlagen. Die Ampulla und der Isthmus wurden sowohl bei den Untersuchungen ex vivo als auch in der Zellkultur getrennt betrachtet. Es wurde deutlich, dass das Epithel der Ampulla stärkere morphologische Veränderungen während des Zyklus aufweist, als das Epithel des Isthmus. So war im Epithel der Ampulla die Bildung von Protrusionen zu beobachten, die abhängig vom Zyklusstadium verschiedenen Inhalt aufweisen. Die maximale Höhe des Epithels wurde in beiden Eileiterabschnitten im Östrus erreicht. Im Isthmus war das Epithel jedoch etwas niedriger als in der Ampulla. Im Metöstrus war die stärkste sekretorische Aktivität zu verzeichnen. Dies zeigte insbesondere die massive Ansammlung von sekretorischen Granula unter der apikalen Zytoplasmamembran. Nur in diesem Stadium konnte auch Exozytose der Granula beobachtet werden. Eine Veränderung der Anteile zilientragender und sekretorischer Zellen im Epithel, wie sie bei anderen Spezies beschrieben wurde, konnte beim Rindereileiter nicht festgestellt werden. Meine elektronenmikroskopischen Ergebnisse zeigen, dass beim Rind zumindest ein partieller Zilienverlust im Eileiter stattfindet. Durch die massiven Protrusionen der sekretorischen Zellen werden die Zilienbüschel außerdem im Diöstrus zur Seite gedrängt und teilweise verdeckt. Dadurch kann der Eindruck entstehen, dass die Anzahl der zilientragenden Zellen im Diöstrus abnimmt. Im bovinen Eileiterepithel wurde eine nur sehr geringe Mitoserate festgestellt, die in den verschiedenen Zyklusstadien kaum variiert. Sowohl in der Zellkultur als auch im Eileiterepithel ex vivo konnten Mitosen ausschließlich bei nicht-zilientragenden Zellen beobachtet werden. Die Zilien der Sphäroidzellen wiesen nach außen und waren während der gesamten Kultivierung vorhanden. Demnach blieb die Polarisierung der Epithelzellen erhalten. Dies sind Indize dafür, dass die Zellen einer nur geringen Dedifferenzierung während der Kultur unterliegen. Die sekretorische Aktivität der kultivierten Epithelzellen erscheint aber beeinträchtigt. Während sich die sekretorischen Granula bis zum 3. Kulturtag unter der apikalen Zellmembran ansammelten, waren sie am 5. Kulturtag bereits großflächig im apikalen Zytoplasma verteilt und an späteren Kulturtagen nur noch vereinzelt vorhanden. Da die sekretorische Funktion jedoch essentiell für die embryo-maternale Kommunikation ist, scheint die Suspensionskultur nur mit frisch isolierten Eileiterepithelzellen sinnvoll zu sein. Als weiteres Anzeichen einer Dedifferenzierung in Kultur ist die reduzierte Expression der Rezeptoren für Progesteron und Östrogen zu interpretieren. Nach diesen Ergebnissen sind die Sphäroiden in den ersten drei Kulturtagen für eine Kokultur geeignet, da sie während dieser Zeit nur leichte Anzeichen einer Dedifferenzierung aufweisen. Auch die physiologische Aufenthaltszeit des Embryos im Eileiter beträgt ungefähr drei Tage. Demnach scheint die Suspensionskultur als Kurzzeitmodell für eine Kokultur mit Embryonen gut geeignet zu sein.

Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung. Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden. Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel (Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von 3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert, wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt, jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt voneinander untersucht. Die Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene. Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt. Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert. Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst werden, untersucht werden.