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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von in der EU-weit geltenden Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 reglementierten Chinolonen. Zur Gewinnung gruppenspezifischer Antikörper wurde Ciprofloxacin-Ethylendiamin an Keyhole Limpet Haemocyanin (KLH) gekoppelt und drei Kaninchen intracutan immunisiert. Nach einer Restimulierung waren bei allen drei Kaninchen spezifische Antikörper nachweisbar. Die zur Erstellung eines direkten und indirekten kompetitiven enzymimmunologischen Nachweisverfahrens notwendigen markierten Antigene wurden durch Kopplung von Ciprofloxacin, Ciprofloxacin-Ethylendiamin, Clinafloxacin sowie Norfloxacin an Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase oder Ovalbumin hergestellt. Dabei kamen verschiedene Kopplungsmethoden (aktive Estermethode, Perjodatmethode und Carbodiimidmethode) zum Einsatz. Mit dem spezifischen Serum eines Tieres wurden verschiedene kompetitive Enzymimmun-testsysteme entwickelt. Von den direkten Enzymimmuntests wies das empfindlichste System eine Nachweisgrenze für Ciprofloxacin von 1,25 ng/ml auf, im indirekten Testsystem lag die untere Nachweisgrenze bei 1,5 ng/ml. Ciprofloxacin konnte somit weit unterhalb des geltenden MRL-Wertes von 100 µg/kg in Milch nachgewiesen werden. Das Antiserum zeigte nur bedingt Gruppenspezifität. Für fünf von 23 überprüften Chinolonen wurden Kreuzreaktionen von > 50 % ermittelt, von den mit einem MRL-Wert belegten Substanzen wurden Danofloxacin, Ciprofloxacin, Enrofloxacin und Oxolinsäure erfasst. Zur Überprüfung der Anwendbarkeit der entwickelten Testsysteme wurden künstlich kontaminierte und gewachsene Milch- und Garnelenproben untersucht, wobei das jeweilige Testsystem an die entsprechende Probenmatrix adaptiert wurde. Die mittlere Wiederfindungsrate lag bei 95,5 %, in keiner der Praxisproben konnten Chinolonrückstände nachgewiesen werden. Weiterhin wurde ein mikrobiologisches Verfahren unter Verwendung von E. coli als Testkeim zum Nachweis für Chinolone entwickelt. Dieser Agardiffusionstest zeichnete sich durch eine hohe Sensitivität und Gruppenspezifität aus. Ciprofloxacin konnte mit einer Nachweisgrenze von 2 ng/ml weit unterhalb des geltenden MRLs nachgewiesen werden, zehn weitere wichtige Chinolone wurden unterhalb von 100 ng/ml erfasst. Dieses System kann somit als nützlicher Kontrolltest verwendet werden.

Zur Familie der natriuretischen Peptide gehören drei Peptide: Atrial Natriuretic Peptide (ANP), Brain Natriuretic Peptide (BNP) und C-type Natriuretic Peptide (CNP). BNP wurde ursprünglich im Gehirn von Schweinen isoliert, bald stellte sich heraus, dass eine wesentlich höhere Konzentration im Herz vorliegt. Plasma-BNP ist bei verschiedenen Herzerkrankungen vieler Spezies erhöht. Das Ziel der Studie war es, Referenzwerte für BNP im kaninen Plasma zu erstellen. Zur Messung von Plasma BNP wurde ein kommerzieller Radioimmunoassay verwendet. Eine Validierung des Testkits mit der Untersuchung von Präzision, Richtigkeit, Sensitivität, Spezifität und Stabilität wurde zuvor durchgeführt. Als Studienteilnehmer dienten 79 gesunde Hunde (41 Rüden, 38 Hündinnen) im Alter von 3 Monaten bis 15 Jahren. Dabei waren 23 Hunde Mischlingshunde und 56 Rassehunde. Anhand ihres Gewichtes wurden sie in 3 verschiedene Gruppen eingeteilt (K: 25 kg). Der untersuchte Radioimmunoassay wies eine gute Präzision mit einer Intraassay-Präzision von 10,57 % und einer Interassay-Präzision von 12,64 % auf. Bei Zugabe von synthetischem kaninem BNP zu einem Plasma mit niedrigem BNP-Wert ergab sich eine Wiederfindungsrate von 80,8 %. Die Wiederfindungsrate bei Zugabe zu einem Plasma mit hoher BNP-Konzentration lag bei 90,9 %. Der nierigste Standard war 1 pg/Röhrchen. Zur Bestimmung der Spezifität wurde eine serienweise Verdünnung von Hundeplasma mit der Standardkurve verglichen und zeigte einen parallelen Verlauf. Bei Lagerung bei -70 Grad zeigte sich eine gute Langzeitstabilität, auch nach 17 Monaten konnte keine Degradation von BNP beobachtet werden. Mittelwert, Median, Standardabweichung und Varianz der BNP-Werte wurden getrennt für Alter, Geschlecht, Kastration/Ovariohysterektomie, Größe und Rasse berechnet. Um einen möglichen Zusammenhang des BNP-Wertes mit Geschlecht, Kastration/Ovariohysterektomie, Größe und Rasse festzustellen, wurde eine Varianzanalyse durchgeführt. Mit einer einfachen Regressionsanalyse wurde auf einen Zusammenhang von Alter und BNP-Wert getestet. Es bestand kein Zusammenhang der BNP-Werte mit Alter, Geschlecht, Kastration/Ovariohysterektomie und Größe (p > 0,05). Die BNP-Konzentration war jedoch in signifikantem Maße (p < 0,017) von der Rasse abhängig. Parameterschätzungen wurden für jede Rasse erstellt. Ein Kolmogorov-Smirnov Test zeigte, dass die vorliegenden Daten normalverteilt waren. Referenzwerte für die gesamte Studienpopulation (oberer Referenzbereich: 53,69 pg/ml), Deutsche Schäferhunde (oberer Referenzbereich: 42,97 pg/ml), Golden Retriever (oberer Referenzbereich: 49,78 pg/ml) und Mischlinge (oberer Referenzbereich: 59,34 pg/ml) etabliert.

Zusammenfassung Einleitung Mikrosphären (MS) gelten als Standardmethode zur Messung des regionalen Blutflusses. Hierzu werden MS linksatrial injiziert. Sie verteilen sich dann im arteriellen Teil des Blutkreislaufes. Die Anzahl der in den präkapillären Gefäßen festgehaltenen MS ist direkt proportional der regionalen Organdurchblutung. Da die bisherige Markierung der MS mit instabilen Nukliden die Nachteile des Umgangs mit Radioaktivität mit sich brachte, hat man in den letzten Jahren versucht, die MS mit Fluoreszenzfarbstoffen (FM) zu beladen. Diese neue Art der Markierung erfordert allerdings, daß die FM quantitativ aus den Organproben zurückgewonnen werden müssen. Dies geschah bisher mittels Filtration oder Sedimentation. Beide Methoden bieten jedoch Nachteile. Ziel unserer Studie war es, eine neue Methode zu entwickeln und deren Verarbeitungsprozess zu automatisieren. Dazu wurde ein Filtrationsgefäß entwickelt, das die Probenverarbeitung (Gewichtsbestimmung, Verdauung, Filtration, Spülung und Farbstoffauslösung) in einem einzigen Gefäß zuläßt und hierbei die vollständige Rückgewinnung der FM aus der Organprobe sicherstellt. Material und Methodik: Die von uns am Institut für Chirurgische Forschung entwickelte Sample Processing Unit (SPU) – gebrauchsmustergeschützt - besteht aus drei Untereinheiten: Filterhalter, Filter und Probengefäß. Der essentielle Bestandteil der SPU ist der Filter, der mit einem Polyamid-Filtergewebe (Maschenöffnung 7µm) ausgestattet ist. Das von uns entwickelte Verarbeitungsprotokoll sieht folgende Schritte vor: Die Gewebeprobe wird in den Filter gelegt und das Probengewicht bestimmt. Der Filter wird dann in ein Edelstahlkochgefäß gestellt und zur Verdauung des Gewebes werden 15 ml Digestionsflüssigkeit (4N KOH mit 0,02% Tween) und 1,5 ml Isopropanol 100% hinzugegeben. Nach 6 Stunden Inkubation bei 60°C ist das organische Material vollständig aufgelöst und die FM schwimmen in der Zwischenschicht zwischen KOH und Isopropanol. Mit Hilfe von Unterdruck wird die Flüssigkeit durch das Filtergewebe filtriert. Dadurch kommen die FM auf der Membran zu liegen. Der später von den FM ausgelöste Fluoreszenzfarbstoff benötigt ein neutrales Umgebungsmilieu. Hierzu müssen alle KOH-Rückstände aus dem Filter entfernt werden. Dies geschieht mittels eines Phosphatpuffers (29.9g K2HPO4 in 800ml aqua dest. vermischt mit 5.88g KH2PO4 in 200ml aqua dest.), der auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist. Mit 15 ml dieses Puffers wird die gesamte Innenfläche des Filters abgespült. Durch kurzes Eintauchen des Filters in den Puffer wird auch die Außenfläche von den KOH-Resten befreit. Nach Trocknung des Filters durch Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff mit 2 ml eines organischen Lösungsmittels (2-Ethoxyethyl acetat - Cellosolve) aus den FM ausgelöst. Durch erneute Zentrifugation (4000 U/min für 4 min) wird der Farbstoff im Sammelgefäß aufgefangen und die Fluoreszenzintensität in einem Fluoreszenzspektrometer (LS50B, Perkin Elmer, Überlingen, Deutschland) bestimmt. Die Konzentration des Farbstoffes läßt auf die Anzahl der FM rückschließen, welche wiederum direkt proportional zum Blutfluß in der untersuchten Gewebeprobe ist. Der Proportionalitätsfaktor wird durch eine Blutreferenzprobe bestimmt, die während der Injektion der FM aus der Aorta thoracalis unter konstanter Pumpenzuggeschwindigkeit (Harvard Pump, Harvard Apparatus South Nattick, USA) entnommen wird. Diese Blutprobe kann ohne vorherige Verdauung unter Koagulationsschutz (CPDA mit dem Hauptbestandteil Citrat) direkt filtriert werden. Der Farbstoff wird mittels Cellosolve aus den Mikrosphären ausgelöst und die Fluoreszenzintesität bestimmt. Experimente Zunächst wurden die FM und die SPU in vitro Tests unterzogen. Bei den FM wurde mit Hilfe einer Verdünnungsreihe die Proportionalität zwischen der Anzahl der FM und der Fluoreszenzintensität untersucht. Die SPU und die dazugehörige Verarbeitungsmethode wurden einer Wiederfindungsstudie unterzogen. Dabei wurde dieselbe Anzahl von FM aller Farben in Filter und Glasröhrchen pipettiert. Die Filter durchliefen den gesamten Verarbeitungsprozeß. Das Filtrat und die Wände der Filter wurden auf die Präsenz von FM hin kontrolliert. Die Farbstofflösung, welche aus den 40 Filtern gewonnen wurde, wurde mit einer Referenzgruppe (Glasröhrchen ohne Probenverarbeitung, n=20) verglichen. Zur in vivo Validierung der SPU erfolgten an narkotisierten Schweinen (n=8) sechs simultane Injektionen von radioaktiv markierten 15µm MS (RM) (Niob, Strontium, Scandium, Indium, Cerium und Chrom) und 15µm FM (blue, bluegreen, yellowgreen, orange, red, scarlet) zu verschiedenen Zeitpunkten. Nach der Entnahme von Leber und Nieren, wurden diese Organe nach einem vorgegebenen Schema disseziert. Der regionale Blutfluß wurde anhand der Protokolle sowohl für RM (SCHOSSER et al. 1979) als auch FM bestimmt. Zunächst wurde die Radioaktivität der Proben im g-Counter (Canberra Packard, Frankfurt a.M., Deutschland) ermittelt. Hierauf wurde nach Verarbeitung der Organgewebe in der SPU die Fluoreszenzintensität mit Hilfe des Fluoreszenzspektrometers gemessen. Der Vergleich mittels beider Methoden erhobener Meßwerte wurde mit dem Bland-Altman-Plot durchgeführt. Hierbei wird das arithmetische Mittel der Blutflüsse, die durch FM- und RM-Methode berechnet worden sind, gegen die prozentuale Abweichung der FM von den RM aufgetragen. Zur Kontrolle der Filterfunktion und der Zuverläßigkeit der Meßergebnisse wurde die gleiche Anzahl (ca. 2500 FM) einer nicht im Experiment verwendeten 15 µm FM-Spezies (crimson), sowohl in SPU-Filter (SPU-Gruppe, n = 60), als auch in 20 Glasgefäße (Referenzgruppe, n = 20) gegeben. Die SPU wurden dem gesamten Protokoll der Probenverarbeitung unterzogen, wohingegen in der Referenzgruppe lediglich der Farbstoff ausgelöst und gemessen wurde. Die Gruppen wurden mittels t-test nach Student, p0,98). Die Filter weisen eine Wiederfindungsrate von 100% auf. Im Eluat fanden sich keine 15µm FM; zwischen der Filtergruppe und der Referenzgruppe besteht kein signifikanter Unterschied in der Fluoreszenzintensität. Es zeigt sich eine sehr gute Vergleichbarkeit beider Methoden. In den Bland-Altman Plots für die Nieren- und Leberproben wichen die Blutflußwerte mit der FM-Methode um 8,2 bis 13,4% vom mittleren Fluß (arithmetisches Mittel aus RM und FM) ab. Dabei betrug die mittlere Differenz beider Methoden zwischen -7,4% und 3,8%. Der Vergleich der mittleren Intensitäten der Kontrollfarbe crimson zwischen der Referenzgruppe (9,32±0,74, n=20) und der SPU- Gruppe (9,38±0,98, n=60) ergab keinen signifikanten Unterschied. Diskussion und Schlußfolgerung Mit der SPU ist es möglich, FM vollständig aus Organproben zurückzugewinnen und dadurch den regionalen Blutfluß quantitativ zu bestimmen. Die errechneten Blutflusswerte der radioaktiven und fluoreszierenden Methoden sind miteinander vergleichbar. Somit stellen die FM eine valide Alternative zu RM unter Vermeidung der Problematik des Umgangs mit Radioaktivität dar. Der entscheidende Vorteil der SPU ist, daß der gesamte Verarbeitungsprozeß im selben Gefäß stattfindet, und so der Verlust von FM nahezu ausgeschlossen ist.Das standardisierte Protokoll der Probenverarbeitung mittels SPU vermindert im Vergleich zu früheren Protokollen die Bearbeitungszeit von ca. 24h bzw. 48h auf ca. 6h und reduziert die Arbeitsschritte bei denen große Präzision gefordert ist. Das Design der SPU ermöglicht eine Automatisierung der Probenverarbeitung und somit eine Arbeitserleichterung, da die Von-Hand-Bearbeitung nur noch auf das Befüllen der SPU reduziert wird