Podcasts about signalwegs

Thu, 2 Oct 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17584/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17584/1/Gmelin_Leonore_Friederike.pdf Gmelin, Leonore Friederike

Sat, 8 Feb 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17223/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17223/1/Dobler_Melanie.pdf Dobler, Melanie ddc:590, ddc:500, Tierärztliche

Die Familie A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und vielfältigste aller Transmembranrezeptorfamilien. Ihre Mitglieder spielen eine wesentliche Rolle in fast allen (patho)physiologischen Prozessen. Nach Agonistenbindung aktivieren GPCRs, wie ihr Name andeutet, heterotrimere G-Proteine aber auch G-Protein-unabhängige Signalwege. Die verschiedenen aktiven G-Proteinuntereinheiten (Gα-GTP und βγ) induzieren nach Dissoziation vom Rezeptor entsprechende Signalkaskaden z.B. über Phospholipase A und Cβ. Um eine Fehlregulation zellulärer Prozesse z.B. durch „Überstimulation“ zu verhindern, unterliegen GPCRs strengen Regulationsmechanismen, die ihre Fähigkeit zur Signaltransduktion und ihre Verfügbarkeit an der Zelloberfläche bestimmen. Die Bradykininrezeptoren B1 und B2 (B1R, B2R) gehören zur Familie A der GPCRs, also zu den Rhodopsin-ähnlichen GPCRs, und werden durch die pro-inflammatorischen Peptide desArg9-Bradykinin/desArg10-Kallidin (DABK/DAK) bzw. Bradykinin (BK)/Kallidin aktiviert. Im Gegensatz zum konstitutiv exprimierten B2R, der nach Stimulation schnell desensitisiert und internalisiert wird, erfolgt eine B1R-Expression fast ausschließlich unter pathophysiologischen Bedingungen über Induktion durch Zytokine. Nach Stimulation wird der B1R nicht internalisiert, sondern verbleibt an der Zelloberfläche. Beide Rezeptoren koppeln sowohl an Gαq/11 als auch an Gαi und aktivieren somit weitgehend identische Signalwege [vor allem Phospholipase Cβ (PLCβ) und „mitogen activated protein kinase“ (MAPK)-Kaskaden]. Durch ihre - besonders im Hinblick auf ihre Internalisierungs-eigenschaften - konträre Regulation, stellen die Bradykininrezeptoren ein interessantes Modell zur Untersuchung regulatorischer Mechanismen und deren Einflüsse auf die Signalübertragung von GPCRs dar. Beide Bradykininrezeptoren spielen bei inflammatorischen Prozessen eine Rolle. Sie fördern die Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine und rekrutieren Immunzellen. Während entzündlicher Ereignisse kommt es zu erhöhter Zytokinfreisetzung z.B. von Interleukin-1β (IL-1β) und dadurch zur de novo Synthese von B1R. Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1β, die zur B1R-Expression führen, induzieren unter anderem aber auch einen Anstieg der Körpertemperatur (Fieber), eine häufige Begleiterscheinung inflammatorischer Vorgänge. Trotz des bekannten Zusammenhangs zwischen Inflammation und erhöhter Temperatur war über den Einfluss eines Temperaturanstiegs auf Membranrezeptoren und ihre Signalvermittlung auf zellulärer Ebene bisher nur sehr wenig bekannt. In dieser Arbeit wurde - unseres Wissens nach - erstmals auf die Temperatur als regulatorische Komponente für GPCR-vermittelte Signalübertragung eingegangen. Am Beispiel der Bradykininrezeptoren wurde gezeigt, dass die Stärke der Signalübertragung von GPCRs signifikant durch eine Temperaturerhöhung von 37°C auf 41°C beeinflusst werden kann. Hierbei war jedoch zwischen einer Temperaturabhängigkeit des Signalwegs selbst und einer rezeptorspezifischen Temperatursensitivität zu unterscheiden. So wurde die Aktivierung von ERK1/2 unter pathophysiologisch erhöhter Temperatur (41°C; normale Körpertemperatur: 37°C) signifikant gesteigert, unabhängig davon ob sie durch B1 oder B2 Rezeptoren stimuliert wurde. Die gesteigerte Aktivität PLCβ-vermittelter Signalkaskaden bei 41°C konnte hingegen auf eine nur für den B1R spezifische Temperaturabhängigkeit zurückgeführt werden. Diese Beobachtung zusammen mit der Tatsache, dass die B1R-Expression unter pathophysiologischen Bedingungen besonders induziert wird, deutet darauf hin, dass der B1R in Kombination mit Fieber eine verstärkte Wirkung im Organismus haben könnte. Ob diese Heilungs-fördernd oder -abträglich wirkt, müsste noch genauer untersucht werden. Neben dem Einfluss der Temperatur wird die Signalübertragung der GPCRs durch die jeweiligen Rezeptorkonformationen und die sich daraus ergebenden Funktionsunterschiede bestimmt. Die Familie A der GPCRs wird durch einige hoch konservierte Strukturmerkmale wie die E/DRY-Sequenz mit R3.50 in der dritten Transmembrandomäne (TM) oder die NPXXY-Sequenz am Ende der siebten TM charakterisiert. Publizierte Ergebnisse deuten darauf hin, dass bovines Rhodopsin durch eine Salzbrücke zwischen R3.50135 (TM3) und E6.30247 (TM6), auch „ionic lock“ genannt, im inaktiven Zustand gehalten wird. Der B2R ist einer der wenigen Peptid-GPCRs, der ein Glutamat an Position 6.30 (E6.30238) trägt, und eignete sich daher zur Untersuchung der Anwesenheit und Funktion eines möglichen „ionic lock“ auch in „nicht-Rhodopsin“-GPCRs. Für alle bisher entsprechend untersuchten GPCRs ist bekannt, dass R3.50 für eine effiziente G-Protein-Aktivierung unabdingbar ist (selbiges wurde in der vorliegenden Arbeit auch für den B2R bestätigt). Die funktionelle Analyse eines „ionic lock“ anhand einer R3.50 Mutation und G-Protein-abhängiger Kaskaden ist deshalb nicht möglich. Die Rolle eines „ionic lock“ im Hinblick auf G-Protein-unabhängige Mechanismen wie die Rezeptorinternalisierung, einem wichtigen Regulationsschritt für die meisten GPCRs, wurde bisher jedoch noch nicht untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die Rezeptorendozytose durch Mutation von R3.50128 zu Alanin (R3.50128A), im Gegensatz zur G-Protein-Aktivierung, nicht zum Erliegen kommt. Die mutierten Rezeptorkonstrukte wiesen sogar ein konstitutives Internalisierungsverhalten auf. Dies verwies auf unterschiedliche Funktionen dieser Aminosäure bei der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion und bei der Rezeptorinternalisierung. Ein Aufbrechen des möglichen „ionic lock“ durch Mutation von E6.30238 zu Alanin oder Arginin resultierte ebenfalls in konstitutiv internalisierenden Rezeptorkonstrukten. Im Gegensatz zur Endozytose zeigten diese Mutanten zwar keine konstitutive Signalübertragung, wurden aber auch durch prinzipiell als Antagonisten klassifizierte Verbindungen effizient aktiviert. Diese Ergebnisse legen einen mehrstufigen Aktivierungsprozess nahe, dessen Stufen sich durch verschiedene Rezeptorkonformationen mit unterschiedlichen Interaktionsmöglichkeiten für die G-Protein-Rekrutierung/Aktivierung oder mit der Internalisierungsmaschinerie [GPCR-Kinasen (GRKs), Arrestine] auszeichnen. Der wechselseitige Austausch der beiden hoch konservierten Aminosäuren R3.50128 und E6.30238 ermöglichte wahrscheinlich die Bildung eines inversen „ionic lock“, wodurch normales B2R-Verhalten wieder hergestellt wurde. Diese Arbeit zeigt somit erstmals, dass ein Aufbrechen eines möglichen „ionic lock“ in einem Peptidrezeptor unterschiedliche Auswirkungen für die Prozesse der G-Protein-Aktivierung und der Rezeptorendozytose haben kann. Dadurch wird die Annahme bestärkt, dass es bei einem GPCR mehrere aktive Konformationen geben kann, die unterschiedliche Affinitäten gegenüber regulatorischen Proteinen (GRKs, Arrestinen) oder Effektoren (G-Proteinen, Arrestinen) aufweisen und dadurch differenziert zelluläre Signale auslösen können. Die Aufklärung der unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen von GPCRs in Kombination mit der Herstellung von Verbindungen z.B. sogenannten „small molecule compounds“, die bestimmte Rezeptorkonformationen mit ihren signalspezifischen Eigenschaften stabilisieren können, wäre möglicherweise für die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die nur ganz bestimmte Signalwege modulieren und so eine optimierte therapeutische Anwendung erlauben, hilfreich.

Wed, 20 Nov 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17070/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17070/1/Stojanovic_Kristina.pdf Stojanovic, Kristina ddc:570, ddc:500, Fakultät für

Thu, 14 Mar 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15544/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15544/1/Kapaun_Christine.pdf Kapaun, C

Thu, 24 May 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14407/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14407/1/Osswald_Andrea.pdf Oßwald, Andrea

Wed, 26 Jan 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12601/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12601/2/Hagl_Beate.pdf Hagl, Beate ddc:610, ddc:600, Medizinische Fa

Die Charakterisierung und Kultivierung von Tumorzelllinien mit Hilfe einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur gilt als Standardmethode in der Zellbiologie. Dreidimensionale (3D) Modelle gewinnen jedoch immer mehr an Bedeutung, da sie die Tumorbiologie in Bezug auf physiologisch relevante Zusammenhänge bei der Tumorentstehung und –progression besser abbilden als eine herkömmliche 2D-Kultur. Die auf poly-HEMA beschichteten Zellkulturplatten induzierten multizellulären Tumorspheroide reflektieren die Morphologie von avaskularen Tumoren und Mikrometastasen. In der vorliegenden Arbeit werden anhand von HER2-überexprimierenden Tumorzelllinien die Unterschiede der HER2-Signalaktivierung und –weiterleitung in 2D- und 3D-Kultur umfassend beschrieben. In 3D-Kultur konnte ohne Zugabe von zusätzlichen Wachstumsfaktoren eine stärkere HER2-Phosphorylierung beobachtet werden. Bei der Brusttumorlinie SKBR-3 bildet HER2 in 2D-Kultur bevorzugt Heterodimere mit HER3, wohingegen in Spheroiden HER2-Homodimere vorliegen. Diese Homodimere lokalisieren in lipidreichen Mikrodomänen und begünstigen die Aktivierung des Ras-MAPK-Wegs, der die Proliferation der Tumorzellen reguliert. Mit Hilfe des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, der spezifisch für HER2 ist, kann die Proliferation der Zellen und die Phosphorylierung von HER2 im 3D-System besser inhibiert werden. Zusätzlich konnte in 3D eine Herunterregulierung des HER2/HER3 assoziierten PI3K-Akt-Signalwegs nachgewiesen werden. Bei SKBR-3 war in 3D-Kultur neben der stärkeren Phosphorylierung von MAPK auch die Aktivierung der Integrin 4/Rac1/PAK2-Signalkaskade zu beobachten. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit in 3D-Kultur die Zelllinie SKBR-3 HR generiert, die resistent gegen die Behandlung mit Trastuzumab ist. Die Charakterisierung dieser Linie zeigte eine verstärkte Expression von DARPP-32 und eine gesteigerte HER2/HER3-Heterodimerbildung, gefolgt von einer Hochregulierung des PI3K-Akt-Wegs. Das Gen für DARPP-32 liegt im ERBB2-Amplikon und liegt bei vielen Brusttumorproben und –zelllinien amplifiziert vor. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierte Resistenz reversibel ist und die erneut Trastuzumab responsiven Zellen eine schwächere Expression von DARPP-32 aufwiesen, gefolgt von einer reduzierten Aktphosphorylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das beschriebene 3D-Modell einige in vivo Aspekte des HER2-Signalmusters besser reflektiert und deshalb als Basis für die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus von Trastuzumab dienen kann. Außerdem kann dieses 3D-System zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen herangezogen werden um Therapiestrategien zu entwickeln, welche eine Behandlung der HER2-positiven Patientenpopulation erlaubt, die bisher nur suboptimal auf die Behandlung mit Trastuzumab angesprochen haben.

Fri, 1 Aug 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8940/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8940/1/Mergler_Judith.pdf Mergler, Judith ddc:500, ddc:570, Fakultät f

Ziel der Arbeit war die Etablierung RNA Interferenz basierender Systeme zur Senkung der Proteinspiegel von b- und g-Catenin und die darauf aufbauende Evaluierung potentieller b-Catenin Zielgene mittels Microarray Technologie. Der Schwerpunkt sollte dabei auf die Untersuchung von im Wnt-Signalweg beteiligten Genen gelegt werden. Wir konnten in den kolorektalen Karzinomzelllinien SW-480, DLD-1 und HT-29 mehrere voneinander unabhängige siRNA sowohl gegen b- als auch g-Catenin etablieren. Dabei stand neben ausreichender Senkung der Protein- und mRNA-Spiegel auch die Vermeidung unerwünschter Effekte auf die Zellen im Mittelpunkt dieser Etablierungsarbeit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten vier neue funktionale Zelllinien etabliert werden. Sowohl in HT-29 als auch in SW-480 konnte ein universell einsetzbarer TET-Repressor stabil integriert werden. Die Linien HT-29TR und SW-480TR können als Basis für induzierbare Expressionssysteme verwendet werden. Auf Grundlage der Linie SW-480TR konnten Zelllinien etabliert werden, die durch Doxycyclin vermittelte Induktion shRNA gegen b-Catenin exprimieren. Mittels dieser Linien können Effekte, die durch die Senkung der b-Catenin Proteinspiegel hervorgerufen werden, einfach, schnell und zuverlässig in einem breiten Spektrum an in vitro und in vivo Assays untersucht werden. Im Rahmen einer Microarray Analyse des Transkriptoms von SW-480 Zellen nach RNA Interferenz basierter Senkung der b-Catenin Proteinspiegel wurde DKK4 als sehr stark reguliertes Gen auffällig. Mittels RT-PCR konnten wir bestätigen, dass die Expression von DKK4 direkt von den vorliegenden b-Catenin Proteinspiegeln abhängig ist. Basierend auf einer in silico Analyse des DKK4 Promoters wurden mit Hilfe von Reportergen Konstrukten der für die Aktivierbarkeit durch b-Catenin verantwortliche Abschnitt des DKK4 Promoters bestimmt. Wir konnten darstellen, dass die Aktivierung des DKK4 Promotors sowohl von der Präsenz von b-Catenin als auch von TCF4 abhängt. Die Expression von DKK4 bedingt die Gegenwart des aus TCF4 und b-Catenin bestehenden Transaktivierungskomplexes, der für die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription verantwortlich zeichnet. Gleichzeitig stellt der DKK4 Promoter durch die Präsenz von TCF-Bindestellen eine Zielstruktur für diesen Transaktivierungskomplex dar. Unsere Daten belegen, dass DKK4 ein b-Catenin Zielgen darstellt. Wir konnten auflerdem zeigen, dass die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription durch Gabe von rekombinantem DKK4 gehemmt werden kann. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit dargestellt werden, dass die Expression des Wnt-Antagonisten DKK4 in einen negativen Feedback Mechanismus, der durch b-Catenin autoreguliert wird, eingebunden ist. Der vermutete Feedback Mechanismus stellt sich wie folgt dar. Wnt-Faktoren aktivieren die Transkription b-Catenin abhangiger Zielgene, darunter auch DKK4. DKK4 initiiert durch Bindung an LRP und Kremen den Abbau von b-Catenin und verhindert somit die weiterführende Transkription von Wnt-b-Catenin Zielgenen. DKK4 übernimmt als autokriner Inhibitor des Wnt-Signalwegs feinregulatorische Aufgaben, um bei moglicher Bedarfsdeckung b-Catenin abhängiger Gentranskription die weitere Aktivierung durch Wnt-Faktoren zu verhindern. Fur den Fall, dass DKK4 als parakriner Inhibitor agiert, wäre es denkbar, dass DKK4 von Zellen im unteren Teil der Krypte, die in hohem Maße durch Wnt-Faktoren aktiviert, werden sezerniert wird, um die darüber liegenden Zellen durch Abschirmung von weiteren Wnt-Signalen vor überschieflender Expression Wnt-b-Catenin abhängiger Gene und Proliferation zu schutzen und die Differenzierung dieser Zellen einzuleiten. Die unkontrollierte Expression von Wnt-b-Catenin Zielgenen nimmt bei der Entstehung kolorektaler Karzinome eine entscheidende Schlüsselposition ein. Zur Etablierung neuer Diagnostik- und Therapieoptionen bedarf es daher auch der stetigen Erweiterung des Verständnisses des Wnt-Signalwegs. Diese Arbeit fügt ein weiteres Rädchen in die komplexe Mechanik dieses Signalwegs ein.

Notch-Signale spielen bei der Entwicklung von Lymphozyten eine wichtige Rolle. So induzieren Notch1-Signale in Lymphozyten-Vorläuferzellen im Knochenmark die Entwicklung zu T-Zellen, während Notch2-Signale essentiell für die Differenzierung reifer B-Zellen zu Marginalzonen-B-Zellen sind. Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert reife B-Zellen und regt diese zur permanenten Proliferation an. EBNA2, das erste Protein, das in EBV-infizierten B-Zellen exprimiert wird, verwendet zur Regulation von Zielgenen den gleichen Signalweg wie Notch und wird deshalb als (partielles) funktionelles Äquivalent eines aktivierten Notch-Rezeptors (NotchIC) bezeichnet. Notch und EBNA2 können sich bezüglich der Muskelzelldifferenzierung gegenseitig ersetzen, die Proliferation in B-Zellen kann dagegen nur EBNA2 induzieren. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, mit Hilfe welcher Zielgene Notch und EBNA2 unterschiedliche und gemeinsame Funktionen vermitteln. Zu diesem Zweck wurde ein Zellsystem etabliert, bei dem Tetrazyclin-regulierbares aktives Notch1IC oder Notch2IC in humane reife EBV-immortalisierte B-Zellen eingebracht wurde. In diesem System konnten Notch1IC oder Notch2IC in Abwesenheit von EBNA2 exprimiert werden, sowie EBNA2 in Abwesenheit von NotchIC. Die Expression von Zielgenen wurde anhand einer Microarray- Analyse untersucht. Damit sollten Notch1IC-, Notch2IC- und EBNA2-regulierte Zielgene identifiziert werden. Hierbei wurde vornehmlich auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen Notch1IC- und Notch2IC-regulierten Genen, sowie zwischen NotchIC- und EBNA2-regulierten Genen eingegangen. Durch Notch1IC wurden 270 Gene induziert und 374 Gene reprimiert. Notch2IC konnte 757 Gene induzieren und 959 Gene reprimieren. EBNA2 induzierte 6.250 Gene und reprimierte 6.811 Gene. Die Auswertung der Zielgene in der Clusteranalyse ergab, dass viele Gene reguliert wurden, die mit dem Zellzyklus und der Immunmodulation assoziiert sind. Aus diesem Grund sollten diese beiden Signalwege näher untersucht werden. In dem beschriebenen Zellsystem konnten weder Notch1IC noch Notch2IC die EBNA2-vermittelte Proliferation ersetzen. So konnten Notch1IC und Notch2IC zwar einige Zellzyklus-Gene induzieren, die aber assoziierten eher mit der S-Phase und mit der Mitose. Die von EBNA2 stark induzierten Gene c-Myc und LMP1, sowie die G1-Phase assoziierten D-Cycline und der Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 konnten durch NotchIC nicht oder nur schwach induziert werden. Vermutlich können Notch1IC und Notch2IC die Proliferation weder aufrechterhalten noch induzieren, da sie nicht fähig sind, G1-Phase Gene, sowie c-Myc und LMP1 ausreichend stark zu induzieren. Der Einfluss von NotchIC auf die Immunmodulation war mit der von EBNA2 vergleichbar. Die Repression vieler Gene, die mit der Immunmodulation assoziieren, weist darauf hin, dass sowohl Notch1IC, Notch2IC als auch EBNA2 die Immunantwort negativ regulieren. So könnten B-Zellrezeptor (BCR)-Signale über die Repression von Komponenten und Signalmolekülen des BCR abgeschwächt werden, die Antigenpräsentation über die Repression von MHC-Molekülen vermindert werden und der allgemeine Aktivierungszustand zusätzlich über die Repression von Komplement-, Toll-like- und Fc-Rezeptoren vermindert werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass Notch1IC, Notch2IC und EBNA2 den Klassenwechsel negativ beeinflussen. Dies wird möglicherweise über die transkriptionelle Repression der Interleukin-Rezeptoren IL4Rα1 und IL13Rα1, sowie über die Modulation von Molekülen des Signalwegs vermittelt, die die Expression von sterilen Transkripten induzieren und somit die Voraussetzung zum Klassenwechsel bilden.

Das multiple Myelom ist eine Erkrankung, bei der terminal differenzierte Plasmazellen das Knochenmark infiltrieren, wodurch das typische klinische Bild eines Myelompatienten zustande kommt. In den letzten Jahren haben sich die Hinweise gehäuft, dass die Bindung der Myelomzellen im Knochenmark an Stromazellen die Chemosensitivität der Myelomzellen vermindert und somit zur „de-novo drug resistance" beiträgt. Das primäre Ziel dieser Arbeit war es, ein Zellmodell zu entwerfen, mit welchem die Untersuchung der Interaktionen von Stromazelle und Myelomzelle und damit der zelladhäsionsabhängigen Zytostatikaresistenz (CAM-DR) möglich ist. Darüber hinaus sollte diese Zytostatikaresistenz charakterisiert und mögliche molekulare Therapietargets identifiziert werden, welche eine Verhinderung von CAM-DR ermöglichen. Da das etablierte Kokulturmodell auf einer Kultur mit der Stromazelllinie HS-5 beruhte, wurde diese zuerst bezüglich der Oberflächenmarker und des Apoptoseverhaltens charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass sich primäre Stromazellen aus Knochenmarksspiraten und die Stromazelllinie HS-5 zwar in ihrer Chemosensibilität unterscheiden, sie prinzipiell jedoch gleich reagieren. Beide lösen bei einer direkten Kokultur mit Myelomzellen im selben Maße CAMDR in den Myelomzellen aus. Die anschließende Charakterisierung von CAM-DR bewies, dass CAM-DR nicht zelllinienspezifisch und nicht zytostatikaspezifisch ist. HS-5-Zellen verhinderten nicht nur die Entstehung von später sondern auch von früher Apoptose. Es zeigte sich, dass das Ausmaß von CAM-DR maßgeblich von der Dauer der Kokultivierung abhängt. Des Weiteren stellte sich heraus, dass in diesem Zellmodell die von den HS-5-Zellen sezernierten Zytokine keinen Einfluss auf die Apoptoseinduktion hatten. Konsequenterweise wurden die Oberflächenantigene auf den Myelomzellen und den Stromazellen quantifiziert und teilweise deren Alteration nach einer Inkubation mit Zytostatika festgestellt. Sowohl eine Blockade der wichtigsten Integrine VLA-4 und LFA-1 als die Modulation der wichtigsten Signalwege konnte CAM-DR zwar teilweise, aber nicht vollkommen verhindern. Allein Vertreter der Statine, Simvastatin und Lovastatin, konnten CAM-DR drastisch reduzieren. Wie weiterhin gezeigt werden konnte, lag dies nicht an einer verminderten Expression von Oberflächenintegrinen, einer verminderten Zytokinsekretion der Stromazellen oder einer verstärkten Deadhäsion der Myelomzellen von den Stromazellen, sondern an der Hemmung der Geranylgeraniolpyrophosphatsynthese. Wir wiesen nach, daß Statine in der Kokultur über die Hemmung des HMG-CoA-Reduktase/GG-PP/Rho/Rho-kinase-Signalwegs wirken. Dies wurde in weiteren Experimenten, in denen selektiv die Geranylgeranioltransferase mittels GGTI-298 und die Rho-Kinase mit Y-27632 gehemmt wurden, bestätigt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können als Grundlage für einen potentiellen Einsatz von Statinen in der Therapie des multiplen Myeloms dienen, denn bezüglich des dargestellten Signalwegs wirken die Statine bereits im subtoxischen Bereich. Die weitere Erforschung von CAM-DR und deren assoziierte Signalwege bei anderen Tumorentitäten sowie die Evaluation der klinischen Relevanz der Gabe von Statinen zur Blockade von CAM-DR ergeben sich als wichtige nächste Schritte als Konsequenz der vorliegenden Arbeit.

Das gasförmige Stickstoffmonoxid (NO) steuert die Relaxation glatter Muskulatur. Dabei aktiviert NO die lösliche Guanylatzyklase im Zytosol der glatten Muskelzelle. Die lösliche Guanylatzyklase bildet den Botenstoff cGMP, der die cGMP-abhängige Proteinkinase (cGK) aktiviert. Die cGK gehört zur Familie der Serin/ Threonin-Proteinkinasen und führt nach Phosphorylierung von unterschiedlichen Signalproteinen zur Relaxation der glatten Muskulatur. Der Beitrag des NO/ cGMP/ cGK-Signalwegs zur glattmuskulären Relaxation kann mit Hilfe von genetisch veränderten Mauslinien, denen Komponenten dieses Signalwegs fehlen, untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit werden neben Wildtyp-Mäusen mit intaktem NO/ cGMP/ cGK-Signalweg die cGKI-/--Mäuse, denen das Protein cGKI deletiert ist, und die IRAG∆12/∆12-Mausmutanten, die nach Zerstörung des Exon 12 des IRAG-Gens zwei hypomorphe IRAG-Allele besitzen, verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit werden die cGMP-abhängigen Mechanismen der Relaxation nach Hormon- und Kalium-induzierter Stimulation glatter Muskelzellen untersucht. Die Experimente werden einerseits am intakten und permeabilisierten Gefäß und andererseits an kultivierten, vaskulären glatten Muskelzellen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die Existenz unterschiedlicher Mechanismen zur cGMP-vermittelten Relaxation an der Mausaorta. Nach Hormon-induzierter Stimulation wird der Gefäßtonus durch den cGMP/ cGKI-Signalweg relaxiert. Dabei wird der Effekt hauptsächlich über IRAG durch Hemmung der Ca2+-Freisetzung aus den intrazellulären Speichern vermittelt. Die Kalium-vermittelte Kontraktion wird ebenso cGMP/ cGKI-abhängig relaxiert, jedoch unabhängig von IRAG. Überraschenderweise demonstrieren die Ergebnisse an der permeabilisierten Aorta, dass die cGMP/ cGKI-vermittelte Ca2+-Desensitisierung eine untergeordnete Rolle spielt und in Gegenwart hoher cGMP-Konzentrationen über die Protein Kinase A vermittelt wird. Die Kontraktionsexperimente mit Thapsigargin weisen darauf hin, dass vermutlich die SERCA an der Relaxation des Kalium-induzierten Tonus beteiligt ist.