Podcasts about transkriptoms

Ziel der Arbeit war die Etablierung RNA Interferenz basierender Systeme zur Senkung der Proteinspiegel von b- und g-Catenin und die darauf aufbauende Evaluierung potentieller b-Catenin Zielgene mittels Microarray Technologie. Der Schwerpunkt sollte dabei auf die Untersuchung von im Wnt-Signalweg beteiligten Genen gelegt werden. Wir konnten in den kolorektalen Karzinomzelllinien SW-480, DLD-1 und HT-29 mehrere voneinander unabhängige siRNA sowohl gegen b- als auch g-Catenin etablieren. Dabei stand neben ausreichender Senkung der Protein- und mRNA-Spiegel auch die Vermeidung unerwünschter Effekte auf die Zellen im Mittelpunkt dieser Etablierungsarbeit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten vier neue funktionale Zelllinien etabliert werden. Sowohl in HT-29 als auch in SW-480 konnte ein universell einsetzbarer TET-Repressor stabil integriert werden. Die Linien HT-29TR und SW-480TR können als Basis für induzierbare Expressionssysteme verwendet werden. Auf Grundlage der Linie SW-480TR konnten Zelllinien etabliert werden, die durch Doxycyclin vermittelte Induktion shRNA gegen b-Catenin exprimieren. Mittels dieser Linien können Effekte, die durch die Senkung der b-Catenin Proteinspiegel hervorgerufen werden, einfach, schnell und zuverlässig in einem breiten Spektrum an in vitro und in vivo Assays untersucht werden. Im Rahmen einer Microarray Analyse des Transkriptoms von SW-480 Zellen nach RNA Interferenz basierter Senkung der b-Catenin Proteinspiegel wurde DKK4 als sehr stark reguliertes Gen auffällig. Mittels RT-PCR konnten wir bestätigen, dass die Expression von DKK4 direkt von den vorliegenden b-Catenin Proteinspiegeln abhängig ist. Basierend auf einer in silico Analyse des DKK4 Promoters wurden mit Hilfe von Reportergen Konstrukten der für die Aktivierbarkeit durch b-Catenin verantwortliche Abschnitt des DKK4 Promoters bestimmt. Wir konnten darstellen, dass die Aktivierung des DKK4 Promotors sowohl von der Präsenz von b-Catenin als auch von TCF4 abhängt. Die Expression von DKK4 bedingt die Gegenwart des aus TCF4 und b-Catenin bestehenden Transaktivierungskomplexes, der für die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription verantwortlich zeichnet. Gleichzeitig stellt der DKK4 Promoter durch die Präsenz von TCF-Bindestellen eine Zielstruktur für diesen Transaktivierungskomplex dar. Unsere Daten belegen, dass DKK4 ein b-Catenin Zielgen darstellt. Wir konnten auflerdem zeigen, dass die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription durch Gabe von rekombinantem DKK4 gehemmt werden kann. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit dargestellt werden, dass die Expression des Wnt-Antagonisten DKK4 in einen negativen Feedback Mechanismus, der durch b-Catenin autoreguliert wird, eingebunden ist. Der vermutete Feedback Mechanismus stellt sich wie folgt dar. Wnt-Faktoren aktivieren die Transkription b-Catenin abhangiger Zielgene, darunter auch DKK4. DKK4 initiiert durch Bindung an LRP und Kremen den Abbau von b-Catenin und verhindert somit die weiterführende Transkription von Wnt-b-Catenin Zielgenen. DKK4 übernimmt als autokriner Inhibitor des Wnt-Signalwegs feinregulatorische Aufgaben, um bei moglicher Bedarfsdeckung b-Catenin abhängiger Gentranskription die weitere Aktivierung durch Wnt-Faktoren zu verhindern. Fur den Fall, dass DKK4 als parakriner Inhibitor agiert, wäre es denkbar, dass DKK4 von Zellen im unteren Teil der Krypte, die in hohem Maße durch Wnt-Faktoren aktiviert, werden sezerniert wird, um die darüber liegenden Zellen durch Abschirmung von weiteren Wnt-Signalen vor überschieflender Expression Wnt-b-Catenin abhängiger Gene und Proliferation zu schutzen und die Differenzierung dieser Zellen einzuleiten. Die unkontrollierte Expression von Wnt-b-Catenin Zielgenen nimmt bei der Entstehung kolorektaler Karzinome eine entscheidende Schlüsselposition ein. Zur Etablierung neuer Diagnostik- und Therapieoptionen bedarf es daher auch der stetigen Erweiterung des Verständnisses des Wnt-Signalwegs. Diese Arbeit fügt ein weiteres Rädchen in die komplexe Mechanik dieses Signalwegs ein.

Der Eileiter spielt eine bedeutende Rolle im Reproduktionsgeschehen und ist dabei in viele wichtige Prozesse involviert. Er unterstützt durch das Milieu, das er bereit stellt, die Kapazitation der Spermien, die Reifung und die Befruchtung der Eizelle, und er fördert durch sezernierte Faktoren die frühe Embryonalentwicklung. Während des Zyklus durchläuft er deutliche morphologische und histologische Veränderungen, um seinen verschiedenen Aufgaben gerecht zu werden. Da viele Veränderungen in einem Gewebe mit einer Veränderung des Transkriptoms einhergehen, haben wir bovines Eileiterepithel als Ausgangsmaterial für Untersuchungen auf der Ebene der mRNA ausgewählt. Um ein homogenes und definiertes Probenmaterial erhalten zu können, musste die Schlachtung der Tiere zur Probengewinnung zu einem möglichst genau definierten Zykluszeitpunkt stattfinden. Hierfür wurde ein Protokoll zur Tiervorbereitung erarbeitet, mit dessen Hilfe alle Tiere für die Versuche einheitlich ausgewählt und zyklussynchronisiert wurden. Weiterhin wurde ein Entnahmeprotokoll für die Eileiterepithelproben entwickelt, das Schwankungen in der Probenqualität unabhängig von der durchführenden Person minimiert. Zur Untersuchung von Veränderungen des Transkriptoms wurde in einem ersten Ansatz eine Kombination aus subtraktiven cDNA-Banken und radioaktiver cDNA-Array-Hybridisierung verwendet. Zuerst wurde Eileiterepithel (Ampulle und Isthmus gemeinsam) von drei Tieren im Östrus und drei Tieren im Diöstrus untersucht. Insgesamt wurde die Expression von 3072 cDNA-Klonen (1536 cDNAs pro subraktiver Bank, eine Bank pro Zykluszeitpunkt) im Östrus versus Diöstrus verglichen. Dabei konnten 77 verschiedene cDNAs mit signifikanten Konzentrationsunterschieden zwischen den beiden Zykluszeitpunkten identifiziert werden. Davon waren 37 im Östrus und 40 im Diöstrus stärker exprimiert. Die identifizierten Gene wurden in Funktionsklassen eingeordnet. Dadurch konnten vereinfachte „Gene Ontologies“ gebildet werden, die einen Überblick geben, welche biologischen Prozesse und molekularen Funktionen zwischen Östrus und Diöstrus reguliert werden. So sind Gene, die für die Synthese und Sekretion von Proteinen wichtig sind, im Östrus hochreguliert, wohingegen Gene, die Aufgaben in der Regulation der körpereigenen Immunantwort und der Transkription haben, im Diöstrus hochreguliert sind. In einem zweiten Ansatz wurden die gewonnenen Einblicke in die Genexpressions-veränderungen während des Zyklus weiter vertieft. Dazu wurde ein Ovidukt-Array hergestellt, das auf vorangegangene Arbeiten zur Genexpression im Eileiterepithel aufbaute und durch alle cDNAs, die im Vergleich von Eileiterepithel im Östrus zu Diöstrus als differenziell exprimiert auffielen sowie durch einige Kandidatengene, erweitert wurde. Zusätzlich enthielt es, als interne Kontrolle, 94 cDNAs, von denen keine Veränderung der Genexpression im Zyklusverlauf zu erwarten waren. Auf dem Ovidukt-Array befanden sich insgesamt 549 cDNAs von 432 Genen. Mit diesem Array wurden Hybridisierungs-experimente mit bovinen Eileiterproben aus vier verschiedenen Zyklusstadien durchgeführt, jeweils drei Tiere an Tag 0, Tag 3,5, Tag 12 und Tag 18 des Sexualzyklus. Dabei wurden Proben aus Ampulle und Isthmus getrennt voneinander untersucht. Die Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ergab 196 differenziell exprimierte Gene. Die mit den Ovidukt-Array erhaltenen Daten konnten die beim Östrus-Diöstrus-Vergleich erhaltenen Ergebnisse sehr gut bestätigen, weiter vertiefen und spezifizieren. Zusätzlich wurden Veränderungen der mRNA-Spiegel ausgewählter Gene durch quantitative Real-time RT-PCR genauer quantifiziert und Lokalisationsstudien im Eileiterepithel mittels in situ Hybridisierung durchgeführt. Weiterhin wurde damit begonnen, Veränderungen auf Proteinebene in den Eileiterepithelzellen im Zyklusverlauf für einzelne Kandidatengene zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit ergab grundlegende Erkenntnisse zur Veränderung der mRNA-Zusammensetzung während des Sexualzyklus im bovinen Eileiterepithel aus der Ampulle und dem Isthmus. Damit wurden histologische Veränderungen des Epithels während des Zyklus auf molekularer Ebene charakterisiert. Auf dieser Grundlage können auch spezifische Reaktionen, die von anwesenden Spermien, befruchteten Eizellen oder Embryonen ausgelöst werden, untersucht werden.

Wachstum und Differenzierung sind zentrale Prozesse bei der Entstehung und Entwicklung des Lebens. Die Größe eines Zellverbandes wird vor allem durch die Balance zwischen Zellwachstum, Proliferation und die Apoptoserate definiert (Lupu et al. 2001). Unterschiedliche Größen von Organen können durch unterschiedliche Zellzahlen und/oder durch unterschiedliche Zellgrößen bedingt sein. So ist der Mensch beispielsweise größer als eine Maus, vor allem weil er mehr Zellen hat (Raff 1996). Im Vergleich dazu wurden bei verschiedenen Drosophila-Unterarten unterschiedliche Flügelgrößen aufgrund einer Änderung der Zellgröße entdeckt (Prout & Barker 1989). Allerdings ist bis heute nur unzureichend geklärt, wie das Wachstum durch Zellgröße und -zahl koordiniert ist und wie dadurch Struktur und Funktion von Organen bzw. Organismen entstehen. Ein zentrales regulatorisches System für die Kontrolle des Wachstums ist das GH/IGF (Wachstumshormon/Insulin-Like Growth Factor)-System. Ohne die endo- und parakrin wirksamen Komponenten GH und IGF-I ist in der Maus postnatal nahezu kein Wachstum möglich. Mäuse, die weder funktionelles GH noch IGF-I besitzen, erreichen nur 17 % der Größe und des Gewichts einer vergleichbaren adulten Maus. Damit stoßen sie an die kleinste gerade noch für ein Säugetier tolerierbare Größe (Lupu et al. 2001). Wichtige Vermittler der gewebespezifischen Wirkungen von IGF-I und -II sind die IGF-Bindungsproteine (IGFBPs). Bislang sind sechs unterschiedliche IGFBPs bekannt, die durch eine hohe Affinität für die IGFs definiert sind und damit deren biologische Wirkungen beeinflussen. Unter den IGFBPs nimmt IGFBP-2 eine besondere Stellung ein, weil es ein in vivo relevanter Inhibitor für Wachstum ist. Es konnte gezeigt werden, dass IGFBP-2 die Effekte von GH auf die Zellgröße modulieren kann. Während GH in Zona fasciculata Zellen der Nebenniere 11 Wochen alter Mäuse sowohl Zellzahl als auch Zellgröße stimulierte, wirkte sich die Koexpression von IGFBP-2 in einer Normalisierung der GH-induzierten Zellgröße, nicht jedoch der GH-induzierten Zellzahlerhöhung aus (Hoeflich et al. 2002). Dieses Modell eignet sich somit ideal, um die Regulation von Zellgröße und Zellzahl getrennt zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen dieser Veränderungen sowohl auf der Ebene des Transkriptoms, als auch der Proteine untersucht. Um Fragen zur Altersabhängigkeit der Wachstumsregulation zu bearbeiten, wurde die Untersuchung an zwei verschiedenen Altersgruppen durchgeführt.