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Die epitheliotropen Parapockenviren sind Mitglieder der Familie Poxviridae und treten ubiquitär in der Wiederkäuerpopulation auf. Sie verursachen kontagiöse, pustulöse Haut und Schleimhautläsionen, die meist auf den Bereich des Kopfes oder des Euters beschränkt sind (Lokalinfektion). Die Erkrankung verläuft unter Ausprägung milder bis schwerwiegender Symptome und ist i. d. R. durch eine hohe Morbidität, aber geringe Mortalität gekennzeichnet. Derzeit existieren vier in das Genus eingeordnete Virusspezies: ORFV (Schaf und Ziege), PCPV und BPSV (Rind), sowie PVNZ (neuseeländisches Rotwild). Mit Ausnahme von PVNZ konnte eine Übertragung aller Parapockenviren auf den Menschen nachgewiesen werden (Zoonoseerreger). Die Infektion des Menschen führt zum Auftreten lokal begrenzter Hautläsionen, die historisch bedingt als „Melkerknoten“ bezeichnet werden. Nach erfolgter Parapocken Diagnose werden Humaninfektionen unter Vernachlässigung der virusübertragenden Wirtstierspezies meist lapidar als erworbene Tierpocken oder pauschal als PCPV bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurde eine einzigartige Kollektion von 21 historischen und aktuellen Parapockenvirus Zellkultur Isolaten von Mensch und Tier (sowie zwei Parapockenvirus DNA Proben aus Schottland) untersucht. Dabei kamen zwei selbstentwickelte diskriminierende PCR Protokolle zur Anwendung, die einen sicheren Nachweis der Parapockenviren erlauben. Die phylogenetische Analyse der DNA Fragmente aus den PCR Ergebnissen ermöglicht die Zuordnung zu einer der etablierten Virusspezies sowie die Rückverfolgung humaner Parapockenvirus Isolate zum animalen Ursprungswirt. Überdies wurden die DNA Genome dreier Virusisolate mittels NGS sequenziert. Um genomische Veränderungen durch in vitro Einflüsse auszuschließen, wurde die Anzahl der Zellkulturpassagen strikt niedrig gehalten. Die sequenzierten Virusgenome offenbarten Parapockenvirus typische Eigenschaften: eine Größe von rund 140 kbp, einen hohen GC Gehalt von 64-65 %, das Vorhandensein eines Sets aus 88 Genen, die innerhalb der Subfamilie Chordopoxvirinae konserviert sind, sowie weiterer 12 Parapockenvirus spezifischer Gene. Die vergleichende Analyse der Genomsequenzen eines korrespondierenden ORFV Paares von Schaf (B015) und Mensch (B029) konnte zeigen, dass das Virus auch nach einer Übertragung auf eine neue Wirtsspezies seine genetische Integrität zu nahezu 100 % bewahrt. Das Auftreten der Parapockenvirusspezies PVNZ war lange Zeit auf Neuseeland beschränkt, obgleich eine weitere Verbreitung, insbesondere auch in Europa, für wahrscheinlich gehalten wurde. Im Rahmen eines Monitorings wurden 1764 Tonsillentupfer von Rotwild im bayerischen Alpenraum untersucht. In 14 (0,79 %) wurde die Präsenz von Parapockenvirus DNA mit einer real time PCR nachgewiesen. Aus einer Probe konnte erfolgreich ein Virus (HL953) in Zellkultur isoliert und seine DNA anschließend sequenziert werden, was in der ersten (nahezu) vollständigen Genomsequenz eines Parapockenvirus vom Rotwild resultierte. Tests auf klassische biologische Eigenschaften sowie die eingehende molekulare Charakterisierung des Virus mit phylogenetischer Analyse anhand von 125 Genen, ermöglichten seine Identifizierung als Vertreter einer eigenen Parapockenvirusspezies beim Rotwild in nächster Verwandtschaftsbeziehung zu PVNZ. Auffälligerweise war ca. ein Viertel aller HL953 ORFs größer als die entsprechenden ORFs in den verwendeten Parapockenvirus Referenzgenomen. Das Fehlen klinischer Symptome beim infizierten Rotwild deutet darauf hin, dass es persistierende, asymptomatische Infektionsverläufe gibt. Hieraus ergibt sich eine weitere potentielle Infektionsquelle für empfängliche Nutztiere und den Menschen.

Im Zellkern einer jeden Zelle besteht eine gewisse Ordnung der darin vorhandenen DNA und Proteine. Diese Ordnung wird unter dem Begriff „Zellkernarchitektur“ zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit ging es um die nähere Betrachtung einiger Aspekte der Zellkernarchitektur. Diese Aspekte betrafen 1. die Anordnung von Genen, 2. die Anordnung von Chromatin mit Hilfe unterschiedlicher Histonmodifikationen und 3. die Anordnungen von Chromosomenabschnitten, die mit komplexen messenger RNA-Sonden hybridisiert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mittels 3D FISH die dreidimensionale Positionierung von drei auf dem Chromosom 1 lokalisierten Genen in Zellkernen der Burkitt- Lymphom Zelllinie DG75 bestimmt. Diese Zelllinie wurde von Stefan Bohlander zur Verfügung gestellt und enthielt einen induzierbaren episomalen Vektor für das CALM-AF 10 Gen. Messungen der Genexpression, die in der Bohlander Gruppe mit Hilfe eines Affymetrix- Chips durchgeführt wurden, zeigten das die Induktion des Transgens zu genomweiten Veränderungen der Expressionsmuster hunderter Gene in dieser Zelllinie führten. Die für die 3D FISH Experimente ausgewählten Markergene zeigten nach der Induktion eine signifikant veränderte Expression. Dennoch änderte sich die radiale Positionierung dieser Gene, darunter versteht man die mehr innere oder mehr periphere Position der Gene, nicht. Dieses Ergebnis schien zuerst darauf hinzuweisen, dass die Transkriptionsstärke keine bedeutsamer Faktor im Hinblick auf die radiale Positionierung ist. Die Befunde der Affymetrix-Chip Analyse für diese Gene konnten jedoch in einer anschließende Untersuchungen der Genexpression mit Real-Time-PCR nicht bestätigt werden, obwohl der Vergleich von Affymetrix-Chip und Real- Time-PCR Daten insgesamt eine klare Korrelation zwischen den Datensätzen zeigte. Bei Diskrepanzen gehen wir davon aus, dass Real-Time-PCR die zuverlässigeren Ergebnisse liefert. Bei der hier durchgeführten Real-Time-PCR Untersuchung wurden auch die Expressionsstärken aller in einer Nachbarschaft von etwa 1 Mbp um die Markergene annotierten Gene ermittelt. Dieses Fenster wurde gewählt, weil Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Thomas Cremer und anderen Gruppen gezeigt haben, dass ~1 Mbp Chromatindomänen die Basisstruktur der Chromatinorganisation darstellen. Als Maß für die gesamte Genexpression einer Chromatindomäne wurde eine „Total Expression Strength“ (TES) berechnet. Dieser Wert basiert auf den Real-Time-PCR Werten der annotierten Gene und berücksichtigt auch die Länge der ungespleissten RNA, die von einem Gen transkribiert wird. Dabei zeigte sich, dass das Markergen in der Domäne mit dem höchsten TES Wert am weitesten innen im Zellkern lokalisiert ist. Dieser Befund unterstützt Befunde aus der wissenschaftlichen Literatur, dass die radiale Positionierung von individuellen Genen von Eigenschaften der lokalen Umgebung abhängt. Da sich die Nachbarschaft der untersuchten Markergene nicht nur im Hinblick auf die TES Werte sondern auch im Hinblick auf die Dichte der dort annotierten Gene und den GC-Gehalt unterscheidet, bleibt offen, welcher dieser Parameter als Prädiktor für die zu erwartende radiale Position individueller Gene eine entscheidende Rolle spielt. Möglich ist auch, dass alle Parameter zusammenwirken oder dass je nach den speziellen Umständen einer Untersuchung verschiedene Parameter die radiale Positionierung eines Gens bevorzugt beeinflussen. Die Stabilität der radialen Positionierung der Markergene trotz einer genomweiten Veränderung des Genexpressionsmusters nach CALM-AF 10 Induktion stimmt mit Befunden verschiedener Arbeitsgruppe überein, die für einen hohen Grad an räumlicher Stabilität der Chromatinanordnung während der Interphase sprechen; ~1 Mbp Chromatindomänen zeigen dementsprechend meist nur sehr begrenzte lokale Bewergungen (

Verschiedene Arbeiten der letzten Jahre konnten zeigen, dass sich in vielen, verschiedenen Zelltypen genreiches, transkriptionell aktives und früh replizierendes Chromatin bevorzugt im Inneren der Zellkerne aufhält, während das genarme, transkriptionell inaktive und spät replizierende Chromatin vorrangig an der Zellkernperipherie zu finden ist. Dennoch ist bislang noch nicht wirklich verstanden, welche der Chromatineigenschaften, wie die lokale Gendichte, die Expression oder die Replikationszeit, tatsächlich einen ausschlaggebenden Einfluss auf die räumliche Anordnung im Zellkern haben und welche dieser Eigenschaften nur aufgrund ihrer Korrelation mit diesen „dominanten“ Merkmalen eine spezifische Verteilung im Interphasekern aufweisen. Um dieses Problem zu untersuchen, stellten wir Pools aus BAC Klonen von HSA 11, 12, 18 und 19 für R-und G-Banden-spezifische Regionen, genreiche bzw. genarme Segmente sowie für hoch bzw. niedrig exprimierte Gene zusammen. Mit Hilfe der multicolor 3D-FISH Technik, Bildverarbeitung und computergestützter, quantitativer Auswertungen wurde die Lage dieser BAC Pools im Zellkern sowie ihre Anordnung bezüglich ihrer Chromosomenterritorien analysiert. Sowohl in den humanen Lymphozyten wie in den humanen Fibroblasten fanden wir den R-Banden Pool, den genreichen Pool sowie den Pool, der die hoch exprimierten Gene enthielt, weiter im Zellkerninneren als ihre jeweils korrespondierenden Pools (G-Banden, genarmer Pool, bzw. niedrig exprimierte Gene). Für jeden BAC Pool wurde mittels sorgfältiger Datenbankrecherche die mittlere lokale Gendichte, der mittlere GC Gehalt, die Replikationszeit sowie das mittlere Expressionsniveau bestimmt. Anschließend wurde eine Korrelationsanalyse dieser Parameter mit der berechneten mittleren, relativen Position der Pools im Zellkern durchgeführt. Die höchste Korrelation ergab sich für die Gendichte, während wir zeigen konnten, dass das Expressionsniveau, die Zuordnung zu einer R- oder G.Bande, sowie das Replikationstiming offensichtlich so gut wie keinen Einfluss auf die radiale Anordnung des Chromatins im Zellkern hat. Diese radiale Positionierung der verschiedenen Pools spiegelte sich auch in ihrer Anordnung bezüglich der Chromosomenterritorien wieder. Diese zeigen eine polare Anordnung in Bezug auf den Zellkern: Genreiche Segmente waren zum Mittelpunkt des Zellkerns hin orientiert, während die genarmen Segmente in der Hälfte des CTs zu finden waren, die sich in Richtung der Peripherie erstreckte. Etwas weniger deutlich ausgeprägt wurde diese Anordnung auch für die R-/G-Banden Pools sowie für die von der transkriptionellen Aktivität abhängigen Pools beobachtet. Dies spricht für eine deutliche strukturelle Transformation bei der Umwandlung der Metaphasenchromosomen zu den CTs der Interphase, die Territorien haben eine hohe Plastizität. Wir konnten bestätigen, dass die extrem genreiche und hoch transkriptionell aktive Region 11p15.5 oft weit aus ihrem CT herausragt. Ein ähnliches Verhalten konnte jedoch nicht für die ebenfalls sehr genreichen und transkriptionell aktiven Segmente des Chromosoms 12 beobachtet werden, was gegen die Annahme spricht, das dieses Phänomen des „looping outs“ ein typische Anordnung für Chromatinabschnitte mit solchen extremen Eigenschaften ist. Wir konnten ebenfalls keine Unterschiede für die Verteilung der BAC Pools der Chromosomen 12, 18 und 19 bezüglich der Oberfläche der CTs finden. R- und G-Banden, genreiche und genarme Segmente sowie hoch und niedrig exprimierte Gene scheinen gleichmäßig im gesamten Territorium verteilt zu sein. Die äußere, das CT einschließende Oberfläche scheint entgegen der Erwartung offensichtlich kein wichtiger Reaktionsort für besonders genreiche bzw. hoch exprimierte Sequenzen zu sein.